一种鸟嘌呤的合成方法
阅读说明：本技术 一种鸟嘌呤的合成方法 (Synthetic method of guanine ) 是由 朱文佳 王海波 李嫦 张小兰 于 2020-12-28 设计创作，主要内容包括：本发明属于食品微生物、发酵技术领域,具体涉及一种鸟嘌呤的合成方法。其合成步骤主要为：以微生物发酵制备鸟苷发酵液,以鸟苷发酵液合成反应得到鸟嘌呤,通过提取方法制得鸟嘌呤成品。本发明提供了一种简单、高效的合成鸟嘌呤的方案。通过鸟苷为原料,水为溶剂,酸水解鸟苷制备鸟嘌呤。特别是通过酸直接水解微生物发酵制备的鸟苷发酵液,直接得到鸟嘌呤,生产工序大幅减少,生产成本低。由于在生产过程中,水为溶剂,生产环境干净,环保性好。所得的鸟嘌呤成品收率高,纯度高。(The invention belongs to the technical field of food microorganisms and fermentation, and particularly relates to a synthetic method of guanine. The synthesis steps mainly comprise: preparing guanosine fermentation liquor by microbial fermentation, obtaining guanine by guanosine fermentation liquor synthesis reaction, and preparing a guanine finished product by an extraction method. The invention provides a simple and efficient scheme for synthesizing guanine. The preparation of guanine is carried out by taking guanosine as raw material and water as solvent and hydrolyzing guanosine. Particularly, the guanine fermentation liquid prepared by the microbial fermentation is directly hydrolyzed by acid to directly obtain the guanine, the production procedures are greatly reduced, and the production cost is low. In the production process, water is used as a solvent, so that the production environment is clean and the environmental protection property is good. The obtained guanine finished product has high yield and high purity.)
技术领域
本发明属于食品微生物、发酵技术领域，具体涉及一种鸟嘌呤的合成方法。
背景技术
鸟嘌呤主要用作抗病毒药物阿昔洛韦中间体。硫鸟嘌呤、开环鸟嘌呤的中间体。鸟嘌呤的合成方法有：专利文献1：201610436294.1、专利文献2：201810878118.2、专利文献3：201910746229.2、专利文献4：99118145.X、专利文献5：99121054.9、专利文献6：201310022550.9、专利文献7：201810651148.X、专利文献1、3、4、5，采用不同起始化合物为原料制备鸟嘌呤。专利2是回收鸟嘌呤。专利6、7是发酵法生产鸟苷。现有技术方案可分为两类，一是化学合成，质量差，环保压力大，二类是采用鸟苷为原料，通过醋酐与鸟苷反应，制备鸟嘌呤，反应以醋酸为溶剂，必须为无水环境，生产成本高。
发明内容
针对上述技术缺陷，本发明提供一种生产成本低的鸟嘌呤的合成方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种鸟嘌呤的合成方法，其步骤为：
A、以微生物发酵制备鸟苷发酵液；
