一种提高l-色氨酸发酵产率的方法
阅读说明：本技术 一种提高l-色氨酸发酵产率的方法 (Method for improving fermentation yield of L-tryptophan ) 是由 周旭波 王健 方培新 王华萱 于 2020-12-28 设计创作，主要内容包括：一种提高L-色氨酸发酵产率的方法,在发酵的起始或/和中间阶段,往发酵培养基中加入发酵辅助因子；以发酵培养基的总体积计,每升所述发酵培养基添加的发酵辅助因子包括：0.1×10～(-4)～10×10～(-4)g/L的硫胺素、0.1×10～(-5)～5×10～(-5)g/L的核黄素、0.1×10～(-3)～10×10～(-3)g/L的烟酸、0.1×10～(-5)～2×10～(-5)g/L的磷酸氨基嘌呤、0.1×10～(-3)～10×10～(-3)g/L的泛酸、0.1×10～(-5)～2×10～(-5)g/L的吡哆素、0.1×10～(-4)～10×10～(-4)g/L的生物素、0.1×10～(-6)～10×10～(-6)g/L的叶酸、0.1×10～(-5)～10×10～(-5)g/L的钴胺素和0.1×10～(-5)～10×10～-～5g/L乳清酸。本发明在不增加额外设备和人力投入的情况下,实现了L-色氨酸发酵生产周期的缩短以及产率和转化率的大幅提高,方法简单易行,适合于工业化生产。(A method for improving fermentation yield of L-tryptophan comprises adding fermentation auxiliary factors into fermentation medium at the initial stage or/and middle stage of fermentation; the fermentation auxiliary factors added in each liter of the fermentation medium comprise the following components in percentage by volume of the total fermentation medium: 0.1X 10 ‑4 ～10×10 ‑4 Thiamine in g/L, 0.1X 10 ‑5 ～5×10 ‑5 Riboflavin in g/L, 0.1X 10 ‑3 ～10×10 ‑3 Nicotinic acid, 0.1X 10 in g/L ‑5 ～2×10 ‑5 g/L phosphoaminopurine, 0.1X 10 ‑3 ～10×10 ‑3 g/L pantothenic acid, 0.1X 10 ‑5 ～2×10 ‑5 Pyridoxine, 0.1X 10 in g/L ‑4 ～10×10 ‑4 Biotin of 0.1X 10 in g/L ‑6 ～10×10 ‑6 Folic acid, 0.1X 10 in g/L ‑5 ～10×10 ‑5 g/L of cobalamin and 0.1X 10 ‑5 ～10×10 ‑ 5 g/L orotic acid. The method realizes the shortening of the fermentation production period of the L-tryptophan and the great improvement of the yield and the conversion rate under the condition of not increasing additional equipment and manpower input, is simple and feasible, and is suitable for industrial production.)
技术领域
本发明属于发酵法生产氨基酸技术领域，涉及一种提高L-色氨酸发酵产率的方法。
背景技术
L-色氨酸学名β-吲哚基丙氨酸，化学名L-2-氨基-3-吲哚基丙酸，是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，以游离态或结合态存在于生物体中，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着非常重要的作用，被称为第二必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等诸多方面。
L-色氨酸的生产方法主要有微生物转化法、酶法和直接发酵法。目前，世界上主要的色氨酸生产厂家主要以微生物直接发酵法生产色氨酸为主，直接发酵法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的色氨酸生产菌种来生产色氨酸。但是，目前以微生物发酵法生产L-色氨酸，大多数发酵生产技术的产酸水平较低、成本较高，生产水平和产量远不能满足市场的需求。因此，开展提高色氨酸发酵技术水平的研究具有极其重要的意义。
