阅读说明：本技术 泥蚶血红蛋白抗菌肽在食品防腐保鲜中的应用 (Application of tegillarca granosa hemoglobin antibacterial peptide in food preservation and freshness keeping ) 是由 杨燊 董玉婷 李健 谢婷玉 章跃陵 刘光明 于 2020-03-10 设计创作，主要内容包括：本发明提出了泥蚶血红蛋白抗菌肽在食品防腐保鲜中的应用,所述泥蚶血红蛋白抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。该抗菌肽对单增李斯特菌具有很强的抗菌作用,可吸附在单增李斯特菌细胞膜表面并对细胞膜进行破坏导致单增李斯特菌死亡,可改变单增李斯特菌细胞膜的通透性并抑制细胞膜生成。从而为寻找新的食品防腐剂提供实验依据,促进我国食品行业的健康、持续发展。(The invention provides an application of tegillarca granosa hemoglobin antibacterial peptide in food preservation and fresh keeping, wherein the amino acid sequence of the tegillarca hemoglobin antibacterial peptide is shown as SEQ ID NO. 1. The antibacterial peptide has strong antibacterial effect on Listeria monocytogenes, can be adsorbed on the surface of the cell membrane of Listeria monocytogenes and can destroy the cell membrane to cause the death of Listeria monocytogenes, can change the permeability of the cell membrane of Listeria monocytogenes and inhibit the generation of the cell membrane. Thereby providing experimental basis for searching new food preservative and promoting the healthy and sustainable development of food industry in China.)

泥蚶血红蛋白抗菌肽在食品防腐保鲜中的应用

技术领域

本发明涉及食品微生物技术领域，具体涉及一种泥蚶血红蛋白抗菌肽在食品防腐保鲜中的应用。

背景技术

单增李斯特菌是一种食源性病原体，常在食品中检测到，其是世界卫生组织定义的四大食源性病菌之一。该菌能通过污染的食物进入人畜体内，引发败血症、脑膜炎和单核细胞增多等症状。此外，食源性致病菌除了对人体健康产生影响外，在食品加工和贮藏过程中还造成巨大的经济损失。

泥蚶(Tegillarca granosa)是一种双壳软体动物，分布于从南非东海岸到中国、东南亚和澳大利亚的广泛区域。与大多数软体动物使用血蓝蛋白进行氧气运输不同，泥蚶是使用血红蛋白运输氧气。泥蚶的血红蛋白不仅作为氧载体，而且在免疫反应中发挥一定作用。相关技术中利用酶解的办法分离得到泥蚶血红蛋白抗菌肽的抗菌效果不理想，且泥蚶血红蛋白及其多肽对单增李斯特菌是否有抑菌活性未见有报道。

发明内容

为了解决上述问题之一，本发明提出了一种泥蚶血红蛋白抗菌肽在食品防腐保鲜中的应用。该抗菌肽对单增李斯特菌具有很强的抗菌作用。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种泥蚶血红蛋白抗菌肽在食品防腐保鲜中的应用，所述泥蚶血红蛋白抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

根据本发明的实施例，该泥蚶血红蛋白抗菌肽的分子量为2049Da，利用透射电镜观察对细菌细胞膜的破坏程度；利用激光共聚焦显微镜观察抗菌肽是否能吸附在细菌表面；再验证TGH1对单增李斯特菌细胞膜通透率和成膜性的影响；用圆二色谱测定抗菌肽的α-螺旋和β-折叠等二级结构含量，并初步预测抗菌肽的二级结构；最后对它的人体安全性影响进行评估。实验结果表明，该抗菌肽对单增李斯特菌具有强烈的抑制作用，它的抑菌机理是首先吸附在细菌表面，然后改变细胞膜的通透性和成膜作用，破坏细菌的细胞膜，同时它对人体正常肝细胞毒性极低。从而为寻找新的食品防腐剂提供实验依据，促进我国食品行业的健康、持续发展。

另外，根据本发明的实施例，上述的应用还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述应用为抑制单增李斯特菌的生长。

