阅读说明：本技术 一种级联反应制备d-芳香族氨基酸的方法 (Method for preparing D-aromatic amino acid by cascade reaction ) 是由 倪晔 刘亚菲 许国超 韩瑞枝 于 2019-11-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种级联反应制备D-芳香族氨基酸的方法。本发明以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-N-氨甲酰水解酶作为催化剂,在海因酶过程级联反应中制备D-芳香族氨基酸。本发明提供了一种D-N-氨甲酰水解酶可作为催化剂应用于海因酶过程制备光学纯D-芳香族氨基酸,其可溶性好,催化效率高(转化率>99％)、立体选择性高(e.e.>99.9％)、适用的反应条件温和、环境友好。本发明的D-N-氨甲酰水解酶催化效果佳,底物适用性广,具有很好的应用开发前景。(The invention discloses a method for preparing D-aromatic amino acid by cascade reaction. The invention takes D-N-carbamyl hydrolase with an amino acid sequence shown as SEQ ID NO.2 as a catalyst to prepare D-aromatic amino acid in a hydantoinase process cascade reaction. The invention provides a D-N-carbamyl hydrolase which can be used as a catalyst for preparing optically pure D-aromatic amino acid in a hydantoinase process, and has the advantages of good solubility, high catalytic efficiency (the conversion rate is more than 99%), high stereoselectivity (e.e. > 99.9%), mild applicable reaction conditions and environmental friendliness. The D-N-carbamyl hydrolase of the invention has good catalytic effect, wide substrate applicability and good application and development prospect.)

一种级联反应制备D-芳香族氨基酸的方法

技术领域

本发明涉及一种级联反应制备D-芳香族氨基酸的方法，属于生物催化技术领域。

背景技术

D-氨基酸作为一种非天然的氨基酸，常被用来合成各种医药中间体，例如D-对羟基苯甘氨酸常被用来合成头孢菌素的前体(Syldatk C.,Advances in BiochemicalEngineeringBiotechnology,1990,29–75)；D-色氨酸(D-Trp)可用于合成奥曲肽Octreotide和他达拉非Cialis，它们是治疗肢端肥大症和***功能障碍的重要药物；D-Trp还可用于合成治疗皮炎的肽类药物，包括：Tyrocidines C(D-Phe-Pro-Trp-d-Trp-Asn-Gln-Tyr-Val-Orn-Leu)和Thymodepressin(γ-D-Glu-d-Trp)等(Martínez-Rodríguez etal.,Chem.Biodivers,2010,7,1531–1548)，同时，还可以用作非营养型甜味剂，在食品行业倍受欢迎。

D-N-氨甲酰水解酶是属于腈水解酶超家族的第6类，它可以将D-N-氨甲酰氨基酸水解得到的D-氨基酸，常被用来与海因消旋酶和海因酶构成级联反应制备光学纯的D-氨基酸。

近年来关于D-芳香族氨基酸的合成研究主要是D-色氨酸和D-对羟基苯甘氨酸，例如，1998年Yamamoto等人，利用D-N-酰胺酶选择性地水解D-色氨酰胺之后通过化学水解得到D-Trp(EP0853128A1)。类似于酰胺酶方法，1957年Greenstein，等人利用L-氨基酰化酶制备D-Trp，其中只有N-乙酰基-DL-色氨酰胺中的L-对映异构体被水解，剩余的对映异构体可通过化学法脱乙酰化形成D-Trp(Greenstein,J.P.,Methods In Enzymology,1957,3:554–570)。1995年，Yamamoto H等人报道可以D-色氨酸酶从DL-Trp外消旋体中降解L-Trp产生D-Trp，但是该反应的副产物丙酮酸和吲哚可抑制色氨酸酶的活性，因而需要去除(Kawasakiet al.Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1995,59:1938–1943)。关于D-对羟基苯甘氨酸的合成，目前研究比较好的是2007年，姜岷等人实现了50L规模的D-对羟基苯甘氨酸的制备，其时空产率为0.68g/Lh(Jiang,M.,Enzym.Microb.Technol,2007,41,407–412)，仍处于一个较低的制备水平，另外其所使用的反应底物为DL-对羟基苯海因，这使得底物的成本高，而且最终的转化产物的的得率低。

