一种蛹虫草发酵提取液的制备方法及所得产品和应用
阅读说明：本技术 一种蛹虫草发酵提取液的制备方法及所得产品和应用 (Preparation method of cordyceps militaris fermentation extract, product obtained by preparation method and application of product ) 是由 孙劭靖 杨旭 陆震 毛华 马良 温亮亮 石艳丽 郭学平 于 2020-07-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种蛹虫草发酵提取液的制备方法及所得产品和应用,该方法将乳酸菌在以蛹虫草为氮源的发酵培养基中进行发酵培养,得到蛹虫草发酵提取液。本发明通过选择合适的菌种和培养基,使微生物最大限度的利用分解蛹虫草粉释放有效成分；经微生物分解后的虫草素含量稳定,虫草酸含量与提取法相比提高6-8倍；提取液中既包含蛹虫草的功效成分,又包含乳酸菌发酵产生的一些活性物质,二者结合协同增效,使蛹虫草发酵提取液的营养物质、营养密度及生理活性大幅度提高,其价值远远超过了蛹虫草或乳酸菌发酵提取物本身,是天然优质的护肤产品、食品或保健品原料。(The invention discloses a preparation method of cordyceps militaris fermentation extract, an obtained product and application. The invention makes the microorganism utilize and decompose the cordyceps militaris powder to the maximum extent to release the effective components by selecting proper strains and culture media; the cordycepin content after microbial decomposition is stable, and the cordycepic acid content is improved by 6-8 times compared with that of an extraction method; the extract not only contains the functional components of the cordyceps militaris, but also contains some active substances generated by lactobacillus fermentation, and the two substances are combined for synergistic interaction, so that the nutrient substances, the nutrient density and the physiological activity of the cordyceps militaris fermentation extract are greatly improved, the value of the cordyceps militaris fermentation extract is far higher than that of the cordyceps militaris or lactobacillus fermentation extract, and the cordyceps militaris fermentation extract is a natural high-quality skin care product, food or health care product raw material.)
