阅读说明：本技术 一种越橘提取物的制备方法 (Preparation method of cowberry fruit extract ) 是由 郝成兵 程勇 邵云东 李若鹏 于 2020-05-09 设计创作，主要内容包括：一种橘提取物的制备方法,以越橘生物酶发酵液为原料制备越橘提取物,所述越橘生物酶发酵液包括以下处理工序：步骤一：将越橘浆果和/或加工余料破碎后经混合菌发酵过滤后得到发酵提取液a,所述混合菌为能产生纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶的菌种；步骤二：将所述发酵提取液a经二次发酵过滤后得到发酵提取液b,精提所述发酵提取液b后即得越橘提取物,所述二次发酵工序采用将苹果黑星菌孢子悬浮液接种于所述发酵提取液a中发酵的工艺。本发明得到的提取物中花青素类物质产率高,纯化效果较好,同时还减少了废料的产生,绿色环保。(A preparation method of a cowberry extract takes cowberry biological enzyme fermentation liquor as a raw material to prepare the cowberry extract, and the cowberry biological enzyme fermentation liquor comprises the following processing procedures: the method comprises the following steps: crushing cowberry berries and/or processing residues, and fermenting and filtering by using mixed bacteria to obtain a fermentation extract a, wherein the mixed bacteria are strains capable of producing cellulase, hemicellulase and pectinase; step two: and (3) carrying out secondary fermentation and filtration on the fermentation extracting solution a to obtain a fermentation extracting solution b, and carrying out fine extraction on the fermentation extracting solution b to obtain the cowberry fruit extract, wherein the secondary fermentation process adopts a process of inoculating the apple venturia inaequalis spore suspension into the fermentation extracting solution a for fermentation. The anthocyanin substances in the extract obtained by the invention have high yield and good purification effect, and meanwhile, the waste is reduced, so that the extract is green and environment-friendly.)

一种越橘提取物的制备方法

技术领域

本发明属于植物提取精制技术领域，具体涉及一种越橘提取物的制备方法。

背景技术

越橘，杜鹃花科越橘属植物，包括：欧洲越橘、美洲越橘、西伯利亚越橘等400多个品种，以瑞典、芬兰、挪威等出产的欧洲越橘最佳。越橘果实平均重0.5-2.5g，果实色泽美丽，果实细腻，种子极小，可食用率达100%。越橘中含有丰富的生物活性体质，除供食用外，还具有极强的药用价值及营养保健功能，国际粮农组织将其列为人类五大健康食品之一。越橘含有的氨基酸、维生素、花青素、黄酮、有机硒和果酸等特殊营养成分是任何植物所无法比拟的，有着比一般植物包括蓝莓更加优越的抗氧化活性。当前人们对越橘的关注度越来越高，其相关产业也逐渐壮大。越橘深加工的开发市场广阔，今后深加工也将成为越橘发展的重点发展方向。

欧洲越橘中富含的花色苷，或称花色苷、花色素苷，其结构为花青素与糖类以糖苷键结合。由于其独特的功能性，而被应用于清除体内自由基、抗肿瘤、抗癌、抗炎、抑制脂质过氧化和血小板凝集、预防糖尿病、减肥、保护视力等。花色苷作为一种天然色素，安全、无毒，且对人体具有许多保健功能，已被应用于食品、保健品、化妆品、医药等行业。

目前花色苷的制备工艺基本是采用有机溶剂提取或酸化醇水溶液提取，通过大孔树脂纯化和浓缩后，利用喷雾干燥技术得到产品，如申请号201310461582.9的中国专利申请公开了一种从欧洲越橘中提取花色苷的方法，以欧洲越橘为原料，以9倍原料量的乙醇加热回流提取2-3次，减压浓缩，D101树脂吸附、解吸、浓缩、干燥得粗提物，粗提物再用丙酮萃取，得到总花色苷含量约70％的欧洲越橘提取物，该方法得到的欧洲越橘提取物虽然纯度较高，但是产品收率只有0.5％，另外，萃取所用的丙酮为有毒溶剂，产品有严格的限量要求，容易导致产品丙酮残留超标；申请号201410253728.5的中国专利申请公开了一种欧洲越橘提取物及其制备方法，该方法以欧洲越橘为原料，加入果浆3倍量体积分数为60％的酸化乙醇，50℃加热回流提取2次，浓缩后用自制的以聚苯乙烯为主要骨架的大孔树脂进行吸附，再用酸性水洗，酸性乙醇、甲醇或丙酮解吸，喷雾干燥得到总花色苷含量在55％-95％的欧洲越橘提取物，且谱图符合欧洲药典规定，但该方法得到的欧洲越橘提取物尽管花色苷纯度高，但采用加热回流方式进行提取容易导致作为主要活性成分的花色苷受热分解，影响花色苷总收率，其次，提取、水洗、解吸工艺过程中均用盐酸对溶剂进行酸化，容易把氯离子带入产品中，导致产品氯离子超标；申请号201710522268.5的中国专利申请公开了一种欧洲越橘提取物的制备方法，该方法以欧洲越橘为原料，用果实重量3倍(二提4.5倍)体积量的95％乙醇常温搅拌提取，一提时需加硫酸进行提取，提取结束后再用饱和柠檬酸钠溶液调节提取液pH为3.0-3.5，离心过滤，浓缩，浓缩液再加水稀释得料液，料液用HPD100树脂吸附，pH为3.0-3.5的柠檬酸水溶液洗脱，80％-90％乙醇解吸，解吸的料液经浓缩、干燥得欧洲越橘提取物，该方法工艺过程简单，容易操作，便于工业化生产，但提取过程中乙醇用量大，乙醇浓度高，使得后续提取浓缩成本高。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明的目的是提供一种越橘提取物的制备方法，得到的提取物中花青素类物质产率高，纯化效果较好，同时还减少了废料的产生，绿色环保。

