阅读说明：本技术 一种利用酶催化制备2`-脱氧腺苷纯品的方法 (Method for preparing 2' -deoxyadenosine pure product by enzyme catalysis ) 是由 原海亮 陶晓阳 秦建新 冯永良 于 2020-07-01 设计创作，主要内容包括：一种利用酶催化制备2’-脱氧腺苷纯品的方法,将N-脱氧核糖转移酶重组大肠杆菌菌株接种至发酵培养基中,经诱导蛋白表达发酵,得到N-脱氧核糖转移酶粗品；将脱氧核糖供体和碱基供体按比例称量后加入反应体系,加入N-脱氧核糖转移酶粗品搅拌反应,得到2’-脱氧腺苷酶催化反应液；对2’-脱氧腺苷酶催化反应液加热,再离心除去不溶物,取上清液即得到含2’-脱氧腺苷产品粗液；用碱性溶液对含2’-脱氧腺苷产品粗液的pH值调整,放置于低温环境进行结晶,干燥处理,得到2’-脱氧腺苷粗品；将预冷的碱水加入到2’-脱氧腺苷粗品中,再在低温下搅拌洗杂,除去液体,得到固体物并干燥处理。节省原料,提高制备效率,降低制备成本。(A method for preparing 2' -deoxyadenosine pure product by enzyme catalysis comprises inoculating recombinant Escherichia coli strain of N-deoxyribotransferase into fermentation culture medium, and fermenting by inducing protein expression to obtain crude product of N-deoxyribotransferase; weighing a deoxyribose donor and a base donor according to a proportion, adding the deoxyribose donor and the base donor into a reaction system, adding a crude product of N-deoxyribose transferase, and stirring for reaction to obtain a 2' -deoxyadenylate enzyme catalytic reaction solution; heating the 2'-deoxyadenosine enzyme catalysis reaction liquid, then centrifuging to remove insoluble substances, and taking supernatant fluid to obtain crude liquid containing the 2' -deoxyadenosine; adjusting the pH value of the crude liquid containing the 2'-deoxyadenosine product by using an alkaline solution, placing the crude liquid in a low-temperature environment for crystallization, and drying the crude liquid to obtain a 2' -deoxyadenosine crude product; adding pre-cooled alkaline water into the crude product of 2' -deoxyadenosine, stirring and washing impurities at low temperature, removing liquid to obtain solid, and drying. Saves raw materials, improves the preparation efficiency and reduces the preparation cost.)

一种利用酶催化制备2'-脱氧腺苷纯品的方法

技术领域

本发明属于重组酶催化工程和分离纯化技术领域，具体涉及一种利用酶催化制备2'-脱氧腺苷纯品的方法。

背景技术

2'-脱氧腺苷（2'-Deoxyadenosine，缩写dA），也称“2'-脱氧核糖腺嘌呤核苷”，是一种天然的脱氧核糖核苷，作为遗传物质脱氧核糖核酸（DNA）的有机组成成分，参与生物机体细胞的遗传信息的传递。2'-脱氧腺苷可作为基因药物和基因工程的原材料，并且还是许多抗病毒、抗肿瘤药物的重要中间体，比如用于抗逆转录酶病毒的药物地丹诺辛（2，3-双脱氧肌苷），以及用于慢性淋巴细胞白血病的治疗的氟达拉滨（阿糖腺苷的氟化核苷类似物）和治疗淋巴细胞增殖类疾病用的克拉屈滨（2-氯-2'-脱氧腺苷），在抗疱疹病毒药物中大多数也是核苷、脱氧核苷类似物。随着健康产业的发展，特别是经过2019年新冠状肺炎病毒的传播，对抗病毒药物的需求更加迫切，核苷类似物作为抗病毒药物的重要组成部分，需求量也在急剧增加。