技术领域
本发明涉及一种蛹虫草发酵提取液的制备方法，具体涉及一种以乳酸菌为发酵菌株、在以蛹虫草为唯一氮源的发酵培养基中进行发酵制备蛹虫草发酵提取液的方法，还涉及到所得的蛹虫草发酵提取液及该蛹虫草发酵提取液的应用。
背景技术
蛹虫草为子囊菌门，肉座目，麦角菌科、虫草属的模式种。学名为Cordycepsmilitaris，又名北冬虫夏草、北虫草，简称蛹草，一般把活体虫蛹培养的北虫草称为蛹虫草。蛹虫草世界性分布，天然资源数量很少。蛹虫草中的主要活性成分有虫草素、虫草酸、虫草多糖。虫草素(cordycepin)又称虫草菌素、蛹虫草菌素、3-脱氧腺苷，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素。蛹虫草中所含有的虫草素因其特有的抗菌抗病毒功效，能明显抑制多种炎性因子。虫草酸是蛹虫草的另一个重要质量指标，虫草酸具有抗自由基、抗氧化、利尿脱水、镇咳、祛痰平喘的作用，中医认为，虫草酸入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。虫草多糖具有抗炎性、抗氧化性，可提高免疫力、降糖活性、抗肿瘤、抗辐射等。
蛹虫草已被广泛添加到化妆品和保健食品中，现今，蛹虫草的使用方法大多是以蛹虫草为原料提取出其中的有效成分，或者以蛹虫草活体为菌种，通过发酵的方法得到蛹虫草提取物或其单一的有效成分。如专利CN 107602660 A公开了一种蛹虫草多肽制品及其制备方法与应用，该专利将蛹虫草原料添加提取液并研磨得到匀浆液，离心并过滤，然后用酶制剂水解得到多肽制品。通过此方法制备的蛹虫草多肽制品，多应用于保健食品或美容护肤品中。但此方法需要大量的酶。如专利CN 109136112 A和CN 109294927 A公开了提高蛹虫草中虫草素和虫草多糖的方法，这两个专利仅研究了提高某一成分的方法及其应用。
目前，现有技术中对蛹虫草中有效成分的利用都比较单一，利用率较低，无法充分发挥蛹虫草的作用。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种蛹虫草发酵提取液的制备方法，也可以称之为一种蛹虫草的利用方法，该方法以蛹虫草粉为氮源，将其与其他成分配成发酵培养基，然后对乳酸菌进行发酵培养，得到蛹虫草发酵提取液。经过该方法的处理，蛹虫草整体都得到了充分的利用，发酵提取液中的营养成分丰富。
目前未见用乳酸菌在蛹虫草为唯一氮源的发酵培养基中进行发酵培养的相关报道。本发明通过选择合适的菌种及培养基，缩短了生产周期、提高了蛹虫草的利用率，所得发酵提取液中虫草素、虫草酸、氨基酸等活性物质的含量均较高；且产品稳定，利于后期纯化。
本发明具体技术方案如下：
一种蛹虫草发酵提取液的制备方法，该方法是：将乳酸菌在以蛹虫草为氮源的发酵培养基中进行发酵培养，得到蛹虫草发酵提取液，所述以蛹虫草为氮源的发酵培养基包括以下组分：蛹虫草粉 5-10 g/L，葡萄糖5g/L，果糖15-20g/L，乙酸钠3-8 g/L，硫酸镁 1-3 g/L，水余量。
进一步的，上述发酵培养基中，当蛹虫草粉为8-10 g/L、果糖18g/L时，从效果上看最佳。当乙酸钠3-8 g/L时，随着乙酸钠含量的增加，提取液中有效成分有增加的趋势，但是乙酸钠含量5-8g/L时效果相当，因此优选乙酸钠5 g/L。当硫酸镁 1-3 g/L时，随着硫酸镁含量的增加，提取液中有效成分有增加的趋势，但是硫酸镁含量2-3g/L时效果相当，因此优选乙酸钠2 g/L。
