阅读说明：本技术 一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法 (Method for obtaining high-yield cordycepin by using solid culture medium ) 是由 刘晓红 于 2020-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明涉及虫草素提取技术领域,具体公开了一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法,包括制备固体培养基和蚕蛹液,蚕蛹液涂布,条件差异培养提高培养基中虫草素含量,去除子实体,检测培养基中虫草素含量。本发明的方法在培养蛹虫草的过程中,大大提高了固体培养基中虫草素的积累量。(The invention relates to the technical field of cordycepin extraction, and particularly discloses a method for obtaining high-yield cordycepin by using a solid culture medium. The method greatly improves the accumulation of cordycepin in the solid culture medium in the process of culturing the cordyceps militaris.)

一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法

技术领域

本发明涉及虫草素提取技术领域，具体涉及一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法。

背景技术

虫草素学名为3′-脱氧腺苷，是从蛹虫草中提取出来的一种天然生物活性物质。虫草素的分子式为CsHyON，相对分子质量为251.25，能溶于水，乙醇，虫草素为含氮配糖体的核酸衔生物,属嘌呤类生物碱。虫草素是一种核甙类新药.20世纪70年代被发现有抑制肿瘤、抗疟原虫和抑制mRNA翻译的作用:20世纪90年代研究发现，添加腺甙脱氨酶(adenosinedea minase,ADA)抑制剂对其抗肿瘤活性的表达起着重要作用。虫草素能干扰基因细胞RNA和DNA的合成,抑制癌细胞等不正常细胞的***,并能作为区别细胞中不同的RNA聚合酶的工具；同时，虫草素还表现出极强的抗真菌、抗HIV-I型病毒和选择性抑制梭菌的活性，引起医药学界的高度重视,虫草素在美国作为抗癌、抗病毒新药已经进人三期临末床。

目前，虫草素获得的途径大部分通过子实体获得，然后这种途径相当昂贵，我们发现蛹虫草的发酵培养基中能够获得虫草素，且含量不比子实体中低，通过培养发酵获得虫草素，但是大部分通过培养基发酵均为液体发酵，但是液体发酵容易被污染，虽然固体培养能够降低污染率，但固体培养获得的虫草素含量低，通常低于1.8mg/g。因此，本发明提出一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法，通过在固体培养基表面涂布蚕蛹液以及条件差异培养大大提高了固体培养基中虫草素含量。

本发明提供了一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法，包括以下步骤：

S1，制备固体培养基和蚕蛹液，灭菌；

所述固体培养基配方为：KH₂PO₄ 1-5g，MgSO₄1-3g,维生素B1 2-7g,维生素B2 1-5g，葡萄糖2-3g，蛋白胨2-4g，蚕蛹粉4-6g，大米4-12g，玉米渣2-4g，荞麦粉2-6g，椰子壳颗粒2-5g，蒸馏水100-300ml，pH调至6.2-8.3；

所述蚕蛹液由蚕蛹粉、甘氨酸、腺嘌呤和蒸馏水混合而成；

将上述固体培养基分装后与蚕蛹液置于121℃下灭菌20-30min；

S2，接种前在固体培养基中加入蚕蛹液并涂布均匀；

S3，通过条件差异培养提高培养基中虫草素含量：

将提前备好的产虫草素菌种接种于固体培养基中，于14-20℃下黑暗培养6-10d后，调节培养温度至18-30℃继续黑暗培养14-20d，然后进行昼夜变换培养；

所述昼夜交替培养具体为：白天在温度18-30℃、光照200-500lx下进行培养12-14h，夜间在黑暗条件，温度为10-12℃下培养10-12h；

上述所述昼夜交替培养时间为8-12d；

然后调整光照为1000-2500lx，温度于18-30℃下继续培养2-4d；

S4，去除S2中培养基中的子实体，检测培养基中虫草素含量。

优选的，所述固体培养基中的椰子壳颗粒是由椰子壳粉碎成粒径为5-7mm的颗粒。

优选的，所述蚕蛹粉、甘氨酸、腺嘌呤和蒸馏水混合用量比为1g：1g：1g：100-200ml。

优选的，S1中，所述固体培养基分装在培养罐中，分装量为18-22g/罐。

优选的，S2中，所述蚕蛹液添加量为40-60μl/罐。

优选的，S3中，所述菌种为蛹虫草。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供方法，有效的提高了固体培养基中虫草素含量，固体培养基中虫草素平均含量高达7.06mg/g。