2'-脱氧腺苷作为核苷类似物的中间体，其合成途径主要有化学合成法、生物发酵法以及酶工程合成法，化学合成法如专利CN 105884846 B（一种2'-脱氧腺苷的合成方法）所述，将腺苷采用二烷基氧化物作为酯化剂进行酯化，酰化剂和缚酸剂的酰化作用，得到酰化物，酰化物再经过还原和纯化处理，得到产物2'-脱氧腺苷，纯度在99%左右，但是整个化学合成依赖苛刻的反应条件，并且对环境容易造成污染；专利CN104178541B（一种利用大肠埃希氏菌转化生产2'-脱氧腺苷的方法）中使用核苷酸磷酸化酶来实现2'-脱氧腺苷的合成，但是其反应液需要缓冲盐，底物浓度只有3-5mmol，且需要3步结晶工艺，对于工业化放大生产有所限制。专利CN105754899B（一种N-脱氧核糖转移酶、编码基因及其高产菌株和应用） 提供希氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii）来源的N-脱氧核苷转移酶以2'-脱氧尿苷为核糖供体来合成2'-脱氧腺苷，但底物浓度仅为10mmol/L，产率仅为40-60%（见说明书第0057段），同样不足以满足工业化放大生产的期望要求。

基于上述已有技术，有必要加以合理探索与改进，下面将要介绍的技术方案便是在这种背景下产生的。

发明内容

本发明的任务在于提供一种利用酶催化制备2'-脱氧腺苷纯品的方法，该方法有助于避免对环境产生污染、有利于显著提高底物浓度并简化纯化工艺流程以及避免依赖繁琐的层析柱工艺、有益于节省原料及提高制备效率而得以满足产品的工业化放大生产要求。

本发明的任务是这样来完成的，一种利用酶催化制备2'-脱氧腺苷纯品的方法，包括以下步骤：

A) 制备N-脱氧核糖转移酶粗品，先将N-脱氧核糖转移酶重组大肠杆菌菌株接种至发酵培养基中，经诱导蛋白表达发酵，得到N-脱氧核糖转移酶粗品；

B) 制备2'-脱氧腺苷酶催化反应液，将脱氧核糖供体和碱基供体按比例称量后加入反应体系，加入纯化水搅拌混匀，调整反应液温度，加入由步骤A）得到的N-脱氧核糖转移酶粗品搅拌反应并且控制搅拌反应的时间，得到2'-脱氧腺苷酶催化反应液；

C) 制备含2'-脱氧腺苷产品粗液，先对由步骤B）得到的2'-脱氧腺苷酶催化反应液加热，再离心除去不溶物，取上清液即得到含2'-脱氧腺苷产品粗液；

D) 制备2'-脱氧腺苷粗品，先用碱性溶液对由步骤C）得到的含2'-脱氧腺苷产品粗液的pH值进行调整，再放置于低温环境进行结晶，收集结晶后的晶体进行干燥处理，得到2'-脱氧腺苷粗品；

E) 制备2'-脱氧腺苷纯品，先将预冷的碱水加入到由步骤D）得到的2'-脱氧腺苷粗品中，再在低温环境下进行搅拌洗杂，然后除去液体，得到固体物并干燥处理，得到2'-脱氧腺苷纯品；

步骤A）中所述的N-脱氧核糖转移酶重组大肠杆菌菌株是将瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）中编码N-脱氧核糖转移酶（Nucleosidedeoxyribosyltransferase，缩写NDT）的ntd-2基因经密码子优化后，克隆至大肠杆菌BL21（Escherichia coli BL21）宿主内，构建而成的重组NDT大肠杆菌表达菌株HYNTD-202003，ntd-2基因人工合成序列见序列表中序列1，N-脱氧核糖转移酶氨基酸序列见序列表中序列2，该重组NDT大肠杆菌表达菌株HYNTD-202003保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.19570。