优选的，当以蛹虫草为氮源的发酵培养基选择以下含量时，效果更佳：蛹虫草粉8-10 g/L，葡萄糖5g/L，果糖15-20g/L，乙酸钠5-8 g/L，硫酸镁 2-3 g/L，水余量。
更优选的，当以蛹虫草为氮源的发酵培养基选择以下含量时，效果最佳：蛹虫草粉8 g/L，葡萄糖5g/L，果糖18g/L，乙酸钠5 g/L，硫酸镁2 g/L，水余量。
上述制备方法中，具体包括以下步骤：
（1）将乳酸菌进行种子培养，获得种子液；
（2）将种子液接入以蛹虫草为氮源的发酵培养基中，通气搅拌培养，发酵至无残糖时结束发酵，获得发酵液；
（3）将发酵液进行处理，得到蛹虫草发酵提取液。
进一步的，所述蛹虫草粉指的是天然的蛹虫草子实体经过干燥、粉碎而成的粉末，粉末的粒径无特殊要求，一般在40目或以下。蛹虫草原料中含有虫草素、虫草酸和虫草多糖等多种活性成分。
进一步的，所述乳酸菌现有技术中公开的各种乳酸菌品种，例如乳酸杆菌、明串珠菌、双歧杆菌等， 优选为乳酸杆菌。各乳酸菌可以从市场上购买得到。
进一步的，步骤（1）中，乳酸菌可以从公开的现有技术中选择合适的种子培养基和种子培养条件，以得到发酵培养所需要的种子液。种子培养的条件，例如温度、pH等选择各菌种最适宜的条件即可。
进一步的，步骤（2）中，种子液按照5-10%的接种量接入以蛹虫草为氮源的发酵培养基中，进行发酵培养，发酵过程中不控pH值，残糖耗尽即可终止发酵。发酵培养温度和培养pH为各菌种的最适宜温度和pH，例如乳酸菌的发酵培养温度保持在37℃左右，pH保持在6.2-6.6左右，培养过程中进行通气搅拌，通气量为0.3-0.6vvm。
进一步的，步骤（3）中，发酵结束后，将发酵液依次进行加热灭菌、调整pH、过滤的操作，得到蛹虫草发酵提取液。灭菌在60-70℃进行，加热时间大约1-2h。pH调整至5.0-6.0。过滤一般采用孔径为0.45μm的滤膜。
本发明对于按照上述方法得到的蛹虫草发酵提取液也进行保护。该蛹虫草发酵提取液营养丰富，活性高，富含虫草素和虫草酸，是一种很好的食品、保健品和化妆品的原料。
本发明采用微生物乳酸菌为菌种，利用蛹虫草粉发酵制备蛹虫草发酵提取液，蛹虫草粉作为氮源，微生物最大限度的利用分解了蛹虫草粉，释放了其中的各种有效成分，使蛹虫草中的各种有效成分都进入到发酵提取液中，提高了蛹虫草的利用率。除此之外，经微生物分解后，还会代谢出其他多种活性产物，如多种小分子必需氨基酸、乳酸、甾醇、植酸、维生素等。发酵后得到的蛹虫草发酵提取液中营养成分非常丰富，微生物发酵与蛹虫草的结合具有很好的协同增效作用，使蛹虫草发酵提取液的营养物质、营养密度及生理活性大幅度提高，其价值远远超过了蛹虫草或微生物发酵本身。
进一步的，本发明得到的蛹虫草发酵提取液具有以下作用：1、具有软化角质层的作用，能够很好的发挥光滑嫩肤效果，特别适合头皮去屑和油性肌肤使用；2、具有非常好的保湿、滋润肌肤的效果，能防止水分的流失，在肌肤表层形成保护膜；3、具有美白的效果：能抑制黑色素的沉淀、有效改善雀斑、色斑等的形成，使肌肤更加的美白透亮，能促进细胞新陈代谢的速度，使肌肤细胞迅速的更新；4、具有杀菌防腐的作用，可以防止细菌对肌肤的入侵，调节肌肤pH值。与目前现有技术中报道的蛹虫草类产品相比，本发明蛹虫草发酵提取液制备周期短、成本低，成分丰富，功效多元化，具有更好的应用价值。
进一步的，本发明蛹虫草发酵提取液中，虫草素含量为40-90mg/L，虫草酸含量为14-17g/L，总氨基酸含量为1-2.5g/L。
进一步的，本发明还提供了上述蛹虫草发酵提取液在保健品、食品或化妆品中的应用。
