阅读说明：本技术 一种滇牡丹果皮提取物及其制备方法和应用 (Paeonia suffruticosa peel extract and preparation method and application thereof ) 是由 施蕊 王娟 杨宇明 于 2020-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药领域,涉及一种中药提取物及其制备方法和应用,具体涉及一种滇牡丹果皮提取物及其制备方法和应用。本方案使用乙酸乙酯对粉碎后的滇牡丹果皮进行热浸提取,通过酸沉处理将黄酮类物质和甾醇类物质分离分层。然后继续对提取后的滤渣进行酶解辅助的热水浸提处理,可以将滇牡丹果皮中的剩余的黄酮类物质和多糖类物质提取。利用本制备方法可同时对滇牡丹果皮中的功效成分进行提取,提高了滇牡丹果皮的综合利用率。本法能够将滇牡丹果皮中的功效成分充分提取利用,可以应用于保健食品的研究开发和生产中。(The invention relates to the field of biological medicines, relates to a traditional Chinese medicine extract, and a preparation method and application thereof, and particularly relates to a paeonia suffruticosa peel extract, and a preparation method and application thereof. According to the scheme, the ethyl acetate is used for carrying out hot-dip extraction on the smashed Yunnan peony peel, and flavonoid substances and sterol substances are separated and layered through acid precipitation treatment. And then carrying out enzymolysis-assisted hot water extraction treatment on the extracted filter residue, so as to extract the residual flavonoid and polysaccharide substances in the paeonia suffruticosa peel. By using the preparation method, the functional components in the Yunnan peony peel can be extracted at the same time, and the comprehensive utilization rate of the Yunnan peony peel is improved. The method can fully extract and utilize the functional components in the Yunnan peony peel, and can be applied to the research, development and production of health-care food.)

一种滇牡丹果皮提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，涉及一种中药提取物及其制备方法和应用，具体涉及一种滇牡丹果皮提取物及其制备方法和应用。

背景技术

滇牡丹(Paeonia delavayi)是我国西南特有的珍惜濒危植物，具有较高的观赏价值和药用价值。滇牡丹的根皮是滇牡丹的主要药用部位，并且从滇牡丹籽中提取的籽油具有降血脂、降血糖等作用，因此，滇牡丹的根皮和滇牡丹籽被广泛开发利用。但是，具有较大生物量的滇牡丹果皮(又称果荚)却没有被综合利用。研究显示，滇牡丹果皮中含有大量的多糖、甾醇(主要为植物甾醇)和黄酮类物质。滇牡丹多糖能够清除羟自由基和超氧阴离子，具有抗氧化的作用，具有很高的药用与保健价值；甾醇具有降脂调脂、抗氧化、消炎、抗癌、免疫调节等功效；黄酮类化合物具有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇静和镇痛等作用。如果能够将滇牡丹果皮中的各种功效成分充分利用，可以大大扩展滇牡丹的应用范围，实现资源物种的综合利用。

发明人在前期的研究成果中开发了一种滇牡丹果皮多糖的提取方法(“民族药滇牡丹果皮中多糖的提取工艺研究，施蕊等，中国民族民间医药，2016”)。该法使用超声辅助提取、回流法等提取方法对滇牡丹果皮多糖进行了成功提取，并确定了最佳提取条件。但是，现有技术中的方法无法实现对多糖、黄酮和甾醇等物质的同时提取，提取效率有限，无法快速高效地实现对滇牡丹果皮的综合利用。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种滇牡丹果皮提取物的制备方法，利用本制备方法可同时对滇牡丹果皮中的功效成分进行提取，提高了滇牡丹果皮的综合利用率。

为达到上述目的，本发明提出了以下技术方案：

一种滇牡丹果皮提取物的制备方法，包括以下步骤，

步骤(1)：取滇牡丹果皮，经预处理获得果皮颗粒；

步骤(2)：使用乙酸乙酯对果皮颗粒进行热浸提取，完成提取后过滤得提取液Ⅰ和滤渣，对提取液Ⅰ进行浓缩处理，得浸膏；

步骤(3)：将浸膏分散于水中，得分散体系；调节分散体系的pH值至6.0-6.5，静置得沉淀Ⅰ和油层。

采用上述技术方案，技术原理以及有益效果为：使用乙酸乙酯对果皮颗粒进行热浸提取，可将果皮颗粒中的甾醇类物质和部分黄酮类物质浸出，通过过滤获得含有甾醇类物质和黄酮类物质的提取液Ⅰ。对提取液Ⅰ进行浓缩处理，提取溶剂乙酸乙酯挥发后可获得半固体状的浸膏。再将浸膏分散于水中，甾醇类物质不溶于水且呈油状，静置后，甾醇类物质集中在油层中。而黄酮类物质的水溶性不佳，易形成结晶析出。调节pH值至6.0-6.5，可保证黄酮类物质充分析出，得到沉淀Ⅰ。