在本发明的一个具体的实施例中，步骤A)中所述的发酵培养基为TB液体培养基，该TB液体培养基中含有：12g/L的蛋白胨，24g/L的酵母粉，4g/L的甘油，2.31g/L的KH₂PO₄ ，16.43g/L的K₂HPO₄·3H₂O；所述诱导蛋白表达发酵是使用诱导剂诱导蛋白表达发酵，所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）或者乳糖；所述的N-脱氧核糖转移酶粗品为含有N-脱氧核糖转移酶的大肠杆菌发酵菌体、含有发酵菌体细胞破碎液或者含有发酵菌体细胞破碎液的冻干粉的N-脱氧核糖转移酶的粗品。

在本发明的一个具体的实施例中，步骤B）中所述的脱氧核糖供体和碱基供体按比例称量是按摩尔浓度比1∶1~1.5进行称量，其中，脱氧核糖供体底物浓度为100g/L；所述的脱氧核糖供体为2'-脱氧胸苷、2'-脱氧尿苷或2'-脱氧胞苷；所述的碱基供体为腺嘌呤；所述加入由步骤A）得到的N-脱氧核糖转移酶粗品是指按照脱氧核糖供体质量的0.5%~2%加入反应。

在本发明的一个具体的实施例中，步骤B)中所述的调整反应液温度是指将反应液温度调整为25℃-60℃；所述控制搅拌反应的时间为3-6h，即HPLC检测脱氧核糖供体底物转化率达到最大值即可停止。

在本发明的一个具体的实施例中，步骤C）中所述加热的温度为70-85℃，加热的时间为3-10min；所述的离心为采用离心设备进行固液分离。

在本发明的一个具体的实施例中，步骤D）中所述的碱性溶液为氨水、饱和氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液；所述的对含2'-脱氧腺苷产品粗液的pH值进行调整是将pH值调整为10~13。

在本发明的一个具体的实施例中，步骤D）中所述的结晶的温度为0-10℃，结晶的时间为10-16h；所述的干燥处理为烘干或冷冻干燥。

在本发明的一个具体的实施例中，步骤E）中所述的预冷的碱水与2'-脱氧腺苷粗品的体积质量比为10~20:1mL/g；所述的预冷的碱水为预冷至3-10℃的10mM NaOH溶液。

在本发明的一个具体的实施例中，步骤E）中所述的低温环境是指洗杂体系的温度保持在0-10℃；所述搅拌洗杂的时间为20min~120min。

本发明提供的技术方案的技术效果在于：由于N-脱氧核糖转移酶重组大肠杆菌菌株是将瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）中编码N-脱氧核糖转移酶的ntd-2基因克隆至大肠杆菌BL21宿主内构建而成的重组NDT大肠杆菌表达菌株，通过大肠杆菌重组表达酶活效率显著提高，催化底物浓度可达100g/L，底物转化率可达85%以上，其酶使用量仅有底物质量的1%，既可节省原料又能提高制备效率并且得以降低制备成本而得以满足工业化放大生产要求；相比传统化工业，酶催化技术在制备过程中大大减少对环境的染污，因而具有良好的环保性；由于纯化工艺简单并且可避免使用繁琐的层析柱设备，因而可节省工艺成本及处理时间并且获得的产品纯度高以及纯化收率高达85%左右。

附图说明

图1为本发明的N-脱氧核糖转移酶重组大肠杆菌菌株经发酵诱导后，N-脱氧核糖转移酶表达效果图（SDS-PAGE蛋白电泳图），1表示重组NDT大肠杆菌表达菌株HYNTD-202003发酵菌体破碎后上清液；2表示重组NDT大肠杆菌表达菌株HYNTD-202003发酵菌体破碎后沉淀；M表示蛋白Marker。

图2为本发明所述实施例1的2'-脱氧腺苷酶催化反应不同时间点反应样品HPLC检测图谱，揭示的底物2'-脱氧腺苷转化率示意图，A表示实施例1中N-脱氧核糖转移酶催化反应0h样品；B表示实施例1中N-脱氧核糖转移酶催化反应3h样品。