目前报道的这些方法都存在理论产率为50％，过程复杂，产率低和对映选择性等缺点。尽管在1949年，Eadie G等人报道可以由D-氨基酸转氨酶使得底物吲哚丙酮酸和D-丙氨酸反应的方法来制备光学纯D-Trp，该方法理论产率为100％，但是活性低，而最终的产率仅为13％(Eadie G et al.Journalof Biological Chemistry,1949,181:449–458)。海因酶过程是一个由海因消旋酶，海因酶和氨甲酰水解酶组成的三酶级联反应，由于其可以打破传统的50％转化率的限制，因而拥有较高的得率，一直以来被认为是高效经济制备光学纯D-氨基酸的方法。本人在前期的研究中已经筛选到一支来源于成晶节杆菌中的D-氨甲酰水解酶，专利号(201711097767.0)，其能够催化300mM L-吲哚甲基海因基本完全转化生成相应的D-色氨酸。在前期研究中发现由于氨甲酰水解酶的活力较前两步反应明显偏低，当继续提高底物浓度时，需要加入大量的氨甲酰水解酶来完成转化，使得这一过程失去了原有的经济性，因此筛选一支对芳香族氨基酸具有高催化活性的D-氨甲酰水解酶对于高效制备D-芳香族氨基酸是至关重要的。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种D-N-氨甲酰水解酶。其具有良好的可溶性，对D构型的氨甲酰氨基酸底物表现出高立体选择性，并对D-N-氨甲酰色氨酸和D-N-去羟基苯甘氨酸等芳香族氨基酸具有高的催化活性，同时相比已经报道的D-N-氨甲酰水解酶具有更高的热稳定性，并将其应用于海因酶级联反应制备D-芳香族氨基酸。

本发明的第一个目的是提供一种级联反应制备D-芳香族氨基酸的方法，所述方法是以D-N-氨甲酰水解酶作为催化剂，在海因酶过程级联反应中制备D-芳香族氨基酸，所述的D-N-氨甲酰水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的D-N-氨甲酰水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的方法具体是，以L-吲哚甲基海因为底物，以D-N-氨甲酰水解酶、海因消旋酶和海因酶为催化剂，反应生成D-色氨酸。

进一步地，所述的L-吲哚甲基海因的浓度为5～1000mmol/L。

进一步地，所述的D-N-氨甲酰水解酶的添加量为1～50kU/L，所述的海因消旋酶的添加量为1～25kU/L，所述的海因酶的添加量为1～25kU/L。

进一步地，所述的方法具体是，以L-对羟基苯海因为底物，以D-N-氨甲酰水解酶、海因消旋酶和海因酶为催化剂，反应生成D-对羟基苯甘氨酸。

进一步地，所述的L-对羟基苯海因的浓度为5～500mmol/L。

进一步地，所述的D-N-氨甲酰水解酶的添加量为1～40kU/L，所述的海因消旋酶的添加量为1～30kU/L，所述的海因酶的添加量为1～20kU/L。

进一步地，所述的海因酶过程级联反应的温度为20-40℃。

在本发明中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的D-N-氨甲酰水解酶基因构建到pET28a为载体上，导入重组大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组菌BL21(DE3)/pET28a-NihyuC。培养重组菌，诱导获得重组的D-N-氨甲酰水解酶。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种D-N-氨甲酰水解酶可作为催化剂应用于海因酶过程制备光学纯D-芳香族氨基酸，其可溶性好，催化效率高(转化率>99％)、立体选择性高(e.e.>99.9％)、适用的反应条件温和、环境友好。本发明的D-N-氨甲酰水解酶催化效果佳，底物适用性广，具有很好的应用开发前景。

附图说明

图1为基因NihyuC的PCR扩增电泳图谱。M，Marker；1，基因NihyuC

图2为pET28a-NihyuC重组质粒物理图谱。

图3为重组D-N-氨甲酰水解酶的蛋白电泳图。M，Marker；泳道1、2分别为重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-NihyuC诱导后上清、沉淀。

图4，为重组D-N-氨甲酰水解酶的蛋白纯化的电泳图。M，Marker；泳道1为上样流穿液；2-6分别为不同浓度咪唑进行蛋白洗脱的洗脱收集液。

图5为D-N-氨甲酰水解酶的选择性分析液相检测图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：D-氨甲酰水解酶基因的克隆

