阅读说明：本技术 一种双组氨酸抗菌剂及制备方法和应用 (Double-histidine antibacterial agent, preparation method and application ) 是由 崔海英 张承慧 林琳 朱玉林 于 2019-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于食品安全领域,具体涉及一种冷等离子体改性的双组氨酸抗菌剂的制备方法和应用。本发明将固体双组氨酸暴露于氮气等离子体中利用冷等离子体对双组氨酸表面进行轰击,得到冷等离子体改性的双组氨酸。与未改性的双组氨酸相比,冷等离子体改性双组氨酸抗菌活性显著提升。其在体外抗菌和抗生物膜中表现出活性提升,且对于生菜表面的生物膜清除效果显著。拓展了其在食品领域的应用。(The invention belongs to the field of food safety, and particularly relates to a preparation method and application of a cold plasma modified bi-histidine antibacterial agent. According to the invention, solid double-histidine is exposed to nitrogen plasma, and the cold plasma is utilized to bombard the surface of the double-histidine, so as to obtain the cold plasma modified double-histidine. Compared with unmodified bishistidine, the cold plasma modified bishistidine has obviously improved antibacterial activity. It has raised activity in vitro antibiotic and biomembrane resisting effect and obvious biomembrane eliminating effect on lettuce surface. The application of the food additive in the food field is expanded.)

一种双组氨酸抗菌剂及制备方法和应用

技术领域

本发明属于食品安全领域，具体涉及一种冷等离子体改性的双组氨酸抗菌剂及制备方法和应用。

背景技术

随着生活水平的提高和科技的进步，人们对食品卫生安全越来越重视，这促进了抗菌剂的发展。安全无毒，抗菌效率高的抗菌剂备受人们青睐。

双组氨酸(dihistidine,His-His,HH)属于一种新型的生物自组装材料，是制备生物功能性纳米材料的重要基元。它由两个组氨酸脱水缩合构成，结构包含两个苯环，一端是-NH₂,一端是-COOH,在等电点时以兼性离子形式存在，具有很大的潜在利用价值。

等离子体(plasma)被称为除固态、液态和气态之外的第四种物质存在形态，是由电子、离子、自由基和中性粒子组成的导电性流体，整体保持电中性。通过持续加热气体、施加强电磁场等方法将分子结构破坏为原子，发生电离后即可获得等离子体。低温等离子体的气体温度相对较低，产生的等离子体具较高密度、分布均匀、便于利用并具备良好的可控性。低温等离子体在生成过程中发生多种物理、化学反应后产生：电磁场、热、紫外线、带电粒子、激发态粒子、亚稳态粒子等。这些活性组分蕴含很高的足以破坏化学键的能量势，可以开启一系列的物理化学反应，从而对物质的性质进行改造。CN109569684A公开了一种等离子体改性金属氧化物和g-氮化碳共修饰二氧化钛纳米棒复合光催化剂及其制备和应。CN108409887A公开了一种抗菌多糖的制备方法,对多糖溶液进行了大气压等离子体射流放电处理。以上专利均利用了等离子体改善了物质的生物活性。

本发明利用冷等离子体技术对双组氨酸进行性质改造，旨在改善双组氨酸的生物活性，提高其抗菌能力，拓展其在食品行业中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种经冷等离子体改性的双组氨酸抗菌剂及制备方法和其在食品安全领域中的应用。

本发明的制备方法是先用冷等离子体处理固体双组氨酸，然后制备改性双组氨酸溶液得到改性双组氨酸抗菌剂。

所述冷等离子体处理是以氮气为激发气体，氮气流量为100sccm，冷等离子体处理时间为3～5min，处理功率为300～500W。

所述的改性双组氨酸溶液的制备方法为：将改性双组氨酸溶解至***中，使改性双组氨酸充分溶解，然后加入蒸馏水。

所述的利用***溶解改性双组氨酸，是指置于磁力搅拌器上以200rpm的转速室温搅拌1min。

所述的改性双组氨酸溶液，加入蒸馏水后溶液浓度为5-10mg/mL。

双组氨酸制备成本高，因此本发明利用低温等离子体在生成过程中产生的带电粒子、激发态粒子等，对双组氨酸的性质进行改造，从而提高双组氨酸的生物活性及抗菌活性。本发明所获得的改性双组氨酸既节约成本又可获得更优的抗菌活性。