图3为对本发明所述实施例1制备的2'-脱氧腺苷产品粗液纯度检测及离心前后产品损失率示意图，A表示实施例1中N-脱氧核糖转移酶催化3h样品，即离心前样品；B表示实施例1中反应液离心后获得2'-脱氧腺苷粗液。

图4为对本发明所述实施例1制备的2'-脱氧腺苷粗品纯度检测示意图。

图5为对本发明所述实施例1制备的2'-脱氧腺苷纯品纯度检测示意图。

图6为本发明方法制备的2'-脱氧腺苷纯品进行核磁检测图谱。

图7为本发明所述实施例2制备的2'-脱氧腺苷酶催化反应不同时间点反应样品HPLC检测图谱，揭示的底物2'-脱氧腺苷转化率示意图，A表示实施例2中N-脱氧核糖转移酶催化反应0h样品；B表示实施例2中N-脱氧核糖转移酶催化反应4.5h样品。

图8为对本发明所述实施例2制备的2'-脱氧腺苷产品粗液纯度检测及离心前后产品损失率示意图，A表示实施例2中N-脱氧核糖转移酶催化4.5h样品，即离心前样品；B表示实施例2中反应液离心后获得2'-脱氧腺苷粗液。

图9为对本发明所述实施例2制备的2'-脱氧腺苷粗品纯度检测示意图。

图10为对本发明所述实施例2制备的2'-脱氧腺苷纯品纯度检测示意图。

图11为本发明所述实施例3制备的2'-脱氧腺苷酶催化反应不同时间点反应样品HPLC检测图谱，揭示的底物2'-脱氧腺苷转化率示意图，A表示实施例3中N-脱氧核糖转移酶催化反应0h样品；B表示实施例2中N-脱氧核糖转移酶催化反应6h样品。

图12为对本发明所述实施例3制备的2'-脱氧腺苷产品粗液纯度检测及离心前后产品损失率示意图，A表示实施例3中N-脱氧核糖转移酶催化4.5h样品，即离心前样品；B表示实施例3中反应液离心后获得2'-脱氧腺苷粗液。

图13为对本发明所述实施例3制备的2'-脱氧腺苷粗品纯度检测示意图。

图14为对本发明所述实施例3制备的2'-脱氧腺苷纯品纯度检测示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对该发明进行进一步详细的说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不限于以下实施例，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但只要不脱离本发明的基本思路，均在本发明的范围内。

实施例1：

A)制备N-脱氧核糖转移酶粗品，先将N-脱氧核糖转移酶重组大肠杆菌菌株按1∶100的重量比种至TB液体培养基中，经诱导蛋白表达发酵，得到N-脱氧核糖转移酶粗品，本步骤中所述的N-脱氧核糖转移酶重组大肠杆菌菌株是将瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）中编码N-脱氧核糖转移酶的ntd-2基因克隆至大肠杆菌BL21宿主内，构建而成的重组NDT大肠杆菌表达菌株HYNTD-202003，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.19570。在本步骤中，在前述的TB液体培养基中含有：12g/L的蛋白胨，24g/L的酵母粉，4g/L的甘油，2.31g/L的KH₂PO₄ ，16.43g/L的K₂HPO₄·3H₂O，本步骤中所述的诱导蛋白表达使用的诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），前述的N-脱氧核糖转移酶粗品为含有N-脱氧核糖转移酶的大肠杆菌发酵菌体，也可是菌体细胞破碎后的含N-脱氧核糖转移酶的破碎液，也可是含N-脱氧核糖转移酶的破碎液进行冷冻干燥获得的冻干粉；在本步骤中，在前述诱导蛋白质表达发酵结束后，将培养的菌液使用离心机8000rpm离心10min，收集发酵菌体，该发酵菌体即为含有N-脱氧核糖转移酶的菌体，用30mL的2 mM pH7.0磷酸盐缓冲液将收集的菌体重悬，将重悬菌体放置在冰水浴中，用超声波细胞粉碎机进行细胞破碎，条件为200W，超声2s，间隔8s，共10min。离心收集上清液即为含N-脱氧核糖转移酶的破碎液，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达正常，且都位于上清液中（如图1），将该破碎液进行冷冻干燥即获得N-脱氧核糖转移酶粗品冻干粉，所述N-脱氧核糖转移酶分子量为18.1KDa；