近年来，随着原材料价格的不断上涨和市场竞争的愈加激烈，为了提高色氨酸产率并降低生产成本，有大量关于色氨酸发酵方面的研究报道，主要通过传统诱变和基因工程的方法选育和筛选色氨酸合成的突变菌株，以提高L-色氨酸的产量。这些方法往往针对单一基因进行改造或提高某一反应酶的活性，对提高L-色氨酸的发酵水平和应用于实际生产还有较大的差距。近年来也有少量研究表明，在发酵培养基中单一的添加适量的氨基酸、有机酸和维生素等对L-色氨酸发酵有一定的促进作用，但这些研究只停留在实验单一因素的添加上，对提高色氨酸发酵水平的影响也极其有限，并且这些研究的L-色氨酸的发酵都处于较低水平，对实现工业化生产还有较大差距。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高L-色氨酸发酵产率的方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种提高L-色氨酸发酵产率的方法，在发酵的起始或/和中间阶段，往发酵培养基中加入发酵辅助因子；以发酵培养基的总体积计，每升所述发酵培养基添加的发酵辅助因子包括：0.1×10-4～10×10-4g/L的硫胺素、0.1×10-5～5×10-5g/L的核黄素、0.1×10-3～10×10-3g/L的烟酸、0.1×10-5～2×10-5g/L的磷酸氨基嘌呤、0.1×10-3～10×10-3g/L的泛酸、0.1×10-5～2×10-5g/L的吡哆素、0.1×10-4～10×10-4g/L的生物素、0.1×10-6～10×10-6g/L的叶酸、0.1×10-5～10×10-5g/L的钴胺素和0.1×10-5～10×10-5g/L乳清酸。
优选的技术方案为：每升所述发酵培养基包括：5.0～80.0g的葡萄糖、2.0～10.0g的酵母浸粉、0.1～10.0g的多肽粉、1.0～30.0g的(NH4)2S04、0.5～20g的KH2P04、0 0.1～5g的K2HP04·3H2和0.1～5.0g的MgS04·7H20；初始pH值为7.0～7.2。
优选的技术方案为：每升所述发酵培养基添加的发酵辅助因子包括：0.5×10-4～5×10-4g/L硫胺素、0.5×10-5～5×10-5g/L核黄素、0.5×10-3～5×10-3g/L烟酸、0.5×10-5～2×10-5g/L磷酸氨基嘌呤、0.5×10-3～5×10-3g/L泛酸、0.5×10-5～2×10-5g/L吡哆素、0.5×10-4～5×10-4g/L生物素、0.5×10-6～5×10-6g/L叶酸、0.5×10-5～5×10-5g/L钴胺素、0.5×10-5～5×10-5g/L乳清酸。
优选的技术方案为：每升所述发酵培养基添加的发酵辅助因子包括：1×10-4～5×10-4g/L硫胺素、0.5×10-5～2×10-5g/L核黄素、3×10-3～5×10-3g/L烟酸、0.5×10-5～1×10-5g/L磷酸氨基嘌呤、1×10-3～5×10-3g/L泛酸、1×10-5～2×10-5g/L吡哆素、0.5×10-4～2×10-4g/L生物素、2×10-6～5×10-6g/L叶酸、2×10-5～5×10-5g/L钴胺素、2×10-5～5×10-5g/L乳清酸。
优选的技术方案为：在发酵开始至6～36h时，分次流加或连续流加所述发酵辅助因子。
优选的技术方案为：L-色氨酸发酵使用的菌种为为大肠杆菌。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明采用辅因子代谢调控策略和代谢流量分析方法，定量研究了硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸等发酵辅助因子对L-色氨酸生产菌代谢流量分布变化的影响以及其在色氨酸代谢系统中的协同作用，系统性地在L-色氨酸发酵至6～36小时流加特定配比的硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸，来提高色氨酸生产菌L-色氨酸发酵过程的产率。此方法在不增加额外设备和人力投入的情况下，实现了L-色氨酸发酵生产周期的缩短以及产率和转化率的大幅提高，方法简单易行，适合于工业化生产。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
对比例：
试验编号一：发酵培养基：葡萄糖42.5g/L，酵母浸粉6g/L，多肽粉5.05g/L，(NH4)2S04 15g/L，KH2P04 10.25g/L，K2HP04·3H20 2.55g/L，MgS04·7H20 2.55g/L，初始pH7.1。
试验编号二：葡萄糖80.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，多肽粉0.1g/L，(NH4)2S04 1.0g/L，KH2P04 20g/L，K2HP04·3H25 g/L，MgS04·7H20 0.1g/L，初始pH7.0。
试验编号三：葡萄糖5.0g/L，酵母浸粉2.0g/L，多肽粉10.0g/L，(NH4)2S04 30.0g/L，KH2P04 0.5g/L，K2HP04·3H20 0.1g/L，MgS04·7H25.0 g/L，初始pH7.2。
将对数期的大肠杆菌菌液按10％的接种量接入含有发酵培养基的30L自动控制发酵罐中，初始定容12L，温度控制在37℃，通入适当空气，调节搅拌转速，控制溶氧在20％～50％，通过自动流加氨水控制pH在7.0～7.2，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为600g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在0.1％。发酵至48h停止，放罐时，L-色氨酸的产酸和糖酸转化率见表1。