发明人曾经尝试多种不同的提取方法，例如，使用乙酸乙酯对果皮颗粒进行超声辅助提取。众所周知，超声辅助提取的提取效率比热浸提取更高，用时更短，且功效物质的提取率更高。但是，实际的情况是，采用超声辅助提取的方法，提取获得的甾醇的量较少，且黄酮类物质的纯度不高。发明人分析了产生该现象的原因，认为本法欲提取的黄酮为滇牡丹果皮中的总黄酮，成分较为复杂。有的黄酮类物质在沉淀结晶的过程中对甾醇类物质有包合作用，沉淀时携带了部分甾醇等物质，所以产生了上述现象。发明人在尝试不同的提取方法的过程中，发现使用热浸提取的方法可以将甾醇类物质的得率提升，虽然得到的黄酮类物质的量不高，但是纯度得以提升。发明人进而分析了原因：植物甾醇存在于植物细胞膜上，通过不同的提取方法(单纯热浸处理、超声辅助提取等)很容易被溶剂溶出；而滇牡丹果皮内的黄酮类物质分布较为复杂，有的黄酮类物质和植物细胞内的结构骨架部分结合得较为紧密(需要较为强烈的提取方法才能提取获得)，有的黄酮类物质游离存在于细胞质中(一般提取方法即可获得)。当采用超声辅助提取的方法时，黄酮类物质被充分提取，但是在分离甾醇等物质的时候，不能实现功效成分的充分分离。当采用热浸提取的时候，只有部分的黄酮类物质被提取，这部分的黄酮类物质对甾醇类物质不产生包合作用(或者说很小的包合作用)，所以提高了甾醇类物质的提取率，并提高了黄酮类的物质的纯度。并且采用热浸提取的方法，溶出的杂质更少，更有利于提高目的物质的纯度。

采用本技术方案，可以同时提取获得甾醇类物质和黄酮类物质，且甾醇类物质的得率较高，且获得黄酮类物质的纯度较高。另外，发明人发现了影响甾醇类物质提取率的重要因素之一，通过简单的调整提取方法，即可避免另一目的物质对甾醇类物质的提取率的影响。

进一步，还包括步骤(4)，使用复合酶处理步骤(2)中的滤渣，得酶解后体系。

采用上述技术方案，可实现对滤渣的充分利用。使用复合酶处理滤渣之后，可以使得细胞壁崩解，有助于将细胞中的功效成分充分提取。

进一步，还包括步骤(5)：在酶解后体系中加入水，得水提体系，并调整水提体系的pH值至9.5-10.5，对酶解后的滤渣进行热浸提取，完成提取后过滤得提取液Ⅱ，调整提取液Ⅱ的pH值至6.0-6.5，静置后，过滤取沉淀Ⅲ和滤液。

采用上述技术方案，可将滤渣中的包括总多糖和部分黄酮在内的功效物质充分提取。调节pH值可以使得滤渣中提取的黄酮类物质沉淀结晶，实现对黄酮类物质的分离纯化。

进一步，还包括步骤(6)：浓缩步骤(5)中的滤液，加入无水乙醇后静置，过滤取沉淀Ⅱ。

采用上述技术方案，使用醇沉的方法，将多糖沉淀纯化分离。

进一步，还包括步骤(7)：将步骤(3)中的沉淀Ⅰ和步骤(6)中的沉淀Ⅲ混合，然后进行干燥处理后得干粉状的黄酮提取物；对步骤(3)中的油层进行除水处理后得甾醇提取物；对步骤(5)中的沉淀Ⅱ干燥处理后得干粉状的多糖提取物。

采用上述技术方案，经脱水或干燥处理，可获得纯度高且易于保藏的黄酮提取物、甾醇提取物和多糖提取物。将沉淀Ⅰ和沉淀Ⅲ混合，获得的是滇牡丹果皮中的总黄酮，实现了对黄酮类物质的充分提取。

