一种生产和提取色氨酸的工艺
阅读说明：本技术 一种生产和提取色氨酸的工艺 (Process for producing and extracting tryptophan ) 是由 张宗华 边恩来 赵仁楷 王飞 韩富江 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,公开了一种生产和提取色氨酸的工艺,其包括发酵工序和提取工序。本发明对生产工艺进行了进一步改进,在提高色氨酸产量的同时,保证了流加效果；采用膜技术进行改进色氨酸发酵液传统提取工艺,通过脱色膜去除发酵液中的菌体蛋白,澄清发酵液；通过脱色膜分级去除大分子蛋白和色素,最后采用浓缩膜在常温无相变下进行浓缩。(The invention belongs to the technical field of biology, and discloses a process for producing and extracting tryptophan, which comprises a fermentation process and an extraction process. The invention further improves the production process, improves the yield of tryptophan and ensures the fed-batch effect; the traditional extraction process of the tryptophan fermentation liquor is improved by adopting a membrane technology, mycoprotein in the fermentation liquor is removed by a decolorizing membrane, and the fermentation liquor is clarified; macromolecular protein and pigment are removed by a decoloration membrane in a grading way, and finally, a concentration membrane is adopted to carry out concentration at normal temperature without phase change.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产和提取色氨酸的工艺。
背景技术
L-色氨酸的分子式为C11H12O2N2，分子量为204.21，含氮13.72％。L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，呈绢丝光泽、六角片状自色晶体，无臭，有甜味。在水中溶解度1.14g/L(25℃)，溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解，微溶于乙醇，不溶于氯仿、***。
L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸，广泛应用于饲料行业中。
色氨酸的生产方法先后经历了蛋白质水解法、化学合成法和微生物法三种方法，其中微生物法又包括直接发酵法、微生物转化法和酶法。目前，色氨酸发酵企业大多采用分批补料发酵方式。这种方式对发酵液中残留葡萄糖浓度控制和补入糖(包括葡萄糖和液糖)的分散程度要求较高。残留葡萄糖浓度若要控制的不当，就会影响到菌体的正常代谢，使菌体的代谢途径发生变化，严重影响色氨酸的发酵水平和产量，甚至会导致无色氨酸产生。所以，培养基中营养物质对菌体的生长和代谢产物的产生起着决定作用。
色氨酸的传统提取工艺复杂，其工艺流程为：发酵液，板框过滤，真空浓缩，粗结晶，离心，粗品，活性炭脱色，再结晶，离心，干燥，包装粉碎。在这个过程中，板框过滤需加硅藻土填料，脱色率为 80％，滤渣的回收价值低二次结晶的母液浑浊，难回收真空浓缩容易局部温度过高而破坏有效成份以及增加产品色素，能耗高。
由于上述几个方面，导致色氨酸提取工艺的整体收率在 75％以下，提取工艺成本高，其工艺急需加以改进。
发明内容
为解决上述问题，克服现有技术的不足之处，本发明对生产工艺进行了进一步改进，在提高色氨酸产量的同时，保证了流加效果。
采用膜技术进行改进色氨酸发酵液传统提取工艺，通过脱色膜去除发酵液中的菌体蛋白，澄清发酵液；通过脱色膜分级去除大分子蛋白和色素，最后采用浓缩膜在常温无相变下进行浓缩。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