采用一步克隆法克隆硝酸盐还原菌中的D-N-氨甲酰水解酶基因。

(1)首先使用LB培养基，于37℃下过夜培养上述硝酸盐还原菌。离心获得菌体后，使用常规细菌基因组提取试剂盒获得基因组总DNA。

(2)根据已报道的D-N-氨甲酰水解酶基因设计引物(上游引物:CAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGACGCGGCGCATAAGG,SEQ ID NO.3；下游引物:GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCACTCCACACCGGTCTGTGA,SEQ ID No.4)，以硝酸盐还原菌基因组为模板进行PCR，体系如下(μL)：10×PCR Mix 10，上游引物0.2，下游引物0.2，基因组0.2，DNA聚合酶0.2，ddH₂O 9.2。PCR程序为：95℃预变性10min，95℃裂解30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环29次，72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，并利用琼脂糖胶回收试剂盒回收500～1000bp区间的条带(图1)，即D-N-氨甲酰水解酶基因。所得D-N-氨甲酰水解酶基因命名为NihyuC，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：全长924bp，其起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。序列中无内含子，编码序列从第1个核苷酸起至924个核苷酸止，所编码的蛋白质序列如SEQ IDNo.2所示。

实施例2：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-NihyuC的构建及培养

用限制性内切酶BamHI和XhoI将质粒pET28a和NihycC于37℃水浴中酶切反应3h，次日经琼脂糖凝胶电泳纯化并利用琼脂糖回收试剂盒回收目标片段。37℃下，使用一步克隆法将基因NihyuC与酶切过的质粒pET28进行连接，即得重组表达载体pET28a-NihyuC(图2)。将构建好的重组表达载体pET28a-NihyuC转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，涂布含卡那霉素抗性LB固体平板，过夜培养后进行菌落PCR验证，阳性克隆子即为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-NihyuC。挑取阳性克隆子于LB培养基中过夜培养，次日按2％转接量转接入新鲜LB培养中，培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入0.2mmol·L^-1IPTG，30℃诱导培养6小时后，4℃、8000r/min离心10min收集菌体。将收集好的菌体悬浮于Tris-HCl缓冲液(100mmol·L^-1，pH 8.0)中，超声破碎，并通过SDS-PAGE分析蛋白的表达情况(图3)。由图3可知，目的蛋白基本都在上清中，说明重组酶在大肠杆菌中成功得到可溶表达。

实施例3：D-N-氨甲酰水解酶的分离纯化

悬浮重组细胞于A液(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^-1NaCl，20mmol·L^-1咪唑，pH7.4)中，超声波破碎离心后获得粗酶液。纯化所使用的柱子为亲和柱HisTrap HP crude(镍柱)，利用重组蛋白上的组氨酸标签进行亲和结合来完成。首先使用A液将镍柱平衡，粗酶液上样，继续使用A液将穿透峰洗脱下来，待平衡后用B液(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^{- 1}NaCl，1000mmol·L^-1咪唑，pH 7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得重组D-N-氨甲酰水解酶。对纯化后的蛋白进行酶活力测定(DL-N-氨甲酰色氨酸为底物)及SDS-PAGE分析(图4)。由图4可知，镍柱纯化后，在38kDa左右显示单条带，且杂蛋白较少，说明镍柱纯化效果较好。之后使用His Trap Desalting脱盐柱(GE Healthcare)将纯化后的D-N-氨甲酰水解酶置换到Tris-HCl(100mmol·L^-1，pH 8.0)缓冲液中，进行下一步酶学性质分析。

实施例4：D-N-氨甲酰水解酶的酶活力测定

测定D-N-氨甲酰水解酶对底物DL-N-氨甲酰色氨酸的酶活力。测定体系为：适量酶液、10mmol·L^-1DL-N-氨甲酰色氨酸。于30℃静置反应10min。反应结束后，取样进行液相检测。液相检测条件：色谱柱为Diamonsil Plus C18(25cm×4.6mm,5μm)，流动相为乙腈：磷酸二氢钾(25：75)，流速为0.2～1mL·min^-1,检测波长为210nm。

酶活力单位定义(U)：

在30℃下，D-N-氨甲酰水解酶催化底物DL-N-氨甲酰色氨酸生成1μmol的D色氨酸所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。

实施例5：底物谱分析

测定D-N-氨甲酰水解酶(NiHyuC)催化不同的DL-N-氨甲酰氨基酸的酶活力，以DL-N-氨甲酰色氨酸为底物测得的酶活力为100％对照，其他底物测得的酶活力以二者的百分比计算。测定结果如表1所示。

表1 NiHyuC的底物谱

表1显示，NiHyuC不仅能够催化DL-N-氨甲酰色氨酸，同时能够催化DL-N-氨甲酰苯丙氨酸和DL-N-氨甲酰苯甘氨酸，DL-N-对羟基苯甘氨酸，DL-N-氨甲酰甲硫氨酸，其相对活力分别为DL-N-氨甲酰-色氨酸的64％，163％，92％和69％，对底物DL-N-氨甲酰邻氯苯甘氨酸，DL-N-氨甲酰亮氨酸，DL-N-氨甲酰异亮氨酸活力非常低。

