一种提高腺苷发酵产量的方法
阅读说明：本技术 一种提高腺苷发酵产量的方法 (Method for improving adenosine fermentation yield ) 是由 曹华杰 刘小都 孙超超 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种提高腺苷发酵产量的方法,属于发酵工程技术领域。本发明方法以枯草芽孢杆菌为生产菌株,发酵培养基通过添加一定量的酵母浸粉和异亮氨酸,使发酵后期腺苷产量持续增长,从而使腺苷的产量提高至60.7g/L,与未使用该方法相比产量提高43.5%。该方法不仅可以提高腺苷的产量,发酵过程简单无需补料,减少染菌几率,非常适合工业化生产。(The invention relates to a method for improving adenosine fermentation yield, and belongs to the technical field of fermentation engineering. According to the method, bacillus subtilis is taken as a production strain, and a certain amount of yeast extract powder and isoleucine are added into a fermentation medium, so that the adenosine yield is continuously increased in the later fermentation period, the adenosine yield is increased to 60.7g/L, and the adenosine yield is increased by 43.5% compared with that in the case of not using the method. The method can improve the yield of adenosine, has simple fermentation process without material supplement, reduces the probability of bacterial contamination, and is very suitable for industrial production.)
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体地，涉及一种提高腺苷发酵产量的方法。
背景技术
腺苷又称腺嘌呤核苷，纯品为白色结晶粉末，无臭，味苦。腺苷分子式C10H13N5O4，分子量为267.24。腺苷属于重要的核苷酸衍生物，是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物。作为一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢。腺苷在生物化学上扮演重要角色，包括以腺苷三磷酸（ATP）或腺苷双磷酸（ADP）形式转移能量，或是以环状腺苷单磷酸（cAMP）进行信号传递等。此外，腺苷还是一种抑制性神经传导物，在神经传递中起重要作用。
随着腺苷作用范围的不断扩大，其市场需求也在不断增长，腺苷的生产方法主要有化学合成法、酶法、发酵法，而目前国内腺苷的生产主要是化学法和酶法，成本高、污染严重，推广应用受到严重的限制。发酵法生产腺苷的具有反应条件温和，成本低，绿色、清洁、环保等优势。因此，在低碳环保的形势下，使用发酵法生产腺苷，优化腺苷的发酵工艺，进一步提高腺苷的产量，具有重要的意义。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种提高腺苷发酵产量的方法，所述方法是在培养基中添加酵母浸粉和异亮氨酸为菌体生长发酵提供足够的营养成分，延长菌体的稳定生长期，有利于后期腺苷高效合成，实现提高腺苷发酵产量的目的。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
一种提高腺苷发酵产量的方法，包括以下步骤：
步骤一、斜面培养：以枯草芽孢杆菌为出发菌株，接种至斜面固体培养基中进行活化，28~32℃培养15~20h；
步骤二、种子培养：用接种环刮取斜面固体培养上的菌种并接种至种子培养基，30~36℃，200~500rpm培养8~10h，得到发酵种子液；
