酶法生产dl-酪氨酸的方法及广谱型氨基酸消旋酶、应用
阅读说明：本技术 酶法生产dl-酪氨酸的方法及广谱型氨基酸消旋酶、应用 (Method for producing DL-tyrosine by enzyme method, broad-spectrum amino acid racemase and application ) 是由 李晚军 曾帅 刘鹏 张瑞 于 2021-03-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了酶法生产DL-酪氨酸的方法及广谱型氨基酸消旋酶、应用,酶法生产DL-酪氨酸的方法,包括以下步骤：S1、构建重组表达载体pET32a-PH0138,转化到大肠杆菌BL21(DE3)/pG-KJE8中,获得重组工程菌BBAR；S2、发酵表达BAR酶的重组工程菌BBAR获得湿菌体；S3、将湿菌体混悬后进行破碎处理,破碎液为含有广谱型氨基酸消旋酶的粗酶液；S4、向步骤S3获得的粗酶液中添加L-酪氨酸和PLP,搅拌转化,直至比旋光度为0°时终止反应,获得DL-酪氨酸水溶液。该方法具有原料价格低廉、转化率高,后处理简便的优势,产品质量高,适合工业化大生产。(The invention discloses a method for producing DL-tyrosine by an enzyme method, a broad-spectrum amino acid racemase and application, wherein the method for producing DL-tyrosine by the enzyme method comprises the following steps: s1, constructing a recombinant expression vector pET32a-PH0138, and transforming the recombinant expression vector into escherichia coli BL21(DE3)/pG-KJE8 to obtain a recombinant engineering bacterium BBAR; s2, fermenting and expressing a recombinant engineering bacterium BBAR of the BAR enzyme to obtain wet thalli; s3, suspending the wet thalli and then crushing, wherein the crushed liquid is crude enzyme liquid containing broad-spectrum amino acid racemase; s4, adding L-tyrosine and PLP into the crude enzyme solution obtained in the step S3, stirring and converting until the specific rotation is 0 degrees, terminating the reaction and obtaining DL-tyrosine aqueous solution. The method has the advantages of low raw material price, high conversion rate, simple and convenient post-treatment and high product quality, and is suitable for industrial mass production.)
技术领域
本发明涉及酶催化技术领域，具体涉及酶法生产DL-酪氨酸的方法及广谱型氨基酸消旋酶、应用。
背景技术
DL-酪氨酸(DL-Tyrosine，DL-Tyr)是L-酪氨酸的消旋体，在医药和化工领域有着相当广泛的应用。近年来，随着药物的深入开发研究，DL-酪氨酸被用于药物合成原料，如肝病和心脏病的治疗药物，氨基酸输液和医学临床研究。另外DL-酪氨酸作为制备合成D-酪氨酸的原料，而D-酪氨酸是一种非蛋白源手性氨基酸，在手性药物合成中具有非常广泛的应用。例如，以D-酪氨酸为手性中间体合成的阿托西班是重要的保胎药，合成的脱乙酰茴香霉素具有抗原虫、抗变形虫、抗真菌、抗肿瘤和防止植物真菌等作用；合成的多肽药物用于恶性肿瘤的治疗；还可用于合成对肺部、中枢神经系统、关节、心内膜、眼、耳、皮肤、肠胃和泌尿系统具有极好疗效的消炎药等。