实施例6：最适pH

配制100mmol·L^-1不同pH的缓冲液：Tris-HCl(7.0～9.0)、磷酸钠缓冲液(pH 6.0～8.0)、甘氨酸–NaOH缓冲液(pH 8.0～10.0)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9.5～10.5)。然后以DL-N-氨甲酰色氨酸为底物，测定NiHyuC在不同pH缓冲液的相对酶活力。NiHyuC的最适反应pH为7.0～9.0，酶活力为0.6～0.8U·mg^–1.。在pH为9.5～10.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，酶活力降至20％以下。

实施例7：最适反应温度

分别以DL-N-氨甲酰-色氨酸为底物，测定NiHyuC在不同温度(20～55℃)下的酶活，测得的最高酶活力定为100％，其他温度下测得的酶活力以相对于最高活力的百分比计算。结果显示NiHyuC的最适反应温度为25～35℃，为0.7～1.2U·mg^–1。

实施例8：动力学参数分析

测定NiHyuC对底物DL-N-氨甲酰-色氨酸的动力学参数。动力学参数测定体系列举如下：Tris-HCl缓冲液(100mmol·L^-1，pH 8.0)，DL-N-氨甲酰-色氨酸(0～20mmol·L^-1)。通过计算比酶活力来表征反应速率，从而计算动力学参数。测定的NiHyuC对底物DL-N-氨甲酰-色氨酸的动力学参数分别为K_m为8.9mmol·L^-1，V_max为6.1μmol·min^–1·mg^–1。

实施例9：立体选择性分析

测定NiHyuC催化底物DL-N-氨甲酰水解酶的选择性。反应体系(10mL)为：适量纯化的酶液、10mmol·L^-1DL-N-氨甲酰-色氨酸。于30℃反应30min。反应结束后，取样进行液相检测。检测条件：Astec CHIROBIOTICTM T色谱柱(15cm×4.6mm,5μm)，检测波长为210nm，流动相为甲醇：水(40：60)，流速为0.2～1mL/min。由图5可知，该酶具有非常好的立体选择性，仅有D-色氨酸生成。

实施例10：D-N-氨甲酰水解酶应用于海因酶过程制备D-色氨酸

取2～500U所得的重组D-N-氨甲酰水解酶和2～500U的海因消旋酶(AaHyuA)、1～25U D-海因酶(AtHyuH)于Tris-HCl缓冲液(pH 6～8,100mmol·L^-1)中，加入5-20％PEG400，5～1000mmol·L^-1L-吲哚甲基海因(表2)，反应液总体积为10mL。将反应置于20～40℃下，取样检测转化过程，条件如下：Diamonsil Plus C18色谱柱(25cm×4.6mm,5μm)，检测波长为210nm，流动相为乙腈：磷酸二氢钾(10～30：90～70)，流速为0.5～1mL/min。在1L规模进行转化反应制备D-色氨酸，添加25kUAaHyuA，25kUAtHyuH和50kUNiHyuC，1000mmol L-吲哚甲基海因(229g)，5％PEG400至于Tris-HCl缓冲液(pH 6～8,100mmol·L^-1)中，搅拌至反应结束。反应结束后加入盐酸终止反应，离心经阳离子交换树脂纯化得到D-色氨酸。

表2 D-氨甲酰水解酶应用于海因酶过程制备D-色氨酸

实施例11：D-N-氨甲酰水解酶应用于海因酶过程制备D-对羟基苯甘氨酸取2～400U所得的重组D-N-氨甲酰水解酶和2～200U的海因消旋酶(AaHyuA)、1～20U D-海因酶(AtHyuH)于Tris-HCl缓冲液(pH 6～8,100mmol·L^-1)中，加入5-20％PEG400，5～500mmol·L^-1L-对羟基苯海因(表3)，反应液总体积为10mL。将反应置于20～40℃下，取样检测转化过程，条件如下：Diamonsil Plus C18色谱柱(25cm×4.6mm,5μm)，检测波长为210nm，流动相为乙腈：磷酸二氢钾(10～30：90～70)，流速为0.5～1mL/min。在1L规模进行转化反应制备D-对羟基苯甘氨酸，添加30kUAaHyuA，20kUAtHyuH和40kUNiHyuC，500mol/L L-对羟基苯海因(96g/L)，5％PEG400至于Tris-HCl缓冲液(pH 6～8,100mmol·L^-1)中，搅拌至反应结束。反应结束后加入盐酸终止反应，离心经阳离子交换树脂纯化得到D-色氨酸。