进一步，在步骤(2)中，使用乙酸乙酯对果皮颗粒进行热浸提取的温度为40-60℃，提取时长为10-15h。

采用上述技术方案，采用上述的温度和时间，可以将甾醇类物质充分提取，且不会提取出影响甾醇分层析出的部分黄酮类物质。

进一步，在步骤(4)中，复合酶包括纤维素酶、果胶酶和蛋白酶。

采用上述技术方案，纤维素酶、果胶酶和蛋白酶可充分降解植物细胞壁，使得内容物充分析出。

进一步，在步骤(4)中，对酶解后的滤渣进行热浸提取的温度为60-70℃，提取时长为18-24h。

采用上述技术方案，采用上述的温度和时间，可以将总多糖和剩余的黄酮类物质充分提取。

进一步，一种滇牡丹果皮提取物，包括黄酮提取物、甾醇提取物和多糖提取物。

采用上述技术方案，由本法获得的滇牡丹果皮提取物包括黄酮提取物、甾醇提取物和多糖提取物三个种类，实现了对滇牡丹果皮的综合利用和对功效成分的充分提取。

进一步，滇牡丹果皮提取物在保健食品中的应用。

采用上述技术方案，滇牡丹的黄酮提取物具有抗炎和抗病毒等作用；滇牡丹的活性多糖具有抗氧化和激活免疫系统等功效；滇牡丹的甾醇提取物具有降脂调脂和抗氧化等应用价值，可以将滇牡丹果皮提取物应用于保健食品的研究开发和生产中。

具体实施方式

实施例1：

步骤(1)：取新鲜的滇牡丹果皮，粉碎处理后过10目筛，获得果皮颗粒。

步骤(2)：使用乙酸乙酯对果皮颗粒进行热浸提取，料液比(w/v)为1:15(g:ml)，提取时长10h，提取温度50℃。完成提取后过滤，得提取液Ⅰ和滤渣，使用旋转蒸发仪对提取液Ⅰ进行浓缩处理，压强条件为0.05MPa、温度50℃，直至浸膏的浓度为0.5g/ml。

步骤(3)：将浸膏分散于水中，每g浸膏使用20ml水来进行分散，过程在室温下进行，得分散体系。使用1mM的盐酸调节分散体系的pH值至6.5，静置得沉淀Ⅰ和油层。

步骤(4)：在步骤(2)中的滤渣中加入水，料液比(w/v)为1:5(g:ml)，混匀后在体系中加入复合酶，然后混匀后进行酶解反应。复合酶中包括纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶(三种酶的质量比为1:1:1，均购自全鼎生物，CAS号分别为9012-54-8，9032-75-1和9068-59-1)，复合酶在反应体系中的质量浓度为4g/100ml，酶解反应持续时间为1.5h，温度为40℃，pH值为7.0，酶解反应结束后，得酶解后体系。

步骤(5)：在酶解后体系中加入水，水的加入量为每g滤渣中加入10ml水，并使用1mM的氢氧化钠调节水提体系的pH值为10，得水提体系对酶解后的滤渣进行热浸提取，提取的温度为70℃，提取的时长为18h，完成提取后过滤得提取液Ⅱ。使用1mM的盐酸调节提取液Ⅱ的pH值至6.5，静置1h后过滤获得沉淀Ⅲ和滤液。

步骤(6)：使用旋转蒸发仪浓缩步骤(5)中的滤液(0.05MPa、50℃)，直至滤液的体积为原体积的五分之一，获得浓缩液。在浓缩液中加入无水乙醇，浓缩液和无水乙醇的体积比为1:2，待沉淀充分之后，迅速过滤获得沉淀Ⅱ。

步骤(7)：将步骤(3)中的沉淀Ⅰ和步骤(6)中的沉淀Ⅲ混合，经旋转蒸发仪减压浓缩之后(0.05MPa、40℃)，再通过冷冻干燥得干粉状的黄酮提取物；对步骤(3)中的油层进行除水(无水硫酸钠)处理后得甾醇提取物；对步骤(5)中的沉淀Ⅱ，经旋转蒸发仪减压浓缩之后(0.05MPa、40℃)，再通过冷冻干燥得干粉状的多糖提取物。

实施例2：

本实施例基本同实施例1，不同点在于步骤(2)-(5)。

步骤(2)：使用乙酸乙酯对果皮颗粒进行热浸提取，料液比(w/v)为1:20(g:ml)，提取时长10h，提取温度60℃。完成提取后过滤，得提取液Ⅰ和滤渣，使用旋转蒸发仪对提取液Ⅰ进行浓缩处理，压强条件为0.05MPa、温度50℃，直至浸膏的浓度为0.5g/ml。