目前，DL-酪氨酸的制备主要是通过化学法合成的，文献报道涉及L-酪氨酸化学法消旋的方法有方百盈等在常压回流条件下碱性水溶液中对L-酪氨酸进行消旋，消旋率达58％；王家荣等研究发现在乙酸酐的作用下，分别在碱性水溶液和纯乙酸溶剂中现对L-酪氨酸100％消旋，收率90％。DL-酪氨酸的化学消旋制备过程中使用乙酸和乙酸酐，为微毒性溶剂，其蒸气可与空气形成爆炸性混合物，遇明火、高能热能引起燃烧爆炸，存在较大的安全隐患。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶法生产DL-酪氨酸的方法，该方法具有原料价格低廉、转化率高，后处理简便的优势，产品质量高，适合工业化大生产。
此外，本发明还提供基于上述方法获得的广谱型氨基酸消旋酶及其应用。
本发明通过下述技术方案实现：
一种酶法生产DL-酪氨酸的方法，包括以下步骤：
S1、构建重组表达载体pET32a-PH0138，转化到大肠杆菌BL21(DE3)/pG-KJE8中，获得重组工程菌BBAR；
S2、发酵表达BAR酶的重组工程菌BBAR获得湿菌体；
S3、将湿菌体混悬后进行破碎处理，破碎液为含有广谱型氨基酸消旋酶的粗酶液；
S4、向步骤S3获得的粗酶液中添加L-酪氨酸和PLP，搅拌转化，直至比旋光度为0°时终止反应，获得DL-酪氨酸水溶液。
本发明所述方法与现有技术相比，不使用乙酸和乙酸酐等有毒性溶剂，安全性好，且原料价格低廉，转化率高，为DL-酪氨酸提供了良好的工业化生产方法
进一步地，步骤S1中，重组工程菌BBAR的具体构建过程如下：
S11、基于Pyrococcus horikoshii OT3编码的广谱型氨基酸消旋酶的基因序列，进行密码子优化获得PH0138基因，如SEQ ID NO.1所示，克隆构建pUC57-PH0138载体，插入片段PH0138两端携带NdeI和XhoI酶切位点；
S12、分别用Nde I和Xho I双酶切pUC57-PH0138载体和pET-32a(+)质粒，获得目的基因片段和载体骨架，将目的基因片段和载体骨架按一定比例连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，构建得到pET32a-PH0138重组表达载体；
S13、将pET32a-PH0138表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)/pG-KJE8感受态细胞，涂布氨苄氯霉素双抗平板，筛选获得重组工程菌BBAR。
进一步地，步骤S2中，发酵表达过程如下：
在无菌环境下移种重组工程菌BBAR于一级培养基中，37℃、220rpm培养7h，OD600达到3～4后转接到二级培养基中，37℃、220rpm培养4～5h，再接入发酵罐中进行发酵培养，在发酵培养过程中，pH和溶氧上升时，补充补料培养基，菌浓度OD600达到20～25时，添加四环素，终浓度1mg/L，继续培养至菌浓度OD600为30时开始降温至30℃，加入IPTG诱导培养后放罐，离心获得湿菌体。
进一步地，一级培养基采用LB培养基；二级培养基采用TB培养基。
进一步地，发酵培养采用发酵培养基，发酵培养基的配方如下：
酵母浸膏5.6g/L，蛋白胨12g/L，甘油10g/L，三水合磷酸氢二钾4g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，七水合硫酸镁0.49g/L，柠檬酸2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L。
进一步地，补料培养基的配方如下：
酵母浸粉70g/L，蛋白胨30g/L，甘油400g/L。
进一步地，步骤S3中，湿菌体混悬时加入磷酸钾缓冲液，破碎处理用超声波粉碎机或者高压匀浆机进行破胞处理。
进一步地，还包括对DL-酪氨酸水溶液的后处理：
转化结束后，向转化液中添加盐酸溶液，待DL-酪氨酸完全溶解后，保温一段时间，过滤收集清液，缓慢调节pH至5.68，析出大量DL-酪氨酸，依次经过抽滤、洗涤和烘干得到DL-酪氨酸成品。
酶法生产DL-酪氨酸的方法所制备的广谱型氨基酸消旋酶。
广谱型氨基酸消旋酶在生产DL-酪氨酸上的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明不使用乙酸和乙酸酐等有毒性溶剂，安全性好。
2、本发明的转化率高、原料价格低廉，反应条件温和，适用于工业化生产。