试验编号
L-色氨酸产酸
糖酸转化率
一
36.87g/L
16.13％
二
37.26g/L
15.88％
三
37.51g/L
16.09％
平均
37.21g/L
16.03％
实施例1：一种提高L-色氨酸发酵产率的方法
发酵培养基为：发酵培养基：葡萄糖42.5g/L，酵母浸粉6g/L，多肽粉5.05g/L，(NH4)2S04 15g/L，KH2P04 10.25g/L，K2HP04·3H20 2.55g/L，MgS04·7H20 2.55g/L，初始pH7.1；在发酵培养基中分别添加以下任一组发酵辅助因子，进行实验。辅助因子在发酵的起始阶段添加。
辅助因子1：0.1×10-4g/L硫胺素、0.1×10-5g/L核黄素、0.1×10-3g/L烟酸、0.1×10-5g/L磷酸氨基嘌呤、0.1×10-3g/L泛酸、0.1×10-5g/L吡哆素、0.1×10-4g/L生物素、0.1×10-6g/L叶酸、0.1×10-5g/L钴胺素、0.1×10-5g/L乳清酸。
辅助因子2：0.5×10-4g/L硫胺素、0.5×10-5g/L核黄素、0.5×10-3g/L烟酸、0.5×10-5g/L磷酸氨基嘌呤、0.5×10-3泛酸、0.5×10-5g/L吡哆素、0.5×10-4g/L生物素、0.5×10-6g/L叶酸、0.5×10-5g/L钴胺素、0.5×10-5g/L乳清酸。
辅助因子3：1×10-4g/L硫胺素、2×10-5g/L核黄素、3×10-3g/L烟酸、1×10-5g/L磷酸氨基嘌呤、1×10-3g/L泛酸、1×10-5g/L吡哆素、2×10-4g/L生物素、2×10-6g/L叶酸、2×10-5g/L钴胺素、2×10-5g/L乳清酸。
将对数期的大肠杆菌菌液按10％的接种量接入含有发酵培养基的30L自动控制发酵罐中，初始定容12L，温度控制在37℃，通入适当空气，调节适当搅拌转速，控制溶氧在20％～50％，通过自动流加氨水控制pH在7.0～7.2，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为600g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在0.1％，发酵至48h停止。放罐时，L-色氨酸的产量和糖酸转化率见表2，表中的提高率是以对比例为基准进行计算的。
组别
L-色氨酸的产量
提高率
辅助因子1
41.16g/L
10.62％
辅助因子2
42.47g/L
14.14％
辅助因子3
44.13g/L
18.60％
实施例2：一种提高L-色氨酸发酵产率的方法
发酵培养基：葡萄糖54g/L，酵母浸粉6.5g/L，多肽粉5.6g/L，(NH4)2S04 23g/L，KH2P04 11g/L，K2HP04·3H20 4.3g/L，MgS04·7H24.3 g/L，初始pH7.1。
将对数期的大肠杆菌菌液按10％的接种量接入含有发酵培养基的30L自动控制发酵罐中，初始定容12L，温度控制在37℃，通入适当空气，调节搅拌转速，控制溶氧在20％～50％，通过自动流加氨水控制pH在7.0～7.2，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为600g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在0.1％。发酵至6h时开始流加发酵辅助因子，发酵至36h时停止流加。各辅助因子的流加速度采用以下几种方案：
发酵辅助因子的添加量：以发酵培养基的总体积计，每升发酵培养基添加：5×10- 4g/L的硫胺素、3×10-5g/L的核黄素、5×10-3g/L的烟酸、1×10-5g/L的磷酸氨基嘌呤、5×10-3g/L的泛酸、1×10-5g/L的吡哆素、5×10-4g/L的生物素、5×10-6g/L的叶酸、5×10-5g/L的钴胺素和5×10-5g/L乳清酸。连续流加所述发酵辅助因子，速度为：
方案1：硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸，流加速度分别为4.0μg/h、0.4μg/h、40.0μg/h、0.4μg/h、40.0μg/h、0.4μg/h、4.0μg/h、0.04μg/h、0.4μg/h、0.4μg/h。
方案2：硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸，流加速度分别为20.0μg/h、2.0μg/h、200.0μg/h、2.0μg/h、200.0μg/h、2.0μg/h、20.0μg/h、0.2μg/h、2.0μg/h、2.0μg/h。
方案3：硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸，流加速度分别为40.0μg/h、8.0μg/h、1200.0μg/h、4.0μg/h、400.0μg/h、4.0μg/h、80.0μg/h、0.8μg/h、8.0μg/h、8.0μg/h。
发酵辅助因子从发酵6h开始，发酵至48h停止，放罐时，L-色氨酸的产量和糖酸转化率见表3，表中的提高率是以对比例为基准进行计算的。