B、以步骤A制得鸟苷发酵液为原料，用水将鸟苷发酵液分散，所述鸟苷与水的重量比为1：(5-20)，用酸调pH为0.6-1.2，使鸟苷发酵液溶清，加热温度至85-95℃，反应时间2-5小时，使鸟苷发酵液转化成鸟嘌呤生成液；在该步骤中尤其注意pH的调节，pH太低副产物会变多，太高反应不完全。温度低反应时间长，从生产周期来说不合适，温度太高副产品多。
C、将步骤B的鸟嘌呤生成液降温结晶，得到固相为鸟嘌呤反应品；在嘌呤反应品中加入水，鸟嘌呤反应品和水的重量比为1:(3-10)，升温至35-99℃，用酸调pH范围为0.1-1.0得鸟嘌呤溶清液，将鸟嘌呤溶清液降温结晶，得到固相为鸟嘌呤盐酸盐湿精品；
D、在步骤C的在鸟嘌呤盐酸盐湿精品中加入水，鸟嘌呤盐酸盐湿精品和水的重量比为：1:(10-20)，通过调pH使固液相pH为7.0～9.0，降温结晶得到固相为鸟嘌呤湿精品，鸟嘌呤湿精品干燥得到鸟嘌呤成品。
进一步：在上述鸟嘌呤的合成方法中，所述步骤A的微生物是枯草芽孢杆菌。
所述步骤A的发酵过程为：
(1)斜面培养：将枯草芽孢杆菌菌株在斜面培养，温度25-36℃，培养时间16-32h，pH6.5-7.5，培养基成分以g/L计：葡萄糖1-3，蛋白胨3-10，牛肉膏5-15，酵母粉2-10，氯化钠1.0-2.5，琼脂15-30；
(2)种子培养：将斜面培养菌种转移至种子培养基，培养基条件：pH6.5-7.5，温度25-36℃，摇床转速80-220rpm，培养8-24h，培养基成分以g/L计：葡萄糖10-30，蛋白胨3-10，牛肉膏8-10，酵母粉2-10，玉米浆15-25ml/L，尿素3-7，豆粕水解液5-10ml/L，味精3-8，NaCl1.5-2.5，KH2PO4 0.5-1.5，MgSO4·7H2O 0.2-0.8；
(3)发酵培养：将种子培养液接种到含有培养基的发酵罐中发酵，温度32-38℃，培养时间40-96h；培养基成分以g/L计：葡萄糖10-30，蛋白胨3-10，牛肉膏8-10，酵母粉2-10，玉米浆15-25ml/L，尿素3-7，豆粕水解液5-10ml/L，味精3-8，NaCl1.5-2.5，KH2PO4 0.5-1.5，MgSO4·7H2O 0.2-0.8；鸟苷发酵液含量达66.3g/L。
所述步骤B、C调节pH范围所用的酸是盐酸；所述步骤D是用氨水调节pH范围。
所述步骤C还包括在鸟嘌呤溶清液加入活性炭脱色后，过滤除去活性炭后再降温结晶的过程。
所述活性炭脱的用量是鸟嘌呤折纯重量的0.5-5.0％。
所述步骤C鸟嘌呤盐酸盐溶清液的升温范围是80-99℃，如果温度低，需要加大量的盐酸。
所述干燥操作是指通过加热方式，使鸟嘌呤湿精品干燥，得到鸟嘌呤成品。
所述步骤C、D的降温结晶是指温度降为-2℃至10℃，保温时间为0-3小时，再分离固液相。
与现有技术相比，本发明的创新点在于：本发明提供了一种简单、高效的合成鸟嘌呤的方案。通过鸟苷为原料，水为溶剂，酸水解鸟苷制备鸟嘌呤。特别是通过酸直接水解微生物发酵制备的鸟苷发酵液，直接得到鸟嘌呤，生产工序大幅减少，生产成本低。由于在生产过程中，水为溶剂，生产环境干净，环保性好。所得的鸟嘌呤成品收率高，纯度高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下操作中，未做详细说明的，均可按照分子生物学实验手册进行。
实施例1
采用微生物发酵制备鸟苷，发酵完毕，除去菌体，得到鸟苷发酵液1000L，检测鸟苷含量(鸟苷发酵液通过层析柱检测鸟苷含量在7.8％)，用盐酸调节pH1.0。升温至90℃，保温反应3小时后降温至5℃，保温2小时。分离固液相，得到“固相”为鸟嘌呤反应品。用水溶解鸟嘌呤反应品，适当加水，使鸟嘌呤和水的重量比为：1:7，升温至95℃，调pH范围为0.5使鸟嘌呤溶清。加入适量活性炭脱色，用量为鸟嘌呤重量(kg)的2％。过滤除去活性炭后滤液降温结晶，温度为5℃，保温时间为3小时。分离固液相，得到“固相”为鸟嘌呤盐酸盐湿精品。适当加水，使鸟嘌呤和水的重量比为：1:10，用氨水调pH使固液相pH为7.0～8.0。降温结晶，待温度为5℃时分离固液相，得到“固相”为鸟嘌呤湿精品。通过加热方式，使鸟嘌呤湿精品干燥，得到鸟嘌呤成品33.5kg。鸟嘌呤成品摩尔收率80.5％，高效液相色谱检测成品纯度为99.95％。
所述微生物发酵制备鸟苷过程为：
(1)斜面培养：将枯草芽孢杆菌菌株在斜面培养，温度25-36℃，培养时间16-32h，pH6.5-7.5，培养基成分以g/L计：葡萄糖1-3，蛋白胨3-10，牛肉膏5-15，酵母粉2-10，氯化钠1.0-2.5，琼脂15-30；
