阅读说明：本技术 一种含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体的制备方法及应用 (Preparation method and application of human telomerase reverse transcriptase-containing nano transdermal liposome ) 是由 南程成 于 2020-06-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体的制备方法,所述方法包括以下步骤：使用乙醇溶液将卵磷脂、胆固醇、PEG-2000在磁力搅拌的条件下混匀,获得混合液一；配置hTERT水溶液,在磁力搅拌的条件下混匀,获得混合液二；将所述混合液一与混合液二混合获得混合液三；将所述混合液三使用磁力搅拌器搅拌后进行超声处理；将经过超声后的混合液三继续使用磁力搅拌器搅拌；将获得的脂质体用无菌滤器进行过滤；将过滤后的溶液存于无菌离心管中。本发明有益效果在于,该纳米透皮脂质体具有良好的透皮性和生物活性,能够用作化妆品中面膜、爽肤水、冻干粉等的添加剂,具有良好的面部细胞抗衰老作用；同时该脂质体功效温和,不会给面部细胞增加额外的负担。(The invention discloses a preparation method of a human telomerase reverse transcriptase-containing nano transdermal liposome, which comprises the following steps: evenly mixing lecithin, cholesterol and PEG-2000 under the condition of magnetic stirring by using an ethanol solution to obtain a mixed solution I; preparing an hTERT aqueous solution, and uniformly mixing under the condition of magnetic stirring to obtain a mixed solution II; mixing the mixed solution I and the mixed solution II to obtain a mixed solution III; stirring the mixed solution III by using a magnetic stirrer and then carrying out ultrasonic treatment; continuing stirring the mixed solution III subjected to ultrasonic treatment by using a magnetic stirrer; filtering the obtained liposome with a sterile filter; the filtered solution was stored in a sterile centrifuge tube. The nano transdermal liposome has the beneficial effects that the nano transdermal liposome has good transdermal property and biological activity, can be used as additives of facial masks, toner, freeze-dried powder and the like in cosmetics, and has good anti-aging effect on facial cells; meanwhile, the liposome has mild efficacy, and does not increase additional burden on facial cells.)

一种含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体的制备方法及应用

技术领域

本发明属于医学美容领域，具体涉及一种含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体的制备方法及应用。

背景技术

衰老是生物体发育成熟后，随着年龄的增加，机体组织器官的机能逐渐减退，最终趋向死亡的过程。面部皮肤衰老是人体衰老的直观表现，皮肤的衰老主要表现为皮肤松弛、出现皱纹、色素斑点沉着、色泽暗淡等。衰老一直是生命科学关注的重点领域。细胞发生衰老的机制包括复制性衰老、DNA损伤诱导性衰老、原癌基因诱导衰老等。其中细胞连续复制导致的衰老是最常见的。

在正常的人体细胞分裂过程中，随着细胞分裂次数的增加，细胞的端粒会不断缩短，最终导致细胞的衰老和死亡。端粒位于染色体的末端，能够保护亚端粒区遗传信息的稳定。作为一种生物衰老相关的重要标志物，端粒在细胞复制性衰老的病理生理过程中起着决定性作用。如果染色体中的端粒在细胞复制过程中不变短，细胞就不会衰老。

端粒酶的相对分子质量为200-500KD,是细胞中负责延长端粒的一种核糖核蛋白复合体，其活性与人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达密切相关。研究表明外源性hTERT可以提高细胞端粒酶的活性，赋予细胞延缓衰老或永生化能力。

发明内容

人端粒酶逆转录酶要到达面部皮肤的真皮层细胞内发挥作用，需要通过致密的角质层和细胞膜结构。同时人端粒酶逆转录酶本质上属于蛋白质，对于环境中的光、温度、Ph变化非常敏感，也容易造成端粒酶的失活。基于以上缺点，我们构建了一种磷脂双分子层的类似细胞膜结构的纳米脂质体。通过该纳米脂质体包裹人端粒酶逆转录酶，不仅能够实现长时间保持端粒酶的活性，也能够使包裹的端粒酶顺利到达真皮层的细胞内发挥作用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

S1使用乙醇溶液将卵磷脂、胆固醇、PEG-2000在磁力搅拌的条件下混匀，获得混合液一；

S2配置0.1-0.5mM的hTERT水溶液，在磁力搅拌的条件下混匀，获得混合液二；

S3将所述混合液一缓慢滴入所述混合液二中,获得混合液三；

S4将所述混合液三使用磁力搅拌器搅拌2h；

S5将经过S4搅拌的混合液三放入超声波仪器中，超声45min；

S6将经过S5超声后的混合液三继续使用磁力搅拌器搅拌10h，获得脂质体；

S7将S6获得的脂质体用无菌滤器进行过滤；

S8将S7过滤后的溶液存于无菌离心管中，并放于4℃环境中保存，即获得含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体。