表3D-氨甲酰水解酶应用于海因酶过程制备D-对羟基苯甘氨酸

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种级联反应制备D-芳香族氨基酸的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 924

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

atgacgcggc gcataaggat cggcggtgcc cagatggggg caatatcgag atccgacagc 60

aagaaggaaa tcgtcgaccg cctgattgcg ctgcttcggc aagccagtga aaagggctgc 120

gaactggtcg tcttccccga actggcgctc agcaccttct tcccgcgctg gtatgccgag 180

cgcgacggta tggacggcta tttcgaagac ggaatgccca atgccgctac gctgcccctt 240

ttcgaggaag cgcgccggct gggcatcggc ttcagccttg gctatgcgga gcttgtccag 300

gaagatgggc gggttcggcg tttcaacacc accgtgctcg tggagcgcaa tggcgaaatc 360

gtcggcaaat accggaagat tcacctgccg ggccatgccg aatatgagcc tgagcgcagt 420

caccagcatc tggaaaaacg ctatttcgag gtgggcaata cgggctttca ggtttgggat 480

gcctttggcg gtcgtgtggg catggcgatc tgcaatgacc ggcgctgggt cgagacctat 540

cgcgtgatgg ggcttcagga tgtggagttg atcctgattg gctacaacac gccggtggcc 600

gattcccttt caggggaaag cgagacgctg cgcatgttcc acaatcacct tacgatgcag 660

gcgggggctt atcagaactc gacctgggtg gtgggggttg cgaaggcagg cgtcgaagac 720

gggcatcgcc tgatgggagg cagtgtcatc gtcgcgccga cgggcgaaat tgtagcgcag 780

gcgatgacgg aaggggacga actcatcgtt gccgattgcg atctcgatcg ctgccgctac 840

tacaaatccc acatcttcaa tttcgcggcg catcgccgtc ccgaattcta tcagcggata 900

acttcacaga ccggtgtgga gtga 924

<210> 2

<211> 307

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 2

Met Thr Arg Arg Ile Arg Ile Gly Gly Ala Gln Met Gly Ala Ile Ser

1 5 10 15

Arg Ser Asp Ser Lys Lys Glu Ile Val Asp Arg Leu Ile Ala Leu Leu

20 25 30

Arg Gln Ala Ser Glu Lys Gly Cys Glu Leu Val Val Phe Pro Glu Leu

35 40 45

Ala Leu Ser Thr Phe Phe Pro Arg Trp Tyr Ala Glu Arg Asp Gly Met

50 55 60

Asp Gly Tyr Phe Glu Asp Gly Met Pro Asn Ala Ala Thr Leu Pro Leu

65 70 75 80

Phe Glu Glu Ala Arg Arg Leu Gly Ile Gly Phe Ser Leu Gly Tyr Ala

85 90 95

Glu Leu Val Gln Glu Asp Gly Arg Val Arg Arg Phe Asn Thr Thr Val

100 105 110

Leu Val Glu Arg Asn Gly Glu Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile His

115 120 125

Leu Pro Gly His Ala Glu Tyr Glu Pro Glu Arg Ser His Gln His Leu

130 135 140

Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Val Gly Asn Thr Gly Phe Gln Val Trp Asp

145 150 155 160

Ala Phe Gly Gly Arg Val Gly Met Ala Ile Cys Asn Asp Arg Arg Trp

165 170 175

Val Glu Thr Tyr Arg Val Met Gly Leu Gln Asp Val Glu Leu Ile Leu

180 185 190

Ile Gly Tyr Asn Thr Pro Val Ala Asp Ser Leu Ser Gly Glu Ser Glu

195 200 205

Thr Leu Arg Met Phe His Asn His Leu Thr Met Gln Ala Gly Ala Tyr

210 215 220

Gln Asn Ser Thr Trp Val Val Gly Val Ala Lys Ala Gly Val Glu Asp

225 230 235 240

Gly His Arg Leu Met Gly Gly Ser Val Ile Val Ala Pro Thr Gly Glu

245 250 255

Ile Val Ala Gln Ala Met Thr Glu Gly Asp Glu Leu Ile Val Ala Asp

260 265 270

Cys Asp Leu Asp Arg Cys Arg Tyr Tyr Lys Ser His Ile Phe Asn Phe

275 280 285

Ala Ala His Arg Arg Pro Glu Phe Tyr Gln Arg Ile Thr Ser Gln Thr

290 295 300

Gly Val Glu

305

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

cagcaaatgg gtcgcggatc catgacgcgg cgcataagg 39

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

gtggtggtgg tggtgctcga gtcactccac accggtctgt ga 42