进一步的，本发明还提供了一种保健品、食品或化妆品，该保健品、食品或化妆品中含有本发明的蛹虫草发酵提取液。
本发明具有以下优点：
1、本发明以蛹虫草粉作为唯一的氮源，通过选择合适的菌种和发酵培养基配方，使微生物最大限度的利用、分解蛹虫草粉，充分释放了蛹虫草中的有效成分。
2、经微生物分解后虫草素含量稳定，与提取法得到的虫草素含量基本一致，虫草酸含量比提取法提高6-8倍。
3、提取液中既包含蛹虫草的功效成分，又包含微生物发酵产生的一些活性物质，二者结合协同增效，使蛹虫草发酵提取液的营养物质、营养密度及生理活性大幅度提高，其价值远远超过了蛹虫草或微生物发酵提取物本身。
4、本发明工艺简单，生产周期短，便于操作，经过简单的微生物分解代谢及纯化工艺即可制备出活性物含量较高的蛹虫草发酵提取液，产品质量稳定，是一种优质的食品、保健品或化妆品原料。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
下述实施例中，所用乳酸杆菌为市购产品。所述蛹虫草粉来自于市购蛹虫草子实体经干燥、粉碎得到，粒径约40目左右。
实施例1
（1） 种子液制备
将乳酸杆菌接入液体MRS培养基中， pH值为6.2-6.6，37℃下静置摇瓶培养2天，获得种子液；
（2）发酵培养
将种子液按照5wt%的接种量接入5L发酵罐中，发酵培养基配方为：蛹虫草粉 8g/L，葡萄糖5g/L，果糖18g/L，乙酸钠5 g/L，硫酸镁 2g/L，水余量，pH值为6.2-6.6。接入后，在37℃下通气搅拌培养，转速200 r/min，通气量为0.5vvm，发酵过程不控pH值，发酵至无残糖时结束发酵，获得发酵液；
（3）发酵液后处理
将发酵液在65℃水浴加热1h，然后调节pH值为5.0-6.0，过0.45 um的滤膜，得蛹虫草发酵提取液S1。
实施例2
按照实施例1的方法制备蛹虫草发酵提取液，不同的是：发酵培养基中葡萄糖5g/L，果糖15g/L。所得蛹虫草发酵提取液记为蛹虫草发酵提取液S2。
实施例3
按照实施例1的方法制备蛹虫草发酵提取液，不同的是：发酵培养基中葡萄糖5g/L，果糖20g/L。所得蛹虫草发酵提取液记为蛹虫草发酵提取液S3。
实施例4
按照实施例1的方法制备蛹虫草发酵提取液，不同的是：发酵培养基中蛹虫草粉的含量5g/L。所得蛹虫草发酵提取液记为蛹虫草发酵提取液S4。
实施例5
按照实施例1的方法制备蛹虫草发酵提取液，不同的是：发酵培养基中蛹虫草粉的含量10g/L。所得蛹虫草发酵提取液记为蛹虫草发酵提取液S5。
对比例1
按照实施例1的方法制备蛹虫草发酵提取液，不同的是：发酵培养基中葡萄糖5g/L，果糖10g/L。所得蛹虫草发酵提取液记为蛹虫草发酵提取液D1。
对比例2
按照实施例1的方法制备蛹虫草发酵提取液，不同的是：发酵培养基中葡萄糖5g/L，果糖25g/L。所得蛹虫草发酵提取液记为蛹虫草发酵提取液D2。
对比例3
按照实施例1的方法制备蛹虫草发酵提取液，不同的是：发酵培养基中蛹虫草粉的含量3g/L。所得蛹虫草发酵提取液记为蛹虫草发酵提取液D3。
对比例4
按照实施例1的方法制备蛹虫草发酵提取液，不同的是：发酵培养基中蛹虫草粉的含量15g/L。所得蛹虫草发酵提取液记为蛹虫草发酵提取液D4。
对比例5
提取法制备蛹虫草提取液：取蛹虫草粉8g，加入50-70wt%的乙醇溶液，料液比为1g：20-30ml，而后在20-30℃水浴中振荡提取2-3h，提取完成后，进行过滤，获得滤液；对滤液进行除醇浓缩，并进行离心，获取上清液；将上清液以1.5-2.5BV/h的流速上大孔吸附树脂柱，用25-35wt%的乙醇以0.5-1.5BV/h的流速进行解吸，收集解吸液，得蛹虫草提取液D5。