根据本发明的实施例，所述应用为吸附在单增李斯特菌细胞膜表面并对细胞膜进行破坏导致单增李斯特菌死亡。

根据本发明的实施例，所述应用为改变单增李斯特菌细胞膜的通透性并抑制细胞膜生成。

根据本发明的实施例，所述泥蚶血红蛋白抗菌肽以溶液的形式直接喷涂于固体食品的表面，或混合于液体食品中。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种防腐保鲜剂，其包含泥蚶血红蛋白抗菌肽及食品学上可接受的辅料，所述泥蚶血红蛋白抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

根据本发明的防腐保鲜剂，可较好的抑制食品中单增李斯特菌的生长。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为根据本发明实施例的TGH1对几种常见致病菌最低抑制浓度(MIC)测定；

图2为根据本发明实施例的TGH1对单增李斯特菌的杀灭时间曲线；

图3为根据本发明实施例的单增李斯特菌的透射电镜观察；

图4为根据本发明实施例的TGH1处理的单增李斯特菌细胞的共聚焦显微镜观察；

图5为根据本发明实施例的经TGH1处理后的单增李斯特菌内膜通透性变化；

图6为根据本发明实施例的TGH1对单增李斯特菌生物膜形成的抑制作用；

图7为根据本发明实施例的TGH1的二级结构分析；

图8为根据本发明实施例的TGH1的预测模型结构视图；

图9为根据本发明实施例的TGH1对正常人肝细胞(LO2细胞)活力的影响。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

需要说明的是，以下的试剂和菌均购于市场。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1泥蚶血红蛋白衍生抗菌肽的筛选

泥蚶的血红蛋白序列由152个氨基酸组成：

由于细菌的细胞膜带负电，因此带负电的氨基酸不利于肽的抗菌活性，而泥蚶的血红蛋白序列中存在较多的负电荷区域，仅三个区域(序号22-39，序号59-81、序号92-109)存在较少负电荷。TWEMVSGKKKNGVVLMIK净正电荷数为+3。

赖氨基(K)具有稳定多肽二级结构作用，二级结构可以保证多肽抗菌作用的实现。在泥蚶的血红蛋白序列中仅有序号22-39的这个片段存在4个赖氨酸(K)，而序号59-81和序号92-109两个片段赖氨基(K)数量分别为1个和2个。

根据软件APD3的分析计算，片段TWEMVSGKKKNGVVLMIK具有44％的疏水率，较高的疏水率可以让抗菌肽更好的结合细菌的细胞膜，而序号59-81和序号92-109两个片段分别为36％和41％，都较序号22-39片段低。

综上所述，泥蚶的血红蛋白序列中片段TGH1：TWEMVSGKKKNGVVLMIK(序号22-39)具有典型的抗菌肽结构特征。

实施例2最低抑制浓度(MIC)测定

将单增李斯特菌在37℃培养12h至对数生长期，在0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液中稀释至10⁶CFU/mL。将实施例1的抗菌肽TGH1溶于磷酸盐缓冲中，37℃等体积与单增李斯特菌菌混合2h。最低抑菌浓度(MIC)是指在37℃孵育过夜后，从微量滴定板上看不到细菌生长的抗菌肽最低浓度。结果表明，抗菌肽TGH1对单增李斯特菌的最低抑菌浓度(MIC)为15.6μg/mL，如图1所示。而抗菌肽TGH1对大肠杆菌的MIC大于1000μg/mL；对乙型链球菌MIC大于1000μg/mL；对金黄色葡萄球菌大于1000μg/mL。抗菌肽TGH1对单增李斯特菌有着非常强的抑制作用，而其对大肠杆菌、乙型链球菌和金黄色葡萄球菌作用很弱，表现出对单增李斯特菌抑制的专一性。

实施例3抗菌肽TGH1的时间与致死关系分析

采用平板菌落计数法评估抗菌肽的时间杀伤动力学。将培养的单增李斯特菌调节至约10⁶CFU/mL浓度，暴露在不同浓度下的抗菌肽TGH1中，然后在37℃孵育5h，分别在0、1、2、3、4和5小时观察残留细菌的数量。以磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.2)培养的指示菌株为阴性对照。