步骤(3)：将浸膏分散于水中，每g浸膏使用20ml水来进行分散，过程在室温下进行，得分散体系。使用1mM的盐酸调节分散体系的pH值至6.0，静置得沉淀Ⅰ和油层。

步骤(4)：在步骤(2)中的滤渣中加入水，料液比(w/v)为1:5(g:ml)，混匀后在体系中加入复合酶，然后混匀后进行酶解反应。复合酶中包括纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶(三种酶的质量比为1:1:1，均购自全鼎生物，CAS号分别为9012-54-8，9032-75-1和9068-59-1)，复合酶在反应体系中的质量浓度为5g/100ml，酶解反应持续时间为1h，温度为40℃，pH值为7.0，酶解反应结束后，得酶解后体系。

步骤(5)：在酶解后体系中加入水，水的加入量为每g滤渣中加入10ml水，并使用1mM的氢氧化钠调节水提体系的pH值为9.5，得水提体系对酶解后的滤渣进行热浸提取，提取的温度为60℃，提取的时长为24h，完成提取后过滤得提取液Ⅱ。使用1mM的盐酸调节提取液Ⅱ的pH值至6.0，静置1h后过滤获得沉淀Ⅲ和滤液。

实施例3：

本实施例基本同实施例1，不同点在于步骤(2)-(5)。

步骤(2)：使用乙酸乙酯对果皮颗粒进行热浸提取，料液比(w/v)为1:15(g:ml)，提取时长12h，提取温度40℃。完成提取后过滤，得提取液Ⅰ和滤渣，使用旋转蒸发仪对提取液Ⅰ进行浓缩处理，压强条件为0.05MPa、温度50℃，直至浸膏的浓度为0.5g/ml。

步骤(3)：将浸膏分散于水中，每g浸膏使用20ml水来进行分散，过程在室温下进行，得分散体系。使用1mM的盐酸调节分散体系的pH值至6.2，静置得沉淀Ⅰ和油层。

步骤(4)：在步骤(2)中的滤渣中加入水，料液比(w/v)为1:5(g:ml)，混匀后在体系中加入复合酶，然后混匀后进行酶解反应。复合酶中包括纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶(三种酶的质量比为1:1:1，均购自全鼎生物，CAS号分别为9012-54-8，9032-75-1和9068-59-1)，复合酶在反应体系中的质量浓度为4g/100ml，酶解反应持续时间为2h，温度为40℃，pH值为7.0，酶解反应结束后，得酶解后体系。

步骤(5)：在酶解后体系中加入水，水的加入量为每g滤渣中加入10ml水，并使用1mM的氢氧化钠调节水提体系的pH值为10.5，得水提体系对酶解后的滤渣进行热浸提取，提取的温度为65℃，提取的时长为20h，完成提取后过滤得提取液Ⅱ。使用1mM的盐酸调节提取液Ⅱ的pH值至6.2，静置1h后过滤获得沉淀Ⅲ和滤液。

对比例1：

本对比例采用超声辅助提取法对滇牡丹果皮进行提取，具体的方法为：取新鲜的滇牡丹果皮，粉碎处理后过10目筛，获得果皮颗粒。使用乙酸乙酯对果皮颗粒进行超声辅助提取，料液比(w/v)为1:15(g:ml)，在提取的同时(室温)进行超声处理，超声功率500W，超声处理3次，每次30min，完成提取后过滤取提取液和滤渣。使用旋转蒸发仪对提取液进行浓缩处理，压强条件为0.05MPa、温度50℃，直至浸膏的浓度为0.5g/ml。将浸膏分散于水中，每g浸膏使用20ml水来进行分散，过程在室温下进行，得分散体系。使用1mM的盐酸调节分散体系的pH值至6.5，静置得沉淀和油层。吸取油层，并通过抽滤取得沉淀。沉淀部分经旋转蒸发仪减压浓缩之后(0.05MPa、40℃)，再通过冷冻干燥得干粉状的黄酮提取物。对获得的油层进行除水(无水硫酸钠)处理后得甾醇提取物。

对滤渣进行多糖物质的提取，由于前期已经进行过了超声辅助提取，在提取多糖的过程中，不再采用复合酶处理的方法。在滤渣中加入水，水的加入量为每g滤渣中加入15ml水，对滤渣进行热浸提取，提取的温度为70℃，提取的时长为18h，完成提取后过滤得提取液。使用旋转蒸发仪浓缩提取液(0.05MPa、50℃)，直至提取液的体积为原体积的五分之一，获得浓缩液。在浓缩液中加入无水乙醇，浓缩液和无水乙醇的体积比为1:2，待沉淀充分之后，迅速过滤(抽滤)获得沉淀。沉淀经旋转蒸发仪减压浓缩之后(0.05MPa、40℃)，再通过冷冻干燥得干粉状的多糖提取物。