对比例6
按照实施例1的方法制备发酵提取液，不同的是：发酵培养基的成分为：蛋白胨 8g/L，葡萄糖5g/L，果糖18g/L，乙酸钠5 g/L，硫酸镁 2g/L，水余量，pH值为6.2-6.6。所得样品记为D6。
对比例7
按照实施例1的方法制备发酵提取液，不同的是：发酵培养基的成分为：酵母粉 10g/L，虫草粉8g/L，葡萄糖5g/L，果糖18g/L，水余量，pH值为7.0左右。以酵母菌（市面购买）为发酵菌株，所得蛹虫草发酵提取液记为蛹虫草发酵提取液D7。
试验例1 蛹虫草发酵提取液中氨基酸含量
对各实施例和对比例中制备的发酵提取液样品中所含氨基酸含量及种类进行分析，以实施例1中的液体MRS培养基为对照，采用氨基酸自动分析仪进行，结果如表1所示。
根据上表1的数据可知，本发明实施例的样品中氨基酸含量稳定在1g/L以上，且检测出了羟脯氨酸、脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸4种新的氨基酸。而对比例D3、D5和D6的各样品中氨基酸含量明显低于各实施例的样品，且氨基酸的种类也低于实施例的样品。S1，S5和D4的氨基酸含量差别不大，说明原液中的氨基酸成分主要来源于虫草粉，同时，微生物的代谢分解能力有限，虫草的添加量过高和过低都会影响氨基酸的含量，由此可以见，本发明发酵提取液中氨基酸的含量大幅度增加，总氨基酸的含量相较于提取法和单独的乳酸菌发酵提取液增加了3-6倍。这说明经过发酵后活性物质增加了。
试验例2 蛹虫草发酵提取液中虫草素的含量
对各实施例和对比例中制备的发酵提取液样品中虫草素含量进行测定，具体步骤如下：
样品制备：各实施例和对比例的蛹虫草发酵提取液，稀释10倍。
标准样品制备：准确称取标准品虫草素1 mg，加入50 mL蒸馏水溶解，转移至100mL容量瓶中，加水至刻度，用之前稀释10倍。
色谱条件：在液相色谱仪上进行检测，柱子：CAPCELL PAK-C18 column，流动相为0. 04M磷酸二氢钾和5%乙腈，流速为1.0ml/min，柱温35℃。检测波长为260nm，进样量10ul。
测定：根据峰面积计算虫草素含量，结果如下表2所示。
从上表可知，各实施例中虫草素的含量由虫草粉的添加量决定，通过实施例1、4、5和对比例3、4的对比可以看出，虫草素随着虫草粉的添加量增加而增加，但当虫草的添加量过高时，因为微生物的代谢分解能力有限，虫草素的释放增幅减小。通过实施例1和对比例5的对比可以看出，提取法比本发明方法制备的蛹虫草发酵提取液中虫草素的含量低，是由于提取法步骤繁琐，会造成虫草素的流失。通过实施例1、对比例6、7的对比可以看出，虫草素主要来源于虫草粉，与菌株的分解能力有一定的相关性但与代谢生产能力无关。
据文献报道，虫草素溶于水，容易从虫草里分离，本发明微生物分解法能够最大限度的将虫草素从虫草粉中分离出来，同时又不消耗虫草素，使虫草素得到最大限度的积累。
试验例3 蛹虫草发酵提取液中虫草酸的含量
1.试剂配制：
Nash试剂：需新鲜配置。精确称取乙酸铵150g，用蒸馏水溶解，加入2mL冰醋酸，2mL乙酰丙酮，定容至1000ml。
0.015mol/L高碘酸钠溶液：精确称取3.2g高碘酸钠溶于0.12mol/L的盐酸中。
0.1%的L-鼠李糖：精确称取0.1gL-鼠李糖，蒸馏水溶解，定容至100ml。
虫草酸标准液的配制（储备）：称取虫草酸标准品100mg，溶于蒸馏水中，定容至100ml，即为1mg/ml虫草酸标准溶液。用时，稀释十倍。
供试品溶液：各实施例和对比例的蛹虫草发酵提取液，稀释200倍。
2. 测定方法：
（1）虫草酸标准曲线样品体系