结合图2，其中，a：无菌水；b：0.5mg/mL氨苄青霉素；c：1.0mg/mL抗菌肽TGH1；d：0.5mg/mL抗菌肽TGH1；e：0.25mg/mL抗菌肽TGH1；f：0.125mg/mL抗菌肽TGH1；g：62.5μg/mL抗菌肽TGH1；h：31.25μg/mL抗菌肽TGH1；i：15.6μg/mL抗菌肽TGH1。从时间-杀灭曲线也可以看出，随着抗菌肽TGH1浓度的增加，细菌数量减少。当浓度为1×MIC时，4h后细菌数量下降90.4％，5h后细菌数量下降99.5％，表明TGH1肽对单增李斯特菌有较强的抗菌活性。

实施例4透射电镜分析

以10⁶CFU/mL的单增李斯特菌在37℃下用2×MIC的抗菌肽TGH1处理2h，然后在2700g下离心10min，用磷酸盐缓冲液(pH 7.2)洗涤两次。用1％的锇酸固定后，用95％乙醇脱水，然后丙酮处理20min。样品在70℃下烘烤24h，在铜网格上制备70-90nm的薄片，然后用柠檬酸铅和乙酸铀酯染色。用H-7650透射电子显微镜观察和捕获超微结构。

如图3A所示，对于未经处理的细菌，细菌细胞的胞内组织和结构完整性良好。然而，用抗菌肽TGH1处理30min后，可以看到细菌细胞膜结构开始随着细胞空泡化而模糊(图3B)。经过2h的处理后，细胞的形状变得不规则，细胞膜完全塌陷，细胞质内容物流出(图3C)。透射电子显微镜结果表明，抗菌肽TGH1对单增李斯特菌细胞膜具有破坏作用，且破坏程度随处理时间的延长而增加。

实施例5TGH1在细菌细胞表面的聚集

单增李斯特菌培养至对数期后，将细菌浓度调至10⁶CFU/mL，用加荧光标记的抗菌肽TGH1在37℃，2×MIC浓度下孵育60分钟，然后离心、洗涤细胞，用磷酸盐缓冲液重新悬浮，然后用激光共聚焦扫描显微镜进行分析。

结合图4，其中A为荧光图像，B为明野图像，C为合并图像。抗菌TGH1能聚集在单增李斯特菌细胞表面上，在抗菌肽与细胞膜相互作用过程中，抗菌肽覆盖细胞表面直至达到阈值浓度，导致细胞膜破坏和细胞死亡。

实施例6抗菌TGH1对单增李斯特菌细胞膜的通透性的影响

当膜通透性增加时，2-硝基苯基β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)进入细胞质，在单增李斯特菌细胞中的β-半乳糖苷酶的作用下降解为邻硝基苯酚，在420nm处有吸光度。通过测定产生的邻硝基苯酚水平来测定TGH1处理后细胞膜通透性的变化，具体步骤如下，在LuriaBertani(LB)中生长的单增李斯特菌在2700g下离心10min，在以乳糖为唯一碳源的M9培养基中培养，并在37℃下培养至OD₆₀₀＝0.4。然后分别加入0.5mg/mL 2-硝基苯基β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)和不同浓度的TGH1在37℃振荡培养，在420nm处测量随时间变化的邻硝基苯酚的产生量。如图5所示，单增李斯特菌的细胞膜通透性与TGH1的浓度呈正相关，随着TGH1的浓度的增大，其膜的通透性逐渐增大，导致细菌死亡。