优选的，所述卵磷脂、所述胆固醇、所述PEG-2000的摩尔比为15：23：6。

优选的，所述步骤S1、步骤S4、步骤S6的磁力搅拌器的搅拌速度为1000-3000转/分。

优选的，所述步骤S3的滴入方式为采用5ml无菌注射器吸入所述混合液一，然后缓慢推动注射器活塞，使注射器中的液体缓慢滴入所述混合液二中，滴入速度为每分钟1-5滴。

优选的，在所述步骤S7中，首先使用0.45um的无菌滤器过滤三遍，然后再使用0.22um的无菌滤器过滤三遍。

优选的，制备的含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体大小为30—50nm。

本发明还提供一种通过上述方法制备获得的含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体的应用，所述含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体是通过携带hTERT穿过皮肤致密的角质层和基底细胞的细胞膜结构，最终作用于基底细胞核内。

本发明有益效果在于，该纳米透皮脂质体具有良好的透皮性和生物活性，能够用作化妆品中面膜、爽肤水、冻干粉等的添加剂，具有良好的面部细胞抗衰老作用；同时该脂质体功效温和，不会给面部细胞增加额外的负担。

附图说明

图1为本发明的含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体示意图；

图2为本发明对照组中的细胞出现了衰老的示意图；

图3为本发明实验组中的细胞未出现衰老的示意图。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

本发明为一种含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

S1使用乙醇溶液将卵磷脂、胆固醇、PEG-2000在磁力搅拌的条件下混匀，获得混合液一；

S2配置0.1-0.5mM的hTERT水溶液，在磁力搅拌的条件下混匀，获得混合液二；

S3将所述混合液一缓慢滴入所述混合液二中,获得混合液三；

S4将所述混合液三使用磁力搅拌器搅拌2h；

S5将经过S4搅拌的混合液三放入超声波仪器中，超声45min；

S6将经过S5超声后的混合液三继续使用磁力搅拌器搅拌10h，获得脂质体；

S7将S6获得的脂质体用无菌滤器进行过滤；

S8将S7过滤后的溶液存于无菌离心管中，并放于4℃环境中保存，即获得含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体。

优选的，所述卵磷脂、所述胆固醇、所述PEG-2000的摩尔比为15：23：6。

优选的，所述步骤S1、步骤S4、步骤S6的磁力搅拌器的搅拌速度为1000-3000转/分。

优选的，所述步骤S3的滴入方式为采用5ml无菌注射器吸入所述混合液一，然后缓慢推动注射器活塞，使注射器中的液体缓慢滴入所述混合液二中，滴入速度为每分钟1-5滴。

优选的，在所述步骤S7中，首先使用0.45um的无菌滤器过滤三遍，然后再使用0.22um的无菌滤器过滤三遍。

优选的，制备的含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体大小为30—50nm。

本发明还提供一种通过上述方法制备获得的含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体的应用，所述含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体是通过携带hTERT穿过皮肤致密的角质层和基底细胞的细胞膜结构，最终作用于基底细胞核内。

实施例一

体外细胞β半乳糖苷酶染色实验

绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，在不断分裂后就进入衰老状态。此时细胞仍然存活的，但细胞的基因和蛋白表达谱发生了很大改变。衰老细胞通常体积变大，表达PH6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶。我们利用该原理检测细胞的衰老情况。

复苏第三代的成纤维细胞6皿，随机分为对照组和实验组(各三皿)。在对照组的培养基中额外加入2‰的蒸馏水，实验组的培养基中额外加入2‰含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体。连续传代15代后，进行β半乳糖苷酶衰老检测分析。实验结果显示，对照组中出现了大量蓝染的细胞，而实验组中的细胞未出现蓝染细胞。即对照组中的细胞出现了衰老，而实验组中的细胞未出现衰老(如图2和图3)。证明含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体具有抗衰老的作用。

实施例二

效果实验

挑选28-45岁的健康女性200人进行200天的涂抹试验。将200人随机分为2组，设置为对照组和实验组，每组100人。对照组使用蒸馏水，实验组使用含有1％纳米透皮脂质体的蒸馏水溶液。200天后采用visa测量仪分别比较实验组和对照组人员200天内的面部皮肤皱纹的深浅度。皱纹设置以下3个标准作为衡量。

出现浅皱纹：即出现细微的组织改变伴皮纹略加深

浅皱纹加深：出现明显的丘疹样弹性组织变性，黄色半透明丘疹，皮肤变色。

出现重度皱纹：弹性组织重度变性，即出现多丘疹样及融合的弹性组织变性，菱形皮肤增厚、黄或苍白。

组别	出现浅皱纹	浅皱纹加深	出现重度皱纹	基本无改变	过敏
						对照组	50	41	2	7	0
实验组	6	1	0	93	0

运用统计学方法进行分析，发现实验数据具有明显的统计学差异，含人端粒酶逆转录酶纳米透皮脂质体具有抗衰老的作用。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。