将虫草酸标准液与水按照上表混合，然后分别加入高碘酸钠溶液1ml，混匀，室温放置10min，每个试管加0.1%鼠李糖2ml以除去过多的高碘酸钠，震荡混匀后，加入4ml新鲜配置的Nash试剂，于53℃水浴中，保温15min，之后快速冷却至室温。412nm测吸光值，绘制虫草酸含量（ug/ml）与A412的标准曲线。
（2）样品检测
取各供试品溶液50ul定容到100ml容量瓶中，然后取1ml放入具塞试管中，空白对照加水1ml，然后加入高碘酸钠溶液1ml，混匀，室温放置10min，每个试管加0.1%鼠李糖2ml以除去过多的高碘酸钠，震荡混匀后，加入4ml新鲜配置的Nash试剂，于53℃水浴中，保温15min，之后快速冷却至室温。412nm测吸光值。将吸光值带入标准曲线，然后乘以稀释倍数，得到虫草酸含量，结果如下表4所示。
从上表可知，各实施例中虫草酸由乳酸杆菌利用碳源代谢产生，通过实施例1、2、3和对比例1、2的对比可以看出，虫草酸的含量随着果糖添加量的增加而增加，但果糖添加量太高时，虫草酸含量不再显著增加。通过实施例1和对比例5的对比可以看出，提取法比本发明方法制备的蛹虫草发酵提取液中虫草酸的含量显著降低，这是由于提取法所得提取液中虫草酸的含量本身就很低。通过实施例1、对比例6和对比例7的对比可以看出，虫草酸主要来源于微生物的代谢合成，少量存在于虫草粉，乳酸菌能够最大限度的利用碳源产生虫草酸，而酵母菌发酵提取物中虫草酸的含量与对比例D5差别不大，说明其主要来源还是虫草粉。综上，乳酸菌分解蛹虫草发酵提取液里不但含有原料蛹虫草中的虫草酸还含有微生物利用营养成分代谢产生的虫草酸，致使发酵制备的虫草发酵提取液与提取法制备的提取液相比，虫草酸含量提高6-8倍。
试验例4 蛹虫草发酵提取液对皮肤的改善作用
1、美白功效实验
以蛹虫草发酵提取液S1、S2、S3为试验样品，以蛹虫草提取液D5和样品D6为对照，测定不同样品对细胞黑色素生成的抑制，方法如下：
（1）对B16小鼠黑色素瘤细胞增殖的影响
取处于对数生长期的B16小鼠黑色素瘤细胞，以2×104个/mL密度接种于96孔细胞培养板，每孔100μL细胞悬液，置二氧化碳培养箱37℃、5% CO2常规培养过夜。样品用含血清完全培养基配制成1.5%的（v/v）浓度，0.22µm滤膜过滤除菌。弃去旧培养液，实验组加入1.5%（v/v）的样品，正常对照组加入等量的含血清细胞培养液，继续培养24h后，采用WST-1法检测细胞相对增殖率。相对增殖率（RGR）为样品组吸光度与正常对照组吸光度的比值。
（2）黑色素含量检测
取对数生长期B16细胞，以2×104个/mL密度接种于6孔培养板，每孔3mL，置二氧化碳培养箱37℃、5%CO2培养24h，弃去旧培养液，正常对照组加入3mL含血清完全培养基，实验组加入3mL样品溶液，对照组和实验组每孔再加入60μL毛喉素溶液（2mM），以刺激黑色素的产生，继续培养72h。
细胞内黑色素含量的测定方法如下：胰酶消化，离心去上清，加入1mol/L（含10%DMSO）的NaOH溶液500uL裂解细胞，80℃加热30min后，3000rpm离心10min，取上清加入96孔板，100uL/孔，测定450nm吸光度，从而获得黑色素总量，以对照组黑色素含量为100%，获得实验组黑色素含量的相对值及抑制率，若样品对B16细胞的增殖有显著影响，则黑色素含量相对值与对应的B16细胞增殖率之比，即为单位细胞黑色素生成量的变化率。
（3）实验结果
细胞相对增殖率以及蛹虫草发酵提取物对黑色素含量的影响如下表5所示。