步骤三、发酵培养：将步骤二所得发酵种子液按12~15%的接种量转接至装有发酵培养基的发酵罐中，33~36℃，溶氧维持在20~30%，用NH3·H2O调节pH控制在6.6~7.0，培养时间40~50h；
所述的液体发酵培养基，以g/L计，包含以下组分：葡萄糖80~120，玉米浆30~50mL/L，酵母浸粉3~5，多糖茸精5~10，味精3~5，K2HPO4,1~3，异亮氨酸0.1~0.2，黄嘌呤0.1~0.2，次黄嘌呤0.1~0.2，MgSO4·7H2O1~5，MnSO40.03~0.06和FeSO4·7H2O 0.03~0.06。
进一步地，步骤一所述的斜面固体培养基，以g/L计，包含以下组分：葡萄糖1~3，蛋白胨5~10，酵母粉2~5，黄嘌呤0.1~0.15和琼脂20~30，pH7.0~7.2。
进一步地，步骤二所述的种子培养基，以g/L计，包含以下组分：葡萄糖15~20，玉米浆15~25mL/L，蛋白精粉5~10，酵母粉5~10，KH2PO40.5~1.5，MgSO4·7H2O 0.2~0.8，黄嘌呤0.1~0.15和组氨酸0.01~0.05，pH6.5~7.0。
有益效果：
本发明以枯草芽孢杆菌XGL为发酵菌种，对发酵培养基进行了优化，在50L发酵罐小试的基础上添加酵母浸粉和异亮氨酸，延长代谢产物的生产时间，提高腺苷的产量。
（1）与传统的化学法和酶法相比，生产设备简单，绿色污染小，符合当前的低碳环境，成本低，适合大规模生产。
（2）本发明使用的微生物菌株，遗传标记稳定不易丢失，传十代以上转接，产量基本保持稳定。
（3）本发明通过在发酵罐底料中添加酵母浸粉和氨基酸，使腺苷的生产强度提高，达到60.7g/L，与未添酵母浸粉和异亮氨酸相比，产量提高43.5%。
具体实施方式
一种提高腺苷发酵产量的方法，通过添加酵母浸粉和异亮氨酸提高腺苷发酵产量，该方法采用分批补料的方式发酵生产腺苷，发酵菌株采用枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）XGL（该菌株已于2011年12月31日在中国生物工程杂志公开发表，文章为《过表达purA基因对腺苷积累的影响》，现保藏于天津科技大学生物工程学院菌种保藏中心）。
本发明方法的具体操作包括以下过程：
步骤1斜面培养：以枯草芽孢杆菌XGL为出发菌株，接种至活化斜面，28~32℃培养15~20h；
步骤2种子培养：用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，30~36℃，200~500rpm培养8~10h，作为发酵种子液；
步骤3发酵培养：按12~15%的接种量转接至装有发酵培养基的发酵罐中，33~36℃，溶氧维持在20~30%，用NH3·H2O调节pH控制在6.6~7.0，培养时间40~50h。
其中，所述的斜面固体培养基，包含以下组分以g/L计：葡萄糖1~3，蛋白胨5~10，酵母粉2~5，黄嘌呤0.1~0.15，琼脂20~30，pH7.0~7.2；
所述的种子培养基，包含以下组分以g/L计：葡萄糖15~20，玉米浆15~25mL/L，蛋白精粉5~10，酵母粉5~10，KH2PO40.5~1.5，MgSO4·7H2O0.2~0.8，黄嘌呤0.1~0.15，组氨酸0.01~0.05，pH6.5~7.0；
所述的液体发酵培养基，包含以下组分以g/L计：葡萄糖80~120，玉米浆30~50mL/L，酵母浸粉3~5，多糖茸精5~10，味精3~5，K2HPO4,1~3，异亮氨酸0.1~0.2，黄嘌呤0.1~0.2，次黄嘌呤0.1~0.2，MgSO4·7H2O1~5，MnSO40.03~0.06，FeSO4·7H2O0.03~0.06。
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域的技术人员能够理解，这些具体实例所描述的具体的物料比、工艺条件及其结果仅用于本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
以下各实施例中发酵产物腺苷含量所采用的分析方法如下：
发酵液中产物腺苷采用仪器Agilent1100高效液相色谱仪测定（HPLC）。色谱柱为KromasilC18柱(250mm×416mm i.d.，5μm)，柱温30℃，检测器为紫外检测器（259nm），流动相为水：乙腈=90：10；流速1.0ml/min；进样量20μL。精确称取腺苷的标准品，用去离子水配置成质量浓度为1g/L的标准品溶液；将预处理的待测发酵液样品用去离子水稀释至适当的浓度，并用0.22μm微孔滤膜过滤，作为发酵样品溶液待检测，发酵样品根据峰面积计算腺苷产量。