一种生产和提取色氨酸的工艺，其包括发酵工序和提取工序；
所述发酵工序包括如下步骤：将产L-色氨酸的大肠杆菌工程菌种子液以1%-10%接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵培养40h，得到发酵液；
所述提取工序包括如下步骤：发酵液进行灭菌，经陶瓷膜过滤得到滤液；将滤液泵入色谱系统，进行L-色氨酸和其他杂质的分离；然后通过脱色膜，过滤除去色素和蛋白，收集脱色液；将所得脱色液进行反渗透膜脱水浓缩，得到L-色氨酸洗脱液，将其打入四效蒸发器，真空浓缩为原体积的四分之一，所得浓缩液进行冷却结晶，离心、烘干得到L-色氨酸产品。
进一步地，所述发酵培养的参数为：转速300-500rpm，温度35-37℃，罐压0.05-0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5-6.8，流加浓度为400-500g/l葡萄糖溶液控制残糖浓度为1-1.5g/L，溶氧量：在0-12h控制在25-30%，在13-40h控制在15-20%。
进一步地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L、大豆蛋白胨5g/L、磷酸氢二钾9g/L、柠檬酸3.5g/L、硫酸铵3.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁20mg/L、一水硫酸锰10mg/L、生物素0.1mg/L。
进一步地，所述发酵工序中，通过流加培养液来提高色氨酸产量，具体包括如下：
1）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以1.0- 3.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加磷酸氢二钾溶液，直至发酵结束；
2）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以0.5-1.5ml/h的流速往发酵罐中补料流加硫酸铵溶液，直至发酵结束；
3）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以1.0-2.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加精氨酸水溶液，直至发酵结束；
4）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以2.0- 4.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液，直至发酵结束。
优选地，所述磷酸氢二钾溶液的浓度为5.0%（w/v）。
优选地，所述硫酸铵溶液的浓度为10.0%（w/v）。
优选地，所述精氨酸水溶液的浓度为5.0%（w/v）。
优选地，所述丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液中，丙二酸的浓度为10-20%（v/v），三氟乙酸的浓度为10-20%（v/v）。
优选地，所述陶瓷膜为Al2O3微滤膜，截留分子量为5000Da。
优选地，所述反渗透膜为聚酰胺复合膜，压力为0.55MPa，温度为55℃。
本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性：
本发明发酵培养基中采用蛋白胨替代酵母膏作为迟效氮源，杂蛋白、色素等复杂不稳定物质降低，并且添加量较少，微生物生长通过迟效氮源，以及流加速效氮源来维持，发酵培养基相对较为清洁，菌体代谢所产生的能量循环与传递通畅，多数能量供应自身生长需求，较少生成乙酸；
控制葡萄糖的摄入速率对L-色氨酸发酵具有重要意义。发酵初期葡萄糖浓度过高，会造成乙酸产量增加，但是浓度过低不利于菌株增殖；发酵中后期保持较低葡萄糖的摄入速率有利于抑制乙酸等副产物的生成，过高葡萄糖的摄入速率使TCA循环代谢流增加，HMP途径流量不充足。本发明采用发酵前期相对较高葡萄糖浓度，发酵中后期葡萄糖浓度控制在较低水平，以达到控制乙酸生长，并且保持菌株增殖效率的目的。
本发明通过在发酵后期流加磷酸氢二钾以及硫酸铵，有效补充了氮源以及菌株生长所需要的营养物质，维持了菌株的生长活力，发酵产酸性能大幅提升；发酵中后期，代谢副产物增多，添加适量的精氨酸可提高6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活力，降低代谢副产物的积累量，从而进一步提高L-色氨酸的产率。