2、本发明中所用固体培养基配方中各种物质相互协同促进虫草素的积累，其中，椰子壳的添加能够增加固体培养基内部的孔隙度，不仅在空间上有利于蛹虫草的生长，同时还能提供碳源。

3、本发明通过由蚕蛹粉、甘氨酸、腺嘌呤和蒸馏水混合而成的蚕蛹液在接种前添加至固体培养基表面，促进虫草素在早期的产生，最终提高了固体培养基中虫草素含量。

4、本发明还通过条件差异培养提高了固体培养基中虫草素含量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明虫草素标准品的色谱图；

图2为本发明实施例1固体培养基中获得的虫草素色谱图；

图3为本发明实施例1-3和对比例1-3获得的虫草素单位含量比较图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：

(1)蛹虫草液体菌种的获得：

将菌种无菌接种至PDA培养基中，于21℃恒温光照培养18d后，用灭菌牙签挑取分生孢子接种至PD培养液中，于170r/min，21℃恒温摇培4d，获得种子培养液；

然后将上述种子培养液按照质量比4％接种至发酵罐放大培养，通气量为1.0m³/h，罐压力为1.1MPa，发酵温度为25℃，发酵时间为5d，的得到用于固体培养的蛹虫草菌种。

PDA液体培养基(g/L)：马铃薯200克葡萄糖20克，1000ml蒸馏水，pH6.3；

PD液体培养基(g/L)：马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨3g、KH₂PO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O1g，复合维生素B 25mg，1000ml蒸馏水，pH 6.3。

(2)一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法，包括以下步骤：

S1，制备固体培养基和蚕蛹液，灭菌；

所述固体培养基配方为：KH₂PO₄ 1g，MgSO₄1g,维生素2g,维生素B2 1g，葡萄糖2g，蛋白胨2g，蚕蛹粉4g，大米4g，玉米渣2g，荞麦粉2g，椰子壳颗粒2g，蒸馏水100ml，pH调至6.2；

所述椰子壳颗粒是由椰子壳粉碎成粒径为5mm的颗粒；

所述蚕蛹液由蚕蛹粉、甘氨酸、腺嘌呤和蒸馏水按照用量比为1g：1g：1g：100ml混合而成；

将上述固体培养基按照分装量18g/罐分装在培养罐中，然后和蚕蛹液一同置于121℃下灭菌20min；

S2，接种前在培养罐中的固体培养基表面加入40μl蚕蛹液并涂布均匀；

S3，通过条件差异培养提高培养基中虫草素含量：

将提前备好的蛹虫草菌种接种于固体培养基中，于14℃下黑暗培养6d后，调节培养温度至18℃继续黑暗培养14d，然后进行昼夜变换培养；

所述昼夜交替培养具体为：白天在温度18℃、光照200lx下进行培养12h，夜间在黑暗条件，温度为10℃下培养10h；

上述所述昼夜交替培养时间为8d；

然后调整光照为1000lx，温度于18℃下继续培养2d；

S4，去除S2中培养基中的子实体，检测培养基中虫草素含量。

实施例2：

本实施例中蛹虫草液体菌种的获得方式与实施例相同；

一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法，包括以下步骤：

S1，制备固体培养基和蚕蛹液，灭菌；

所述固体培养基配方为：KH₂PO₄ 2.5g，MgSO₄2g,维生素B1 5g,维生素B2 3g，葡萄糖2.5g，蛋白胨3g，蚕蛹粉5g，大米8g，玉米渣3g，荞麦粉4.5g，椰子壳颗粒3.5g，蒸馏水200ml，pH调至7.0；

所述椰子颗粒是由椰子壳粉碎成壳粒径为6mm的颗粒；

所述蚕蛹液由蚕蛹粉、甘氨酸、腺嘌呤和蒸馏水按照用量比为1g：1g：1g：150ml混合而成；

将上述固体培养基按照分装量20g/罐分装在培养罐中，然后和蚕蛹液一同置于121℃下灭菌25min；

S2，接种前在培养罐中的固体培养基表面加入50μl蚕蛹液并涂布均匀；

S3，通过条件差异培养提高培养基中虫草素含量：

将提前备好的蛹虫草菌种接种于固体培养基中，于17℃下黑暗培养8.5d后，调节培养温度至24℃继续黑暗培养17d，然后进行昼夜变换培养；

所述昼夜交替培养具体为：白天在温度24℃、光照350lx下进行培养13h，夜间在黑暗条件，温度为11℃下培养11h；

上述所述昼夜交替培养时间为10d；

然后调整光照为1700lx，温度于24℃下继续培养3d；

S4，去除S2中培养基中的子实体，检测培养基中虫草素含量。

实施例3：

本实施例中蛹虫草液体菌种的获得方式与实施例相同；

一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法，包括以下步骤：

S1，制备固体培养基和蚕蛹液，灭菌；

所述固体培养基配方为：KH₂PO₄ 5g，MgSO₄3g,维生素B1 7g,维生素B25g，葡萄糖3g，蛋白胨4g，蚕蛹粉6g，大米12g，玉米渣4g，荞麦粉6g，椰子壳颗粒5g，蒸馏水300ml，pH调至8.3；