B)制备2'-脱氧腺苷酶催化反应液，底物2'-脱氧胸苷质量浓度为100g/L，称取底物腺嘌呤，使其与底物2'-脱氧胸苷的摩尔浓度比为1.5∶1，称重后加入反应体系，加纯化水搅拌均匀，得到反应液并且在调整反应温度至55℃后，加入由步骤A）得到的N-脱氧核糖转移酶粗品，加入量为底物2'-脱氧胸苷质量的1%，开始搅拌反应；用高效液相色谱仪（HPLC）对反应液不同反应时间的底物转化率进行检测，结果显示反应3h底物2'-脱氧胸苷转化率达到最高为87.04%且不再变化（如图2的A及B），即得2'-脱氧腺苷酶催化反应液。

所述的HPLC检测方法是：色谱柱 Agilent ZORBAX SB-C18 4.6*150mm 5μm，使用的流动相为15%甲醇/水，检测波长为254nm，检测时间为20min；

C)制备含2'-脱氧腺苷产品粗液，先对由步骤B）得到的2'-脱氧腺苷酶催化反应液搅拌加热至75℃，保持10min，使酶失活，终止酶催化反应，用离心设备如离心机在8000rpm下进行15min固液分离，即离心除去不溶物，如不溶碱基及失活的酶蛋白，取上清液，即得到含2'-脱氧腺苷产品粗液（也可称2'-脱氧腺苷粗品液），并取样进行HPLC检测，测得2'-脱氧腺苷粗液纯度为76%（如图3的A及B），根据离心前后峰面积比计算产品损失率为1.6%左右；

D)制备2'-脱氧腺苷粗品，先用氨水对由步骤C）得到的含2'-脱氧腺苷产品粗液的pH值调整至pH＝13，再放置于0℃环境进行结晶，即在0℃环境中静置16h，收集结晶后的晶体并进行烘干处理，得到固体的2'-脱氧腺苷粗品，在结晶结束后，经对抽出的废液进行HPLC检测，计算结晶损失率为8%左右，将获得结晶固体样品平铺置于70℃烘箱，放置2-3h进行烘干，即为2'-脱氧腺苷粗品，对其进行HPLC检测，纯度为98.5%（如图4）；

E)制备2'-脱氧腺苷纯品，先将预冷至温度为4℃的10mM NaOH溶液加入到由步骤D）得到的2'-脱氧腺苷粗品中，该NaOH溶液与2'-脱氧腺苷粗品的体积质量比为10∶1，再在温度为10℃的低温环境下进行搅拌40min进行洗杂，然后除去液体，得到固体物并干燥处理，得到2'-脱氧腺苷纯品。对抽出的废液进行HPLC检测，计算碱洗损失率为3.1%左右。将得到的固体物质放置70度烘箱，烘干2-3h，即获得前述2'-脱氧腺苷纯品，整个纯化工艺收率为87.3%。 对获得的2'-脱氧腺苷纯品进行HPLC检测，纯度为99.95% （如图5），核磁检测结果证明获得的纯品为2'-脱氧腺苷（如图6）。