组别
L-色氨酸的产量
提高率(％)
糖酸转化率
提高率(％)
流加速度1
41.51g/L
11.56％
16.83％
4.99％
流加速度2
43.32g/L
16.42％
17.21％
7.36％
流加速度3
45.18g/L
21.42％
17.59％
9.73％
实施例3：一种提高L-色氨酸发酵产率的方法
发酵培养基：葡萄糖80.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，多肽粉10.0g/L，(NH4)2S0430.0g/L，KH2P04 20g/L，K2HP04·3H20 5g/L，MgS04·7H20 5.0g/L，初始pH 7.2。
将对数期的大肠杆菌菌液按10％的接种量接入含有发酵培养基的30L自动控制发酵罐中，初始定容12L，温度控制在37℃，通入适当空气，调节搅拌转速，控制溶氧在20％～50％，通过自动流加氨水控制pH在7.0～7.2，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为600g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在0.1％。在发酵过程中，通过以下方式之一流加发酵辅助因子。
硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸，流加速度分别为4.0μg/h、0.4μg/h、40.0μg/h、0.4μg/h、40.0μg/h、0.4μg/h、4.0μg/h、0.04μg/h、0.4μg/h、0.4μg/h。
流加方式1：在发酵至6～12h第一次流加硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸，流加量分别为48μg、4.8μg、480μg、4.8μg、480μg、4.8μg、48μg、0.48μg、4.8μg、4.8μg；发酵至18～24h流加硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸，分别为48μg、4.8μg、480μg、4.8μg、480μg、4.8μg、48μg、0.48μg、4.8μg、4.8μg；发酵至30～36h流加硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸，分别为24μg、2.4μg、240μg、2.4μg、240μg、2.4μg、24μg、0.24μg、2.4μg、2.4μg。
流加方式2：在发酵至6～12h第一次流加硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸，流加量分别为240μg、24μg、2400μg、24μg、2400μg、24μg、240μg、2.4μg、24μg、24μg；发酵至18～24h流加硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸，分别为240μg、24μg、2400μg、24μg、2400μg、24μg、240μg、2.4μg、24μg、24μg；发酵至30～36h流加硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸，分别为120μg、12μg、1200μg、12μg、1200μg、12μg、120μg、1.2μg、12μg、12μg。
方案3：硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸，流加速度分别为40.0μg/h、8.0μg/h、1200.0μg/h、4.0μg/h、400.0μg/h、4.0μg/h、80.0μg/h、0.8μg/h、8.0μg/h、8.0μg/h。
流加方式3：在发酵至6～12h第一次流加硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸，流加量分别为480μg、96μg、14400μg、48μg、4800μg、48μg、960μg、9.6μg、96μg、96μg；发酵至18～24h流加硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸，分别为480μg、96μg、14400μg、48μg、4800μg、48μg、960μg、9.6μg、96μg、96μg；发酵至30～36h流加硫胺素、核黄素、烟酸、磷酸氨基嘌呤、泛酸、吡哆素、生物素、叶酸、钴胺素、乳清酸，分别为240μg、48μg、7200μg、24μg、2400μg、24μg、480μg、4.8μg、48μg、48μg。
发酵至48h停止，放罐时，L-色氨酸的产量和糖酸转化率见表4，表中的提高率是以对比例为基准进行计算的。
组别
L-色氨酸的产量
提高率(％)
糖酸转化率
提高率(％)
流加方式1
41.21g/L
10.75％
16.74％
4.43％
流加方式2
43.39g/L
16.61％
17.22％
7.42％
流加方式3
45.14g/L
21.31％
17.48％
9.05％
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。