实施例1：
斜面培养基配方以g/L计：葡萄糖2，蛋白胨5，酵母粉5，黄嘌呤0.1，琼脂20，pH7.0；
种子培养基配方以g/L计：葡萄糖20，玉米浆20mL/L，蛋白精粉10，酵母粉5，KH2PO41，MgSO4·7H2O0.5，黄嘌呤0.15，组氨酸0.05，pH7.0；
发酵培养基以g/L计：葡萄糖80，玉米浆40mL/L，多糖茸精6，酵母浸粉5，味精4，K2HPO43，黄嘌呤0.15，次黄嘌呤0.2，MgSO4·7H2O1，MnSO40.05，FeSO4·7H2O0.05。
以枯草芽孢杆菌XGL为出发菌株，接种至活化斜面，30℃培养18h后，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，36℃，200rpm培养9h;按15%（v/v）的接种量转接至装有发酵培养基的50L发酵罐中，36℃，溶氧维持在20~30%，用NH3·H2O调节pH，pH维持在6.4，在线监测发酵液中葡萄糖残留量，当其下降至为10g/L，流加葡萄糖至发酵液维持残糖量为10g/L，发酵40h，腺苷产量达到54.3g/L。
实施例2：
斜面培养基配方以g/L计：葡萄糖2，蛋白胨5，酵母粉5，黄嘌呤0.1，琼脂20，pH7.0；
种子培养基配方以g/L计：葡萄糖20，玉米浆20mL/L，蛋白精粉10，酵母粉5，KH2PO41，MgSO4·7H2O0.5，黄嘌呤0.15，组氨酸0.05，pH7.0；
发酵培养基以g/L计：葡萄糖80，玉米浆40mL/L，多糖茸精6，味精4，K2HPO43，异亮氨酸0.1~0.2，黄嘌呤0.15，次黄嘌呤0.2，MgSO4·7H2O1，MnSO40.05，FeSO4·7H2O0.05。
以枯草芽孢杆菌XGL为出发菌株，接种至活化斜面，30℃培养18h后，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，36℃，200rpm培养9h；按15%（v/v）的接种量转接至装有发酵培养基的50L发酵罐中，36℃，溶氧维持在20~30%，用NH3·H2O调节pH，pH维持在6.4，在线监测发酵液中葡萄糖残留量，当其下降至为10g/L，流加葡萄糖至发酵液维持残糖量为10g/L，发酵40h，腺苷产量达到50.7g/L。
实施例3：
斜面培养基配方以g/L计：葡萄糖2，蛋白胨5，酵母粉5，黄嘌呤0.1，琼脂20，pH7.0；
种子培养基配方以g/L计：葡萄糖20，玉米浆20mL/L，蛋白精粉10，酵母粉5，KH2PO41，MgSO4·7H2O0.5，黄嘌呤0.15，组氨酸0.05，pH7.0；
发酵培养基以g/L计：葡萄糖80，玉米浆40mL/L，多糖茸精6，酵母浸粉5，味精4，K2HPO43，异亮氨酸0.1~0.2，黄嘌呤0.15，次黄嘌呤0.2，MgSO4·7H2O1，MnSO40.05，FeSO4·7H2O0.05。
以枯草芽孢杆菌XGL为出发菌株，接种至活化斜面，30℃培养18h后，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，36℃，200rpm培养9h;按15%（v/v）的接种量转接至装有发酵培养基的50L发酵罐中，36℃，溶氧维持在20~30%，用NH3·H2O调节pH，pH维持在6.4，在线监测发酵液中葡萄糖残留量，当其下降至为10g/L，流加葡萄糖至发酵液维持残糖量为10g/L，发酵40h，腺苷产量达到60.7g/L。
对比例1：
发酵罐未添加酵母浸粉和异亮氨酸的方法进行发酵培养，其他条件均与实施例1的方法相同。最终检测腺苷含量为42.3g/L。
由实施例1和对比例1可以看出，发酵罐添加5g/L的酵母浸粉可以提高腺苷的产量，腺苷产量提高28.4%，这表明添加有机氮源酵母浸粉，可以为菌体生长提供足够的氮源，延长菌体的稳定生长期。通过实施例2和对比例1可以看出，培养基添加异亮氨酸对腺苷的产量影响也比较大，腺苷产量提高20%，异亮氨酸能够提高菌体的活力，提高腺苷的下罐产量。由实施例3和对比例1可以看出，同时添加酵母浸粉和异亮氨酸可以显著提高腺苷的产量，腺苷产量提高43.5%，效果比较明显。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
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