如上述结果所示，在1.5%（v/v）浓度下，所有样品均对小鼠黑色素瘤细胞B16的增殖有一定抑制作用，S1、S2和S3对黑色素总量的抑制率相当（45%-55%），但与D5和D6相比，S1、S2和S3对细胞的黑色素分泌水平抑制作用更显著，D5和D6对黑色素瘤细胞都具有增殖抑制作用，说明乳酸发酵提取液和蛹虫草提取物都具有一定的美白的功效，但效果相较于实施例有所降低，经过乳酸菌分解代谢蛹虫草后制备的发酵提取液对黑色素瘤细胞的增殖抑制作用更显著，由此可推断，乳酸菌利用蛹虫草进行发酵，所得的发酵液不仅使蛹虫草粉中的营养物质得到了最大程度的释放，乳酸菌在发酵过程中可能也代谢出了一些采用其他氮源所没有的物质，或者是蛹虫草成分和乳酸菌发酵成分的结合在皮肤美白方面达到了协同增效的作用。
、抗炎功效实验
以蛹虫草发酵提取液S1、S2、S3为试验样品，以D5和D6为对照，在1.5%（v/v）浓度下，测定不同样品对促炎性因子的抑制作用。
采用小鼠巨噬细胞模型，用LPS刺激其产生炎性因子，考察样品是否能抑制炎性因子的分泌。LPS用无血清1640培养液配制浓度为50万单位/mL的母液，0.22µm滤膜过滤除菌，-20℃冰箱保存，临用前稀释成1万单位/mL 的作用液。与细胞接触的样品用LPS作用液配制。
取处于对数生长期的Raw264.7细胞以1×105/mL接种于24孔板，在 37℃、5% CO2条件下培养24h，加入样品，每孔1mL，模型组加入不含样品的LPS作用液，阴性对照组加入不含LPS的无血清1640培养液，继续培养24h，根据小鼠IL-6、TNF-α、IL-1β的ELISA检测试剂盒说明书测定培养上清中炎性因子的含量。采用下式计算各样品对炎性因子的抑制率：
抑制率（%）=100%-（样品组炎性因子含量-阴性对照组炎性因子含量）/（模型组炎性因子含量-阴性对照组炎性因子含量）*100%。
结果如表6所示，在LPS的刺激下，小鼠巨噬细胞分泌的IL-6和TNF-α促炎性因子显著增加，而IL-1β增加的量很少。以这三种炎性因子为考察指标，所有样品对小鼠IL-6、TNF-α、IL-1β三种炎性因子均有一定的抑制作用，而D6抗炎效果最不显著，S1、S2和S3对三种炎性因子的抑制率分别达到69-71%、86-91%、50-55%，与D5和D6相比，S1、S2和S3对促炎因子的抑制作用更显著。
、清除自由基功效实验
以蛹虫草发酵提取液S1、S2、S3为试验样品，以D5和D6为对照，测定不同样品对自由基的清除能力，方法如下：
（1）溶液的配制 ：
8.8mM的过氧化氢：精确称取0.0997g过氧化氢，用纯化水定溶于100mL棕色容量瓶。
9mM的硫酸亚铁：精确称取0.2502g硫酸亚铁，用纯化水定溶于100mL棕色容量瓶。
9mM的水杨酸-乙醇：精确称取0.1243g水杨酸，用无水乙醇定溶于100mL棕色容量瓶。
样品溶液的制备：精确吸取各制备样品5mL，加纯化水定容至100mL。
（2）试验方法
取试管若干只，用移液管加入9mM硫酸亚铁0.2mL，9mM水杨酸-乙醇溶液0.2mL，各样品溶液3.0mL，最后加8.8mM的过氧化氢溶液0.25mL启动反应。37℃反应30分钟，以纯化水作为参比，在510nm处测定光吸收值。按下式计算 ·OH自由基清除率。
（3）结果计算
从上表可以看出，S1，S2和S3能够清除·OH自由基，·OH自由基的清除率能够维持在55%-65%左右，但是提取法制备的D5和乳酸杆菌发酵提取液D6虽然也能够清除·OH自由基，但是清除率只在37.16%和6.44%，效果较差。由此可推断，微生物利用蛹虫草进行发酵，所得的发酵液不仅使蛹虫草粉中的营养物质得到了最大程度的释放，乳酸杆菌在发酵过程中可能也代谢出了一些采用其他氮源所没有的物质，或者是蛹虫草成分和乳酸杆菌发酵成分的结合对自由基的清除达到了协同增效的作用。