实施例7抗菌肽TGH1对单增李斯特菌细胞膜成膜作用的影响

为了研究抗菌肽TGH1对生物膜形成的影响，将单增李斯特菌置于低浓度的TGH1下培养，观察其对细菌细胞膜形成的影响。具体操作如下：通过离心收集单增李斯特菌细胞，再悬浮于Luria Bertani(LB)肉汤中，然后与不同浓度的等体积TGH1相应稀释液混合。将混合物加入96孔平底板中，在37℃下孵育72h，然后用PBS(pH7.2)轻轻洗涤3次，去除未附着的细胞，然后加入200μL 0.1％结晶紫。培养皿于25℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤以去除结晶紫。在室温下干燥板后，向每个孔中添加200mg 95％乙醇。Nisin和PBS分别作为阳性对照和阴性对照。生物膜形成能力与抗菌肽TGH1浓度呈负相关。但当抗菌肽TGH1浓度低于1/4MIC时，对生物膜的形成影响不大，而当抗菌肽TGH1浓度为1MIC时，生物膜不形成，如图6所示。生物膜的形成代表了一种受保护的生长方式，为细菌细胞能够在恶劣的环境中生存提供保护，这被认为是食品加工行业的主要健康风险。因此，TGH1的抑制生物膜生成活性是该肽的一个很好的特征，表明它可以被用作防腐剂。

实施例8抗菌肽TGH1二级结构含量的分析

使用Jasco 810圆二色谱仪对TGH1进行圆二色谱(CD)分析。将抗菌肽TGH1溶于25mM十二烷基硫酸钠(SDS)中，最终浓度为0.25mg/mL。使用1mM长的石英比色杯，数据记录范围为190-250nm。具体步骤如下：完全开启氮气瓶总阀，打开减压阀，使表头保持在0.1Pa。开启仪器侧面的氮气流量计，是气流保持在3-5L/min。将配制好的样品装进1mm石英比色皿中，放入样品架中，溶液样品架放在靠光圈侧，盖上盖板，当波长扫描至400nm，开启氮气保护至扫描结束。利用CDPro软件，把CD数据降序导出到记事本。计算方法，α螺旋含量＝H(r)+H(d)；β折叠＝S(r)+S(d)；β转角＝Trn；无规则卷曲＝Unrd。

结果发现TGH1具有0.7％的α螺旋、55.6％的β折叠(反平行)、21.7％的β转角和22.4％的无规则卷曲(图7A和7B)。根据二级结构的含量，10个氨基酸在THG1中形成β折叠，β折叠结构是抗菌肽的主要结构特征之一。利用从头计算软件I-TASSER预测TGH1模型(图8)。

实施例9抗菌TGH1对人体正常肝细胞的影响

MTT(3-(4-5-二甲基噻唑-2-基)-2-5-二苯基-2H-四唑溴化铵)法是评价细胞毒性的经典方法。具体操作如下：将10mg/mL正常人肝细胞(LO2)加入96孔板，在5％CO₂和37℃二氧化碳培养箱中孵育，直至细胞贴壁，然后加入不同浓度梯度的TGH1至每个孔。在37℃的5％CO₂中孵育24小时。培养结束后，在每个孔中加入5mg/mL浓度20μm的MTT溶液，在37℃下继续孵育4h，弃去孔板上清液，在每个孔中加入150μL二甲基亚砜，将晶体完全溶解于低速摇床10分钟，在490nm下测定吸光度值。Nisin和PBS分别作为阳性对照和阴性对照。结果显示，不同TGH1浓度对LO2细胞没有不良的细胞毒性作用，发现细胞存活率大于96％，如图9所示。TGH1的细胞毒作用与NISIN相似，说明TGH1在食品工业中具有潜在的应用前景。

综上，本发明实施例利用透射电镜观察对细菌细胞膜的破坏程度；利用激光共聚焦显微镜观察抗菌肽是否能吸附在细菌表面；再验证TGH1对单增李斯特菌细胞膜通透率和成膜性的影响；用圆二色谱测定抗菌肽的α-螺旋和β-折叠等二级结构含量，并初步预测抗菌肽的二级结构；最后对它的人体安全性影响进行评估。实验结果表明，该抗菌肽对单增李斯特菌具有强烈的抑制作用，它的抑菌机理是首先吸附在细菌表面，然后改变细胞膜的通透性和成膜作用，破坏细菌的细胞膜，同时它对人体正常肝细胞毒性极低。从而为寻找新的食品防腐剂提供实验依据，促进我国食品行业的健康、持续发展。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 集美大学

<120> 泥蚶血红蛋白抗菌肽在食品防腐保鲜中的应用

<130> 无

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Trp Glu Met Val Ser Gly Lys Lys Lys Asn Gly Val Val Leu Met

1 5 10 15

Ile Lys