本发明的技术构思如下：

一种越橘提取物的制备方法，以越橘生物酶发酵液为原料制备越橘提取物，所述越橘生物酶发酵液包括以下处理工序：

步骤一：将越橘浆果和/或加工余料破碎后经混合菌发酵过滤后得到发酵提取液a，所述混合菌为能产生纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶的菌种；

步骤二：将所述发酵提取液a经二次发酵过滤后得到发酵提取液b，精提所述发酵提取液b后即得越橘提取物，所述二次发酵工序采用将苹果黑星菌孢子悬浮液接种于所述发酵提取液a中发酵的工艺。

在本方案设计中，所用的混合菌菌种可以通过各种商业途径购买得到，例如可以通过中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）购买得到，所用苹果黑星菌为当地采集并通过单孢分离试管扩大培养得到。

在本方案设计中，首先采用复合生物酶温和酶解辅助有益微生物发酵，发酵过程中由于不断溶出的有机酸，使得发酵环境成呈酸性且在常温条件下，越橘原花青素不会造成流失；由于发酵产生的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶对原料进行了进一步分解，使得越橘中的有效成分得到充分释放，经测定发酵提取液a中原青花素含量可达70-85mg/ml。本发明采用苹果黑星菌对发酵提取液a进行二次发酵，目的在于纯化青花素提取物，这是由于苹果黑星菌不仅具有耐酸性且在常温条件下活性较高，且苹果黑星菌可产生高活性的果胶酶和角质酶，果胶酶可对发酵液进行进一步的分解，而角质酶则起到至关重要的催化原青花素上的酚羟基与有机酸的酯化反应，生成溶于发酵液且稳定的酯化产物，降低了原青花素易分解导致青花素产率低的不良效果，而产生的酯化产物在弱碱性环境下即可分解提取得到花青素提取物，是一种得到高产率花青素提取物的有效方法。

作为本发明的优选，苹果黑星菌孢子悬浮液为将制备发酵提取液a后剩余的滤渣作诱导产孢培养基进行黑星菌诱导产孢制备得到的苹果黑星菌孢子悬浮液。

在本方案设计中，采用滤渣作为苹果黑星菌的诱导产孢培养基可以充分利用提取废料，

节约资源，且经本发明人试验验证滤渣作为苹果黑星菌的诱导产孢培养基，可达到与常规培养基相当的效果，其原因在于，提取废料中含有苹果黑星菌所需的氨源、碳源，更具有相当含量的有机酸和有机硒以及菌体产生的矿物质，具有有利于苹果黑星菌产孢的效果。

作为本发明的优选，苹果黑星菌孢子悬浮液：发酵提取液a为1：15~25。

作为本发明的优选，苹果黑星菌孢子悬浮液浓度为0.8~1.2个/ml。

作为本发明的优选，诱导产孢养基的成分包括：滤渣、大麦粒，所述滤渣：大麦粒为1~2:2。

作为本发明的优选，步骤一种混合菌包括：酵母菌、植物乳酸杆菌、绿色木霉、嗜热链球菌、双歧杆菌中的二种或两种以上。

作为本发明的进一步优选，步骤一中混合菌包括：酵母菌、植物乳酸杆菌、绿色木霉。

作为本发明的进一步优选，酵母菌：植物乳酸杆菌：绿色木霉为3:2:1。

本发明具有以下有益效果：

本发明采用复合酶发酵越橘混合料，再对得到的发酵液进一步进行纯化发酵，在温和的酶解条件下对原花青素进行保护，并在第二次发酵过程中催化了原花青素的酯化过程，使发酵液中的花青素转化为稳定的花青素酯化物，使得最后得到的提取物中花青素类物质产率高，纯化效果较好，而得到的花青素酯化物在弱碱环境下即可水解还原成花青素、花色苷。