实施例2：

A)制备N-脱氧核糖转移酶粗品，先将N-脱氧核糖转移酶重组大肠杆菌菌株按1∶100的重量比种至TB液体培养基中，经诱导蛋白表达发酵，得到N-脱氧核糖转移酶粗品，本步骤中所述的N-脱氧核糖转移酶重组大肠杆菌菌株是将瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）中编码N-脱氧核糖转移酶的ntd-2基因克隆至大肠杆菌BL21宿主内，构建而成的重组NDT大肠杆菌表达菌株HYNTD-202003，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.19570。在本步骤中，在前述的TB液体培养基中含有：12g/L的蛋白胨，24g/L的酵母粉，4g/L的甘油，2.31g/L的KH₂PO₄ ，16.43g/L的K₂HPO₄·3H₂O，本步骤中所述的诱导蛋白表达使用的诱导剂为乳糖，前述的N-脱氧核糖转移酶粗品为含有N-脱氧核糖转移酶的大肠杆菌发酵菌体，也可是菌体细胞破碎后的含N-脱氧核糖转移酶的破碎液，也可是含N-脱氧核糖转移酶的破碎液进行冷冻干燥获得的冻干粉；在本步骤中，在前述诱导蛋白质表达发酵结束后，将培养的菌液使用离心机8000rpm离心10min，收集发酵菌体，该发酵菌体即为含有N-脱氧核糖转移酶的菌体，用30mL的2 mM pH7.0磷酸盐缓冲液将收集的菌体重悬，将重悬菌体放置在冰水浴中，用超声波细胞粉碎机进行细胞破碎，条件为200W，超声2s，间隔8s，共10min。离心收集上清液即为含N-脱氧核糖转移酶的破碎液，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达正常，且都位于上清液中，将该破碎液进行冷冻干燥即获得N-脱氧核糖转移酶粗品冻干粉；

B)制备2'-脱氧腺苷酶催化反应液，底物2'-脱氧胸苷质量浓度为100g/L，称取底物腺嘌呤，使其与底物2'-脱氧胸苷的摩尔浓度比为1.2∶1，称重后加入反应体系，加纯化水搅拌均匀，得到反应液并且在调整反应温度至45℃后，加入由步骤A）得到的N-脱氧核糖转移酶粗品，加入量为底物2'-脱氧胸苷质量的1%，开始搅拌反应；用高效液相色谱仪（HPLC）对反应液不同反应时间的底物转化率进行检测，结果显示反应4.5h底物2'-脱氧胸苷转化率达到最高为88.84%（如图7），且不再变化，即得2'-脱氧腺苷酶催化反应液。

所述的HPLC检测方法是：色谱柱 Agilent ZORBAX SB-C18 4.6*150mm 5μm，使用的流动相为15%甲醇/水，检测波长为254nm，检测时间为20min；

C)制备含2'-脱氧腺苷产品粗液，先对由步骤B）得到的2'-脱氧腺苷酶催化反应液搅拌加热至85℃，保持5min，使酶失活，终止酶催化反应，用离心设备如离心机在8000rpm下进行15min固液分离，即离心除去不溶物，如不溶碱基及失活的酶蛋白，取上清液，即得到含2'-脱氧腺苷产品粗液（也可称2'-脱氧腺苷粗品液），并取样进行HPLC检测，测得2'-脱氧腺苷粗液纯度为73.04%（如图8），根据离心前后峰面积比计算产品损失率为0.6%左右；

D)制备2'-脱氧腺苷粗品，先用NaOH溶液对由步骤C）得到的含2'-脱氧腺苷产品粗液的pH值调整至pH＝11，再放置于4℃环境进行结晶，即在4℃环境中静置12h，收集结晶后的晶体并进行烘干处理，得到固体的2'-脱氧腺苷粗品，在结晶结束后，经对抽出的废液进行HPLC检测，计算结晶损失率为11.2%左右，将获得结晶固体样品平铺置于70℃烘箱，放置2-3h进行烘干，获得烘干固体样品即为2'-脱氧腺苷粗品，对其进行HPLC检测，纯度为99.36%（如图9）；