(2)种子培养：将斜面培养菌种转移至种子培养基，培养基条件：pH6.5-7.5，温度25-36℃，摇床转速80-220rpm，培养8-24h，培养基成分以g/L计：葡萄糖10-30，蛋白胨3-10，牛肉膏8-10，酵母粉2-10，玉米浆15-25ml/L，尿素3-7，豆粕水解液5-10ml/L，味精3-8，NaCl1.5-2.5，KH2PO4 0.5-1.5，MgSO4·7H2O0.2-0.8；
(3)发酵培养：将种子培养液接种到含有培养基的发酵罐中发酵，温度32-38℃，培养时间40-96h；培养基成分以g/L计：葡萄糖10-30，蛋白胨3-10，牛肉膏8-10，酵母粉2-10，玉米浆15-25ml/L，尿素3-7，豆粕水解液5-10ml/L，味精3-8，NaCl1.5-2.5，KH2PO4 0.5-1.5，MgSO4·7H2O 0.2-0.8；鸟苷发酵液含量达66.3g/L。
实施例2
采用微生物发酵制备鸟苷，发酵完毕，除去菌体，得到鸟苷发酵液1000L，检测鸟苷含量(鸟苷发酵液通过层析柱检测鸟苷含量在7.8％)，加水调节鸟苷与水的比重为1：20，用盐酸调节pH0.8。升温至95℃，保温反应2小时后降温至0℃，保温2小时。分离固液相，得到“固相”为鸟嘌呤反应品。用水溶解鸟嘌呤反应品，适当加水，使鸟嘌呤和水的重量比为：1:7，升温至95℃，调pH范围为0.5使鸟嘌呤溶清。加入适量活性炭脱色，用量为鸟嘌呤重量(kg)的2％。过滤除去活性炭后滤液降温结晶，温度为0℃，保温时间为3小时。分离固液相，得到“固相”为鸟嘌呤盐酸盐湿精品。适当加水，使鸟嘌呤和水的重量比为：1:10，用氨水调pH使固液相pH为7.0～8.0。降温结晶，待温度为5℃时分离固液相，得到“固相”为鸟嘌呤湿精品。通过加热方式，使鸟嘌呤湿精品干燥，得到鸟嘌呤成品34.0kg。鸟嘌呤成品摩尔收率81.69％，高效液相色谱检测成品纯度为99.94％。
所述微生物发酵制备鸟苷过程与实施例1相同。
实施例3
采用微生物发酵制备鸟苷，发酵完毕，除去菌体，得到鸟苷发酵液1000L，检测鸟苷含量(鸟苷发酵液通过层析柱检测鸟苷含量在6.5％)，浓缩发酵液使鸟苷和水比例为1：5，用盐酸调节pH1.2。升温至85℃，保温反应4小时后降温至0℃，保温2小时。分离固液相，得到“固相”为鸟嘌呤反应品。用水溶解鸟嘌呤反应品，适当加水，使鸟嘌呤和水的重量比为：1:7，升温至95℃，调pH范围为0.5使鸟嘌呤溶清。加入适量活性炭脱色，用量为鸟嘌呤重量(kg)的2％。过滤除去活性炭后滤液降温结晶，温度为0℃，保温时间为3小时。分离固液相，得到“固相”为鸟嘌呤盐酸盐湿精品。适当加水，使鸟嘌呤和水的重量比为：1:10，用氨水调pH使固液相pH为7.0～8.0。降温结晶，待温度为5℃时分离固液相，得到“固相”为鸟嘌呤湿精品。通过加热方式，使鸟嘌呤湿精品干燥，得到鸟嘌呤成品28.06kg。鸟嘌呤成品摩尔收率81.0％，高效液相色谱检测成品纯度为99.90％。
所述微生物发酵制备鸟苷过程与实施例1相同。
对比例1
采用成品鸟苷70kg，加水使鸟苷和水比例为1：5，用盐酸调节pH1.2。
升温至85℃，保温反应4小时后降温至0℃，保温2小时。分离固液相，得到“固相”为鸟嘌呤反应品。用水溶解鸟嘌呤反应品，适当加水，使鸟嘌呤和水的重量比为：1:7，升温至95℃，调pH范围为0.5使鸟嘌呤溶清。加入适量活性炭脱色，用量为鸟嘌呤重量(kg)的2％。过滤除去活性炭后滤液降温结晶，温度为0℃，保温时间为3小时。分离固液相，得到“固相”为鸟嘌呤盐酸盐湿精品。适当加水，使鸟嘌呤和水的重量比为：1:10，用氨水调pH使固液相pH为7.0～8.0。降温结晶，待温度为5℃时分离固液相，得到“固相”为鸟嘌呤湿精品。通过加热方式，使鸟嘌呤湿精品干燥，得到鸟嘌呤成品31.0kg。鸟嘌呤成品摩尔收率83.0％，高效液相色谱检测成品纯度为99.90％，但鸟苷发酵液到鸟苷的提取收率约90％，因而总的摩尔收率约为74.7％。说明直接用鸟苷来制备鸟嘌呤总的收率比用鸟苷发酵液制备鸟嘌呤收率要低。
显然，本发明实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
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