3、本发明首次采用酶催化合成DL-酪氨酸的工程菌进行DL-酪氨酸的酶法制备，来替代传统的化学合成法，为DL-酪氨酸的制备开辟了新的思路。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为重组质粒pET32a-PH0138双酶切图；
图2为pET32a-PH0138质粒图谱；
图3为BAR蛋白SDS-PAGE电泳检测图；
图4为L-酪氨酸比旋光度测定结果图；
图5为DL-酪氨酸HPLC检测对比图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
一种酶法生产DL-酪氨酸的方法，包括以下步骤：
S1、构建重组表达载体pET32a-PH0138，转化到大肠杆菌BL21(DE3)/pG-KJE8中，获得重组工程菌BBAR；
S11、根据GenBank报道来源于Pyrococcus horikoshii OT3的编码广谱型氨基酸消旋酶(BAR)的基因序列，对其基因序列进行密码子优化以适合在大肠杆菌菌株中外源表达，合成优化序列的PH0138基因(SEQ ID NO.1)，克隆构建pUC57-PH0138载体，两端携带NdeI和XhoI酶切位点；
S12、分别用Nde I和Xho I双酶切pUC57-PH0138载体和pET-32a(+)质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因片段和载体骨架，按照载体骨架：目的基因＝1:9进行连接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在氨苄抗性平板上筛选转化子，随机挑取单菌落进行菌落PCR验证，之后抽提质粒进行双酶切验证，结果如图1所示(图1中，M：DNA marker；1：pET32a质粒；2：重组质粒pET32a-PH0138；3:重组质粒pET32a-PH0138用Nde I/Xho I.双酶切)，得到重组表达质粒pET32a-PH0138，最后进行测序验证，获得目的基因序列完全正确的重组子，成功构建表达载体：pET32a-PH0138，如图2所示；
S13、将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)/pG-KJE8感受态细胞，涂布氨苄氯霉素双抗平板，倒置过夜培养，挑单菌落于LB试管中培养7小时，转接TB培养基中，添加四环素和IPTG，诱导培养20小时，通过SDS-PAGE检测蛋白表达量，结果如图3所示(图3中，M为蛋白Marker；1为总蛋白样；2为上清蛋白样)，BAR蛋白可溶表达，即获得工程菌pET32a-PH0318/BL21(DE3)，即重组工程菌BBAR，简称BBAR菌；
S2、发酵表达BAR酶的重组工程菌BBAR获得湿菌体；
在无菌环境下移种重组工程菌BBAR于一级培养基中，37℃、220rpm培养7h，OD600达到3～4后转接到二级培养基中，37℃、220rpm培养4～5h，按照3.2％的接种量接入50L发酵罐中37℃培养，pH和溶氧上升时开启补料，菌浓度OD600达到20～25时，添加四环素，终浓度1mg/L，继续培养至菌浓度OD600为30时开始降温至30℃，加入0.2mM的IPTG诱导培养后放罐，离心获得湿菌体；
发酵培养基的配方如下：
酵母浸膏5.6g/L，蛋白胨12g/L，甘油10g/L，三水合磷酸氢二钾4g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，七水合硫酸镁0.49g/L，柠檬酸2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L；
补料培养基的配方如下：
酵母浸粉70g/L，蛋白胨30g/L，甘油400g/L；
S3、在500L转化罐中进行300L体系转化。湿菌体添加量10g/L，称量3Kg湿菌体，用30L0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)，重悬菌体，用超声波粉碎机或者高压匀浆机进行破胞处理后获得BAR粗酶液，备用；
S4、向500L转化罐中投加L-酪氨酸15Kg，磷酸二氢钾1.5Kg，三水磷酸氢二钾4.2Kg，加适量水，开启搅拌，使L-酪氨酸于水相中均匀分布，投加BAR粗酶液，再加入7.8gPLP，用水补体积至300L，调节pH至7.0，升温至80℃开始搅拌转化，转化过程取样检测产品比旋光，直至比旋光度为0°时终止反应，如图4所示，本实施例的反应时间为3h，获得DL-酪氨酸水溶液。
对实施例1获得的DL-酪氨酸水溶液进行分离检测：