丙二酸和三氟乙酸能够抑制TCA循环的关键酶，进而减弱TCA循环，增加非氧化磷酸戊糖循环的流量，减少了TCA循环中乙酸等副产物的生成量，进一步增加了L-色氨酸的产率；但是TCA循环也不易过度弱化，因为，过度弱化会造成菌株生长受到明显抑制，从而造成L-色氨酸的产量下降。
本发明补入的糖能够快速均匀分布到发酵液中，有效的解决了糖局部浓度过高造成发酵液渗透压过和过多的副产物乙酸; 同时也解决了发酵液中局部葡萄糖浓度过低而使底物限制，使发酵液中的残糖迅速耗尽，导致菌种生产能力不能得到最大限度发挥的问题；
在溶氧回升前，通过调整搅拌转速或者空气流量，将溶氧维持在较高的水平，解氧回升后按固定时间间隔调整搅拌转速或者空气流量，同时增加补糖速率，在发酵前期 (0〜12h)和发酵后期（13h〜培养结束)将溶解氧控制在不同的水平，这一方面加快了菌种的生长速率，另一方面避免了工艺参数调整过快，糖补入量过多，造成发酵失控；
本发明提取工艺中，膜分离的过程是一个高效、环保的分离过程，它是多学科交叉的高新技术，它在物理、化学和生物性质上可呈现出各种各样的特性，具有较多的优势；本发明采用膜分离技术改进色氨酸传统提取工艺，色氨酸整体收率大幅提高，能耗降至传统工艺一半，自动化操作，并实现水的循环使用，降低生产成本，改善工作环境；本发明高效的分离过程，低能耗，废水产生量少，节能减排；接近室温的工作温度，品质稳定性好；连续化操作，灵活性强；纯物理过程，不增加废物。
附图说明
图1：磷酸氢二钾流加速率对L-色氨酸产量的影响；
图2：硫酸铵流加速率对L-色氨酸产量的影响；
图3：精氨酸添加量对L-色氨酸产量和菌体生物量的影响；
图4：丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液对L-色氨酸产量和菌体生物量的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种生产和提取色氨酸的工艺，其包括如下步骤：
一、发酵工序：
步骤1)：将L-色氨酸工程菌大肠杆菌(E. coli) TRTH，培养至一定浓度的菌液；
步骤2)：将步骤1)得到的菌液以0.5%的接种量接种于装有一级种子培养基的摇瓶中，于36℃中，以100-200rpm培养10-20h；
步骤3)：将步骤2)得到的一级摇瓶种子以5%的接种量接种于二级种子培养基的种子罐中，控制风量5-10L/min，转速200-400rpm，温度35-37℃，罐压0.05- 0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5-6.8，培养10-20h；
步骤4)：将步骤3)得到的二级发酵罐种子（OD600值为11）以7%接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，转速400rpm，温度36℃，罐压0.06MPa，pH 值通过氨水控制在6.6，流加浓度为400g/l葡萄糖溶液控制残糖浓度为1g/L，溶氧量：在发酵前期 (0〜12h)控制在25%和发酵后期（13h〜培养结束)控制在20%，发酵周期40h。
所述一级培养基的组分为：酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，盐酸四环素50mg/l，pH,值6.6。
所述二级种子培养基的组分为：磷酸氢二钾10g/l，酵母粉10g/l，
葡萄糖20g/l，磷酸氢二钠2g/l，胰蛋白胨4g/l，氯化镁1.0 g/l，柠檬酸三钠0.2g/l，七水硫酸亚铁0.005g/l，一水硫酸锰0.005 g/l，pH控制在6.6，在115℃下灭菌15min。
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L、大豆蛋白胨5g/L、磷酸氢二钾9g/L、柠檬酸3.5g/L、硫酸铵3.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁20mg/L、一水硫酸锰10mg/L、生物素0.1 mg/L；pH控制在6.6，在115℃下灭菌15min。发酵过程中流加培养液的流程为：
1）在培养30h左右，于每升发酵液中以2.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加5.0%（w/v）磷酸氢二钾溶液，直至发酵结束。
2）在培养30h左右，于每升发酵液中以1.5ml/h的流速往发酵罐中补料流加10.0%（w/v）硫酸铵溶液，直至发酵结束。