E)制备2'-脱氧腺苷纯品，先将预冷至温度为10℃的10mM NaOH溶液加入到由步骤D）得到的2'-脱氧腺苷粗品中，该NaOH溶液与2'-脱氧腺苷粗品的体积质量比为15∶1，再在温度为10℃的低温环境下进行60min进行搅拌洗杂，然后除去液体，得到固体物并干燥处理，得到2'-脱氧腺苷纯品。对抽出的废液进行HPLC检测，计算碱洗损失率为1.05%左右。将得到的固体物质放置70度烘箱，烘干2-3h，即获得前述2'-脱氧腺苷纯品，整个纯化工艺收率为87.15%。 对获得的2'-脱氧腺苷纯品进行HPLC检测，纯度为99.97%（如图10），核磁检测结果证明获得的纯品为2'-脱氧腺苷。

实施例3：

A)制备N-脱氧核糖转移酶粗品，先将N-脱氧核糖转移酶重组大肠杆菌菌株按1∶100的重量比种至TB液体培养基中，经诱导蛋白表达发酵，得到N-脱氧核糖转移酶粗品，本步骤中所述的N-脱氧核糖转移酶重组大肠杆菌菌株是将瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）中编码N-脱氧核糖转移酶的ntd-2基因克隆至大肠杆菌BL21宿主内，构建而成的重组NDT大肠杆菌表达菌株HYNTD-202003，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.19570。在本步骤中，在前述的TB液体培养基中含有：12g/L的蛋白胨，24g/L的酵母粉，4g/L的甘油，2.31g/L的KH₂PO₄ ，16.43g/L的K₂HPO₄·3H₂O，本步骤中所述的诱导蛋白表达使用的诱导剂为乳糖，前述的N-脱氧核糖转移酶粗品为含有N-脱氧核糖转移酶的大肠杆菌发酵菌体，也可是菌体细胞破碎后的含N-脱氧核糖转移酶的破碎液，也可是含N-脱氧核糖转移酶的破碎液进行冷冻干燥获得的冻干粉；在本步骤中，在前述诱导蛋白质表达发酵结束后，将培养的菌液使用离心机8000rpm离心10min，收集发酵菌体，该发酵菌体即为含有N-脱氧核糖转移酶的菌体，用30mL的2 mM pH7.0磷酸盐缓冲液将收集的菌体重悬，将重悬菌体放置在冰水浴中，用超声波细胞粉碎机进行细胞破碎，条件为200W，超声2s，间隔8s，共10min。离心收集上清液即为含N-脱氧核糖转移酶的破碎液，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达正常，且都位于上清液中，将该破碎液进行冷冻干燥即获得N-脱氧核糖转移酶粗品冻干粉；

B)制备2'-脱氧腺苷酶催化反应液，底物2'-脱氧胸苷质量浓度为100g/L，称取底物腺嘌呤，使其与底物2'-脱氧胸苷的摩尔浓度比为1∶1，称重后加入反应体系，加纯化水搅拌均匀，得到反应液并且在调整反应温度至37℃后，加入由步骤A）得到的N-脱氧核糖转移酶粗品，加入量为底物2'-脱氧胸苷质量的2%，开始搅拌反应；用高效液相色谱仪（HPLC）对反应液不同反应时间的底物转化率进行检测，结果显示反应6h底物2'-脱氧胸苷转化率达到最高为96.52%（如图11），且不再变化，即得2'-脱氧腺苷酶催化反应液。

所述的HPLC检测方法是：色谱柱 Agilent ZORBAX SB-C18 4.6*150mm 5μm，使用的流动相为15%甲醇/水，检测波长为254nm，检测时间为20min；

C)制备含2'-脱氧腺苷产品粗液，先对由步骤B）得到的2'-脱氧腺苷酶催化反应液搅拌加热至75℃，保持10min，使酶失活，终止酶催化反应，用离心设备如离心机在8000rpm下进行15min固液分离，即离心除去不溶物，如不溶碱基及失活的酶蛋白，取上清液，即得到含2'-脱氧腺苷产品粗液（也可称2'-脱氧腺苷粗品液），并取样进行HPLC检测，测得2'-脱氧腺苷粗液纯度为75.46%（如图12），根据离心前后峰面积比计算产品损失率为3.1%左右；