本发明采用越橘混合料初次发酵后的滤渣作为苹果黑星菌的诱导产孢培养基，可达到与常规使用的诱导产孢培养基相当的效果，同时还减少了废料的产生，绿色环保。

具体实施方式

实施例1

一种橘提取物的制备方法，

（1）备料：以欧洲越橘冻果为原料，按料液质量体积比(W:V)1：2加入温度为50℃~60℃热水解冻，进行投料粉碎，然后进行灭菌处理，得到越橘混合液。

（2）混合菌株活化：将酵母菌Saccharomyces cerevisiae（YPD培养基），植物乳酸杆菌Lactobacillus plantarum（LB培养基）和绿色木霉Trichoderma viride（LB培养基）分别活化，培养至对数生长中后期，然后制备成混合菌剂（酵母（1.5*10⁸cfu/ml）、植物乳酸杆菌（1.0*10⁸cfu/ml）、绿色木霉（0.5*10⁸cfu/ml））。

（3）生物酶解：向步骤（1）得到的越橘混合液中加入步骤（2）制得的混合菌剂，配比为15:1，搅拌均匀后于20℃下密封发酵5d，从开始发酵到第三天为止，每隔5h搅拌一次，第四天每隔8h搅拌一次，第五天每隔12h搅拌一次，得到发酵液和滤渣；

（4）苹果黑星菌制备：将采集的苹果黑星病叶采集后在PDA分离纯化，保存在5℃冰箱中，诱导产孢前在PDA培养基上活化。

（5）产孢培养基制备：取步骤（3）得到的滤渣，用水洗涤3次后干燥至含水率为30~35%左右，然后制备苹果黑星菌诱导产孢培养基：处理后的滤渣30g、经水浸泡1h后的大麦粒40g，置于三角瓶中，加入6%蜂蜜稀释液20ml，1%蛋白胨液20ml，然后进行灭菌处理。

（6）将活化后的黑星菌接入步骤（5）制备得到三培养瓶中，25℃下黑暗培养10d后转入PDA培养皿中，黑光灯（365nm）诱导产孢5d，将诱导产生分生孢子配成孢子悬浮液，浓度为10⁶个/ml。

（7）将步骤（3）得到的发酵液中加入步骤（6）得到的孢子悬浮液，配比为发酵液：孢子悬浮液=20:1，

混合均匀后置于25℃、pH5.0恒温发酵70h，每隔5h搅拌一次，过滤得到二次发酵液。

（8）将得到的二次发酵液灭菌后加入70%乙醇常温提取2h，提取2次，提取后离心过滤得到提取液，加入碳酸氢钠调节pH为7.5~8.0左右，反应2h，减压浓缩后加入赋形剂麦芽糊精，喷雾干燥，即得到越橘提取物。

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于，将滤渣用水洗涤3次后干燥至含水率为30~35%左右，然后制备苹果黑星菌诱导产孢培养基：处理后的滤渣20g、经水浸泡1h后的大麦粒50g，置于三角瓶中，加入6%蜂蜜稀释液20ml，1%蛋白胨液20ml，然后进行灭菌处理。

实施例3

本实施例与实施例1的不同之处在于，将滤渣用水洗涤3次后干燥至含水率为30~35%左右，然后制备苹果黑星菌诱导产孢培养基：处理后的滤渣40g、经水浸泡1h后的大麦粒30g，置于三角瓶中，加入6%蜂蜜稀释液20ml，1%蛋白胨液20ml，然后进行灭菌处理。

实施例4

本实施例与实施例1的不同之处在于，将滤渣用水洗涤3次后干燥至含水率为30~35%左右，然后制备苹果黑星菌诱导产孢培养基：处理后的滤渣50g、经水浸泡1h后的大麦粒20g，置于三角瓶中，加入6%蜂蜜稀释液20ml，1%蛋白胨液20ml，然后进行灭菌处理。

实施例5

本实施例与实施例1的不同之处在于，将滤渣用水洗涤3次后干燥至含水率为30~35%左右，然后制备苹果黑星菌诱导产孢培养基：处理后的滤渣70g，置于三角瓶中，加入6%蜂蜜稀释液20ml，1%蛋白胨液20ml，然后进行灭菌处理。

实施例6

本实施例与实施例1的不同之处在于，产孢培养基为经水浸泡1h后的大麦粒70g，置于三角瓶中，加入6%蜂蜜稀释液20ml，1%蛋白胨液20ml，然后进行灭菌处理。

实施例7

本实施例与实施例1的不同之处在于，步骤（7）中二次发酵的时间为50h。

实施例8

本实施例与实施例1的不同之处在于，步骤（7）中二次发酵的时间为60h。

实施例9

本实施例与实施例1的不同之处在于，步骤（7）中二次发酵的时间为80h。

实施例10

本实施例与实施例1的不同之处在于，步骤（7）中二次发酵的时间为90h。

对实施例1~10进行花青素以及花色苷测定，结果如下：

上述数据表明：实施例1-6对比发现使用残渣作为培养基在实施例1合适的配比下与使用常规的大麦培养基效果相当，而若残渣：大麦的配比大于3/4，则会影响黑星菌的产孢效果；实施例7-10对比发现，发酵时间对花青素和花色苷的产率也具有明显影响，在60~80h内发酵的产率都不错，优选为70h发酵。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。