3）在培养30h左右，于每升发酵液中以2.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加5.0%（w/v）精氨酸水溶液，直至发酵结束。
4）在培养30h左右，于每升发酵液中以4.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液，直至发酵结束。所述丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液中，丙二酸的浓度为15%（v/v），三氟乙酸的浓度为15%（v/v）。
二、提取工序：
发酵液进行灭菌，经陶瓷膜（陶瓷膜为质量分数为99%的Al2O3微滤膜，截留分子量为5000Da）过滤得到滤液；将滤液泵入色谱系统，进行L-色氨酸和其他杂质的分离；
一次脱色膜运行，运行过程中严禁手动停泵及阀门，严禁关闭气源进料过滤器压差不得超过0.5bar，一次脱色膜去除了滤液中的色素和大分子量的蛋白；
将各膜组点击选定激活，将各泵选择至自动模式启动，点击生产启动。系统进行液位检测，待液位达到设备要求时，开始进料外循环60s；顺序启动。待所有模组启动完毕后，开启透析水泵加水：要求加水量20-50%（根据车间要求的浓缩液含量控制加水），各模组加水量可根据各模组的透析通量进行调节，但总加水倍数不得超过进料流量的50%，浓缩液含量不得超过5‰的酸含量；
二次脱色膜运行，将一次脱色膜的滤液投入实验设备循环罐中，进行二次脱色，去除了小分子蛋白和色素，此时，所含杂质含量明显减少，滤液纯净透亮，无可见固形物；再次过滤运行，透析加水，各模组加水量可根据各模组的通量进行调节；
将所得脱色液进行反渗透膜（聚酰胺复合膜，压力0.55MPa，温度55℃）脱水浓缩，得到L-色氨酸洗脱液，将其打入四效蒸发器，真空浓缩为原体积的四分之一，所得浓缩液进行冷却结晶，离心、烘干得到L-色氨酸产品。经检测产品纯度为99%以上，产品收率为90%左右。
实施例2
一种生产和提取色氨酸的工艺，其包括如下步骤：
一、发酵工序：
步骤1)：将L-色氨酸工程菌大肠杆菌(E. coli) TRTH，培养至一定浓度的菌液；
步骤2)：将步骤1)得到的菌液以0.1%-1%的接种量接种于装有一级种子培养基的摇瓶中，于36℃中，以100-200rpm培养10-20h；
步骤3)：将步骤2)得到的一级摇瓶种子以1%-10%的接种量接种于二级种子培养基的种子罐中，控制风量5-10L/min，转速200-400rpm，温度35-37℃，罐压0.05-0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5-6.8，培养10-20h；
步骤4)：将步骤3)得到的二级发酵罐种子（OD600值为12）以6%接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，转速300rpm，温度35℃，罐压0.05MPa，pH 值通过氨水控制在6.5，流加浓度为500g/l葡萄糖溶液控制残糖浓度为1.2g/L，溶氧量：在发酵前期 (0〜12h)控制在30%和发酵后期（13h〜培养结束)控制在20%，发酵周期40h。
所述一级培养基的组分为：酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，盐酸四环素100mg/l， pH 值6.7。
所述二级种子培养基的组分为：磷酸氢二钾10g/l，酵母粉10g/l，
葡萄糖30 g/l，磷酸氢二钠3 g/l，胰蛋白胨3g/l，氯化镁0.1 g/l，柠檬酸三钠0.10 g/l，七水硫酸亚铁0.001 g/l，一水硫酸锰0.001g/l，pH控制在6.7，在115℃下灭菌15min。
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L、大豆蛋白胨5g/L、磷酸氢二钾9g/L、柠檬酸3.5g/L、硫酸铵3.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁20mg/L、一水硫酸锰10mg/L、生物素0.1 mg/L；pH控制在6.7，在115℃下灭菌15min。发酵过程中流加培养液的流程为：
1）在培养30h左右，于每升发酵液中以1.5ml/h的流速往发酵罐中补料流加5.0%（w/v）磷酸氢二钾溶液，直至发酵结束。
2）在培养30h左右，于每升发酵液中以1ml/h的流速往发酵罐中补料流加10.0%（w/v）硫酸铵溶液，直至发酵结束。