转化结束后，向转化液中添加4mol/L盐酸溶液，待DL-酪氨酸完全溶解后，继续80℃保温30min。过板框压滤，收集清液，再用4mol/L NaOH缓慢调节pH至5.68，析出大量DL-酪氨酸，抽滤，用纯水洗涤过滤烘干后得到DL-酪氨酸12.5Kg，产品比旋光为0°，HPLC检测产品纯度为99.8％，转化率100％，收率83％。
实施例2：
本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于：步骤S3-S4所涉及生物转化不同，具体地：
S3、在1000L转化罐中进行600L体系转化。湿菌体添加量5g/L，称量3Kg湿菌体，用30L0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)，重悬菌体，用超声波粉碎机或者高压匀浆机进行破胞处理后获得BAR粗酶液，备用；
S4、向1000L转化罐中投加L-酪氨酸30Kg，磷酸二氢钾3Kg，三水磷酸氢二钾8.4Kg，加适量水，开启搅拌，使L-酪氨酸于水相中均匀分布，投加BAR粗酶液，再加入15.6g PLP，用水补体积至600L，升温至80℃开始搅拌转化，转化过程取样检测产品比旋光，调节pH为7.0，80℃搅拌转化，直至比旋光度为0°时终止反应，本实施例的反应时间为5h，获得DL-酪氨酸水溶液。
对实施例2获得的DL-酪氨酸水溶液进行分离检测：
转化结束后，向转化液中添加4mol/L盐酸溶液，待DL-酪氨酸完全溶解后，继续80℃保温30min。过板框压滤，收集清液，再用4mol/L NaOH缓慢调节pH至5.68，析出大量DL-酪氨酸，抽滤，用纯水洗涤过滤烘干后得到DL-酪氨酸25.2Kg，产品比旋光为0°，HPLC检测产品纯度为99.9％，转化率100％，收率84％。
实施例3：
本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于：步骤S3-S4所涉及生物转化不同，具体地：
S3、在5000L转化罐中进行3000L体系转化。湿菌体添加量1g/L，称量3Kg湿菌体，用30L0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)，重悬菌体，用超声波粉碎机或者高压匀浆机进行破胞处理后获得BAR粗酶液，备用；
S4、向5000L转化罐中投加L-酪氨酸150Kg，磷酸二氢钾15Kg，三水磷酸氢二钾42Kg，加适量水，开启搅拌，使L-酪氨酸于水相中均匀分布，投加BAR粗酶液，再加入78gPLP，用水补体积至3000L，升温至80℃开始搅拌转化，转化过程取样检测产品比旋光，调节pH为7.0，80℃搅拌转化，直至比旋光度为0°时终止反应，本实施例的反应时间为10h，获得DL-酪氨酸水溶液。
对实施例3获得的DL-酪氨酸水溶液进行分离检测：
转化结束后，向转化液中添加4mol/L盐酸溶液，待DL-酪氨酸完全溶解后，继续80℃保温30min。过板框压滤，收集清液，再用4mol/L NaOH缓慢调节pH至5.68，析出大量DL-酪氨酸，抽滤，用纯水洗涤过滤烘干后得到DL-酪氨酸129Kg，产品比旋光为0°，HPLC检测产品纯度为99.9％，转化率100％，收率86％。
HPLC法检测DL-酪氨酸
(1)FMOC-CL溶液的制备：准确称取52mgFMOC到20mL容量瓶中，用乙腈混合到刻度。
(2)硼酸盐缓冲液：准备0.01mol/L的四硼酸钠水合物缓冲液到水中，用稀释的氢氧化钠调节pH值至10.2。
(3)衍生化反应条件：称取样品0.005g于50mL容量瓶，加入20mL硼酸盐缓冲液，加入20mL FMOC-CL溶液，超声10min，静止5min；并用FMOC-CL溶液稀释至刻度，摇匀，并静止5min。
(4)溶液配制：精密移取上述衍生化后的储备溶液2mL，加入50μL冰乙酸，精密加入2mL乙酸乙酯，萃取并静止取上层。同时做空白实验及标品L-Tyr、DL-Tyr作为对照。
(5)色谱条件：色谱柱大赛璐AD-H.250mm*4.6mm*5um；流动相：正己烷：异丙醇：TFA＝80:20:0.05％；等度洗脱35min；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；进样量：20uL；柱温：20℃。
HPLC检结果如图5所示：
在图5中，(a)空白样；(b)L-酪氨酸标准品；(c)DL-酪氨酸标准品；(d)实施例1制备的DL-酪氨酸样品。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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