所述椰子颗粒是由椰子壳粉碎成壳粒径为7mm的颗粒；

所述蚕蛹液由蚕蛹粉、甘氨酸、腺嘌呤和蒸馏水按照用量比为1g：1g：1g：200ml混合而成；

将上述固体培养基按照分装量22g/罐分装在培养罐中，然后和蚕蛹液一同置于121℃下灭菌30min；

S2，接种前在培养罐中的固体培养基表面加入60μl蚕蛹液并涂布均匀；

S3，通过条件差异培养提高培养基中虫草素含量：

将提前备好的蛹虫草菌种接种于固体培养基中，于20℃下黑暗培养10d后，调节培养温度至30℃继续黑暗培养20d，然后进行昼夜变换培养；

所述昼夜交替培养具体为：白天在温度30℃、光照500lx下进行培养14h，夜间在黑暗条件，温度为12℃下培养12h；

上述所述昼夜交替培养时间为12d；

然后调整光照为2500lx，温度于30℃下继续培养4d；

S4，去除S2中培养基中的子实体，检测培养基中虫草素含量。

对比例1

一种利用固体培养基获得虫草素的方法，与实施例1基本相同，区别在于：

去掉S2步骤，不添加蚕蛹液。

对比例2

一种利用固体培养基获得虫草素的方法，与实施例1基本相同，区别在于：

S3中，不进行条件差异培养，培养过程条件不变，温度为27℃、光照500lx。

对比例3

一种利用固体培养基获得虫草素的方法，与对比例2基本相同，区别在于：

去掉S2步骤，不添加蚕蛹液。

以上实施例1-3为本发明提供的方法获得虫草素的具体实施例，以对比例1-3为对照组，通过高效液相色谱法(HPLC)检测实施例1-3和对比例1-3中培养基最终的虫草素含量，具体过程如下：

I，以虫草素标准品的进样浓度为横坐标，色谱峰的面积为纵坐标绘制标准曲线，虫草素标准品的标准曲线如图1所示，以实施例1为代表绘制样品中虫草素的标准曲线，如图2所示，图1和图2出峰时间基本相同，因此使用高效液相色谱法(HPLC)检测本发明中虫草素含量。

高效液相色谱法(HPLC)的色谱条件：Symmetry C18(5um,4.6×150mm)色谱柱，流动相：磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(ph＝6.8，加1％四氢呋喃)，流速1.8ml/min，检测波长：260nm，进样量10ul，灵敏度1.000AUFS，室温。

II，将实施例1-3和对比例1-3中培养蛹虫草后最终获得的培养基破碎后分别取10个样，10个样为随机取样，质量相同，均为3g，检测结果取十个样的平均值，以下记为虫草素总含量。

检测结果如下：

表1实施例1-3和对比例1-3的固体培养基中虫草素含量

实施例	虫草素总含量	虫草素单位含量
			实施例1	20.61mg/g	6.87mg/g
实施例2	21.72mg/g	7.24mg/g
			实施例3	21.21mg/g	7.07mg/g
对比例1	6.84mg/g	2.28mg/g
			对比例2	10.23mg/g	3.41mg/g
对比例3	2.568mg/g	0.856mg/g

由表1可以看出，本发明实施例1-3获得的虫草素总含量基本相近，代表本发明提供的方法具有较强的稳定性，且本申请实施例1-3获得的虫草素单位含量平均高达7.06mg/g，是对比例1的3倍以上，说明本发明通过在固体培养基表面涂布蚕蛹液的手段大大提高了虫草素的积累；

本发明提供的方法获得的虫草素含量是对比例2的2倍以上，说明本发明通过条件差异培养与稳定培养相比，虫草素产量提高了2倍；

与对比例3相比，本发明虫草素产量提高了8倍以上，说明通过在培养基表面涂布蚕蛹液结合条件差异培养使得虫草素产量大大提升。

需要说明的是供试菌株来源于丹东元尊虫草科技有限公司。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。