3）在培养30h左右，于每升发酵液中以1.5ml/h的流速往发酵罐中补料流加5.0%（w/v）精氨酸水溶液，直至发酵结束。此时色氨酸的产量为50g/l。
4）在培养30h左右，于每升发酵液中以3.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液，直至发酵结束。所述丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液中，丙二酸的浓度为15%（v/v），三氟乙酸的浓度为15%（v/v）；
二、提取工序：
发酵液进行灭菌，经陶瓷膜过滤得到滤液；将滤液泵入色谱系统，进行L-色氨酸和其他杂质的分离；
一次脱色膜运行，运行过程中严禁手动停泵及阀门，严禁关闭气源进料过滤器压差不得超过0.5bar，一次脱色膜去除了滤液中的色素和大分子量的蛋白；
将各膜组点击选定激活，将各泵选择至自动模式启动，点击生产启动。系统进行液位检测，待液位达到设备要求时，开始进料外循环60s；顺序启动。待所有模组启动完毕后，开启透析水泵加水：要求加水量20-50%（根据车间要求的浓缩液含量控制加水），各模组加水量可根据各模组的透析通量进行调节，但总加水倍数不得超过进料流量的50%，浓缩液含量不得超过5‰的酸含量；
二次脱色膜运行，将一次脱色膜的滤液投入实验设备循环罐中，进行二次脱色，去除了小分子蛋白和色素，此时，所含杂质含量明显减少，滤液纯净透亮，无可见固形物；再次过滤运行，透析加水，各模组加水量可根据各模组的通量进行调节；
将所得脱色液进行反渗透膜脱水浓缩，得到L-色氨酸洗脱液，将其打入四效蒸发器，真空浓缩为原体积的四分之一，所得浓缩液进行冷却结晶，离心、烘干得到L-色氨酸产品。
实施例3
一、磷酸氢二钾添加量对发酵液中L-色氨酸产量的影响。
发酵工艺同实施例1，不采用培养液的步骤。首先，通过实验验证流加磷酸氢二钾溶液对发酵的影响。如图1所述，随着磷酸氢二钾流加量的增大，发酵液中L-色氨酸的含量相应提高，流速为2ml/h时，基本达到峰值，继续增加流速，对色氨酸产量没有明显提高，磷酸氢二钾对菌体生物量的影响趋势和色氨酸类似（附图未显示），主要原因是，流加磷酸氢二钾溶液能够提高菌体生物量，从而提高色氨酸的产率。
二、硫酸铵添加量对发酵液中L-色氨酸产量的影响。
选择磷酸氢二钾的流速为2ml/h，设置不同梯度的硫酸铵添加量，如图2所示，硫酸铵流速为1.5ml/h时，L-色氨酸的含量为43.9g/L，继续增大硫酸铵的流速，对色氨酸的影响并不大，说明1.5ml/h的流速已经满足了菌株正常产酸的需求。
三、精氨酸添加量对发酵液中L-色氨酸产量和菌体生物量的影响。
选择磷酸氢二钾的流速为2ml/h，硫酸铵流速为1.5ml/h时，验证精氨酸对L-色氨酸产量和菌体生物量的影响。如图3所示，设置不同的梯度的流加量，随着精氨酸的流加速率的增加，L-色氨酸产量和菌体生物量持续增加，流速为2ml/h时，L-色氨酸产量和菌体生物量均达到峰值，较未添加精氨酸相比较，分别提高了5.01%和4.75%。
原因是，发酵中后期，代谢副产物增多，添加适量的精氨酸可提高6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活力，降低代谢副产物的积累量，减少对菌株的损害，进一步提高L-色氨酸的产率。
四、丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液对发酵液中L-色氨酸产量和菌体生物量的影响。
选择磷酸氢二钾的流速为2ml/h，硫酸铵流速为1.5ml/h，精氨酸流速为2ml/h时，设置不同流加速率的丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液，通过梯度试验发现，随着流加量的增大，色氨酸产量稳步提升，但是菌体生物量有所下降，流速为4ml/h时，色氨酸含量达到峰值，继续增加流加速率，色氨酸含量有所降低，菌体生物量受到抑制，降幅明显。原因可能是，丙二酸和三氟乙酸能够抑制TCA循环的关键酶，进而减弱TCA循环，增加非氧化磷酸戊糖循环的流量，减少了TCA循环中乙酸等副产物的生成量，进一步增加了L-色氨酸的产率，提高了6.72%；但是TCA循环也不易过度弱化，过度弱化会造成菌株生长受到明显抑制，从而造成L-色氨酸的产量下降。仅采用单一的丙二酸或者三氟乙酸时，对色氨酸产率也有一定程度的提高，最高分别为3.3%和4.1%，效果远不如较二者协同使用，可能原因是，丙二酸和三氟乙酸采用不同的机制对三羧酸循环进行抑制，能够更加有效地干预色氨酸的合成。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。