附图说明

图1冷等离子体改性双组氨酸抗菌剂对游离金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抗菌效果。

图2冷等离子体改性双组氨酸抗菌剂对S.aureus生物膜的抗菌效果。

图3冷等离子体改性双组氨酸抗菌剂在4℃对生菜表面S.aureus生物膜的清除作用。

图4冷等离子体改性双组氨酸抗菌剂在25℃对生菜表面S.aureus生物膜的清除作用。

具体实施方式

通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此。

实施例1冷等离子体改性双组氨酸抗菌剂的制备

1.试验材料与设备

2.试验方法

冷等离子体改性双组氨酸抗菌剂制备步骤如下：

1)将装有双组氨酸固体的小烧杯管置于冷等离子体表面处理仪中，氮气流量为100sccm，用300-500W的冷等离子处理3～5min。

2)加入***后置于磁力搅拌器上室温搅拌1min，转速200rpm。

3)加入蒸馏水使改性双组氨酸溶液浓度为5-10mg/mL，得到改性双组氨酸抗菌剂。

实施例2冷等离子体改性双组氨酸抗菌剂体外对S.aureus及其生物膜的抗菌效果

1.试验材料与设备

2.试验方法

1)冷等离子体改性双组氨酸抗菌剂体外对S.aureus的抗菌效果

①S.aureus接种于营养肉汤液体培养基中，37℃振荡(150rpm)培养24h得到对数生长期的金黄色葡萄球菌。

②将对数生长期的S.aureus加入到无菌磷酸缓冲液中，梯度稀释至10⁴-10⁵CFU/mL，然后加入抗菌剂(双组氨酸，改性双组氨酸)，使之终浓度为3.3mg/mL。

③将添加了抗菌剂的细菌悬浮液在37℃条件下培养24h，然后利用平板计数法测定残存菌数。加入未改性的双组氨酸作为对照组，不做任何处理的S.aureus菌悬液作为空白组。

2)等离子体改性双组氨酸抗菌剂体外对S.aureus生物膜的抗菌效果

①S.aureus接种于营养肉汤液体培养基中，37℃振荡(150rpm)培养48h得到对数生长期的金黄色葡萄球菌。

②在24孔板中加入500μL S.aureus悬浮液(10⁸CFU/mL)后，每孔加入TSB培养基5mL,加入无菌盖玻片(2cm×2cm)，37℃条件下恒温静置培养2d。

③用无菌磷酸缓冲液清洗盖玻片以除去游离菌，加入抗菌剂(双组氨酸，改性双组氨酸)使之终浓度为6.6mg/mL，处理24h。

④将一片盖玻片取出放入离心管，加入10mL无菌磷酸缓冲液超声30min分散为游离菌，采用平板计数法测定残存菌数。加入未改性的双组氨酸作为对照组，不做任何处理的S.aureus生物膜作为空白组。

3.试验结果

1)冷等离子体改性双组氨酸抗菌剂体外对S.aureus的抗菌效果

如图1所示，与空白组相比，对照组和改性双组氨酸组残存菌数均显著下降，且改性双组氨酸组杀菌效果更显著。在3.3mg/mL双组氨酸作用24h后，金黄色葡萄球菌从5.462log CFU/mL下降至3.104log CFU/mL，杀菌率达到99.56，而经冷等离子体改性的双组氨酸作用后金黄色葡萄球菌下降至1.065log CFU/mL，杀菌率达到99.99％，结果表明经冷等离子体处理后双组氨酸的抗菌效果增强。

2)等离子体改性双组氨酸抗菌剂体外对S.aureus生物膜的抗菌效果

如图2所示，与空白组相比，对照组和改性双组氨酸组均展现出良好的生物膜清除效果，且改性双组氨酸组清除效果显著。双组氨酸作用24h后，S.aureus生物膜清除率达到95.80％，而经冷等离子体改性的双组氨酸作用后S.aureus生物膜清除率达到99.94％，结果表明经冷等离子体处理后双组氨酸的抗菌效果增强，与前面的结果一致。

实施例3冷等离子体改性双组氨酸抗菌剂体对生菜表面S.aureus生物膜的清除作用

1.试验材料

2.试验方法

①将生菜切成1×1cm²的样品。为了减少天然微生物群落，将样品用紫外光处理30min。

②将样品接种到金黄色葡萄球菌悬浮液(10^3-4CFU/mL)中1h以粘附细菌，然后将样品干燥并在25℃下孵育48h。

③将样品浸入10mg/mL改性双组氨酸溶液中，将样品在4℃或25℃温育。

④分别在0,1,2和3d后，将每组样品转移至无菌均质袋中，该袋均补充有10mLPBS，利用均质器均质5min。随后，使用平板菌落计数计数细菌数。加入未改性的双组氨酸作为对照组，不做任何处理的S.aureus生物膜作为空白组。

3.试验结果

如图3所示，在4℃空白组在3d后菌落数上升至10⁷CFU/mL,而对照组和改性双组氨酸组残存菌数均显著下降，且改性双组氨酸组杀菌效果更显著。在10mg/mL双组氨酸作用3d后，金黄色葡萄球菌从6.375log CFU/mL下降至4.86log CFU/mL，杀菌率达到96.95％，而经冷等离子体改性的双组氨酸作用后金黄色葡萄球菌下降至3.246log CFU/mL，杀菌率达到99.93％，结果表明经冷等离子体处理后双组氨酸的抗菌效果增强。如图4所示，在25℃，空白组菌落数在1d后迅速上升至10⁸CFU/mL，而对照组和改性双组氨酸组表现出与4℃类似的杀菌效果。综上得该改性双组氨酸具有更加优异的抗菌活性。