D)制备2'-脱氧腺苷粗品，先用NaCO₃溶液对由步骤C）得到的含2'-脱氧腺苷产品粗液的pH值调整至pH＝12，再放置于10℃环境进行结晶，即在10℃环境中静置16h，收集结晶后的晶体并进行烘干处理，得到固体的2'-脱氧腺苷粗品，在结晶结束后，经对抽出的废液进行HPLC检测，计算结晶损失率为9.6%左右，将获得结晶固体样品平铺置于70℃烘箱，放置2-3h进行烘干，获得烘干固体样品即为2'-脱氧腺苷粗品，对其进行HPLC检测，纯度为98.90%（如图13）；

E)制备2'-脱氧腺苷纯品，先将预冷至温度为10℃的10mM NaOH溶液加入到由步骤D）得到的2'-脱氧腺苷粗品中，该NaOH溶液与2'-脱氧腺苷粗品的体积质量比为20∶1，再在温度为10℃的低温环境下进行搅拌100min进行洗杂，然后除去液体，得到固体物并干燥处理，得到2'-脱氧腺苷纯品。对抽出的废液进行HPLC检测，计算碱洗损失率为2.2%左右。将得到的固体物质放置70度烘箱，烘干2-3h，即获得前述2'-脱氧腺苷纯品，整个纯化工艺收率为85.1%。 对获得的2'-脱氧腺苷纯品进行HPLC检测，纯度为99.99%，纯度接近100%（如图14），核磁检测结果证明获得的纯品为2'-脱氧腺苷。

序列表

<110> 苏州汇涵医用科技发展有限公司

<120> 一种利用酶催化制备2'-脱氧腺苷纯品的方法

<130> 1

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 477

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgaacaaga aaaagaccct gtacttcggt gcgggctggt ttaacgaaaa acagaacaag 60

gcgtataaag aagcgatggc ggcgctgaag gagaacccga ccgtggacct ggaaaacagc 120

tacgttccgc tggagaacca atataaaggt atccgtattg acgaacaccc ggagtacctg 180

cacgatatcg agtgggcgag cgcgacctat cacaacgacc tggtgggtat taagaccagc 240

gatgtgatgc tgggcgttta cctgccggag gaagaggatg ttggtctggg catggaactg 300

ggttacgcgc tgagccaggg caagtatatc ctgctggtga ttccggacga ggattatggt 360

aaaccgatca acctgatgag ctggggcgtt tgcgacaacg cgatcaagat tagcgaactg 420

aaagacttcg attttaacaa accgcgttac aacttctatg atggcgcggt gtactaa 477

<210> 2

<211> 158

<212> PRT

<213> Lactobacillus helveticus

<400> 2

Met Asn Lys Lys Lys Thr Leu Tyr Phe Gly Ala Gly Trp Phe Asn Glu

1 5 10 15

Lys Gln Asn Lys Ala Tyr Lys Glu Ala Met Ala Ala Leu Lys Glu Asn

20 25 30

Pro Thr Val Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Val Pro Leu Glu Asn Gln Tyr

35 40 45

Lys Gly Ile Arg Ile Asp Glu His Pro Glu Tyr Leu His Asp Ile Glu

50 55 60

Trp Ala Ser Ala Thr Tyr His Asn Asp Leu Val Gly Ile Lys Thr Ser

65 70 75 80

Asp Val Met Leu Gly Val Tyr Leu Pro Glu Glu Glu Asp Val Gly Leu

85 90 95

Gly Met Glu Leu Gly Tyr Ala Leu Ser Gln Gly Lys Tyr Ile Leu Leu

100 105 110

Val Ile Pro Asp Glu Asp Tyr Gly Lys Pro Ile Asn Leu Met Ser Trp

115 120 125

Gly Val Cys Asp Asn Ala Ile Lys Ile Ser Glu Leu Lys Asp Phe Asp

130 135 140

Phe Asn Lys Pro Arg Tyr Asn Phe Tyr Asp Gly Ala Val Tyr

145 150 155