对比例2

本对比例基本同对比例1，不同点在于，在步骤(2)中，使用乙酸乙酯对果皮颗粒进行热浸提取的温度为室温，提取时间为5h。

对比例3

本对比例基本同对比例1，不同点在于，在步骤(2)中，使用乙酸乙酯对果皮颗粒进行热浸提取的温度为90℃，提取时间为24h。

对比例4

本对比例基本同实施例1，不同点在于，在步骤(5)中，复合酶中不含有中性蛋白酶，只有纤维素酶和果胶酶(质量比为1:1)。

实验例：总甾醇、总黄酮和总多糖提取量的测定

总甾醇的测定采用硫磷铁比色法，使用β-谷甾醇绘制标准曲线，利用甾醇类物质硫磷铁试剂作用，产生颜色反应，再以比色法测定(530nm处的吸光光度)并计算甾醇的提取量。测量了实施例1-3，对比例1-4中甾醇提取物中总甾醇的量，以每10g滇牡丹果皮(新鲜)中总甾醇的质量(mg)来表示总甾醇的提取量(mg/10g)。

总黄酮的测定采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定，使用芦丁标准品绘制标准曲线，利用黄酮类物质在亚硝酸钠-硝酸铝试剂中产生显色反应，再以比色法测定(500nm处的吸光光度)并计算黄酮的提取量。测量了实施例1-3，对比例1-4中黄酮提取物中总黄酮的量，以每g滇牡丹果皮(新鲜)中总黄酮的质量(mg)来表示总黄酮的提取量(mg/g)。

总多糖的测定采用苯酚硫酸比色法，使用葡萄糖标准品绘制标准曲线，利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定(490nm处的吸光光度)并计算多糖的提取量。测量了实施例1-3，对比例1-4中多糖提取物中总多糖的量，以每g滇牡丹果皮(新鲜)中总多糖的质量(mg)来表示总多糖的提取量(mg/g)。

总甾醇、总黄酮和总多糖提取量的测定结果如表1所示，由检测结果可知，相对于对比例1，实施例1-3中的方法的总甾醇的提取量均较高。对比文件1采用了较强功率的超声来处理样品，果皮的细胞结构被充分破坏，黄酮类物质大量释放，释放的黄酮类物质在后续的酸沉过程中结晶析出。但是由于大量的黄酮类物质的存在，部分黄酮类物质在结晶过程中对甾醇类物质产生包合作用，发生共沉淀，导致总甾醇的提取量降低。而实施例1-3采用较为温和的热浸提取的方式，将果皮细胞壁未被大量破坏，细胞质以及细胞膜中可溶于乙酸乙酯的物质被溶出。其中黄酮类物质部分被提取出，剩下的部分存在于滤渣中，在后续的水提步骤中被进一步提取。采用热浸方法获得的提取液进行酸沉步骤，提取液中的黄酮物质在沉淀结晶的过程中，不会对甾醇产生过大的包合作用，所以总甾醇可被充分提取。另外，对比例1中的超声处理过程，也会使多糖类物质大量析出，影响甾醇的分层析出。对比例2的提取时间过短，温度过低，不能将甾醇和黄酮充分提取。对比例3提取时间过长，在乙酸乙酯提取的时候，会获得大量的黄酮类物质，也会影响甾醇的分层析出的过程。对比例4在酶解过程中没有使用到蛋白酶，蛋白酶虽然对破坏细胞壁的作用不大，但是可以将体系中的大分子蛋白质分解，促进总黄酮的充分析出，并且避免了总多糖析出的时候夹带大量蛋白质杂质。由于对比例4中没有使用到蛋白酶，所以，获得的总黄酮的量较少，而总多糖中会含有大量的蛋白质杂质

表1：总甾醇、总黄酮和总多糖提取量的测定结果

	总甾醇提取量(mg/10g)	总黄酮提取量(mg/g)	总多糖提取量(mg/g)
				实施例1	52.63	173.14	103.87
实施例2	50.91	161.27	114.07
				实施例3	49.01	164.18	98.71
对比例1	31.52	187.39	57.16
				对比例2	21.09	106.31	87.47
对比例3	39.54	169.78	92.36
				对比例4	49.16	152.33	104.29

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。