阅读说明：本技术 一种冷等离子体处理的双精氨酸抗菌剂及制备方法和应用 (Cold plasma treated bis-arginine antibacterial agent, preparation method and application ) 是由 林琳 廖雪 崔海英 朱玉林 于 2019-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于食品安全领域,具体涉及一种冷等离子体处理的双精氨酸抗菌剂及制备方法和应用。利用双精氨酸的优良抗菌效果,并通过冷等离子体对双精氨酸粉末进行表面改性,进一步提高抗菌效果,制备一种安全绿色、无毒副作用新型抗菌剂。该种新型抗菌剂能有效杀死各种食源性病原菌,院内感染菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等,与不处理的双精氨酸相比,冷等离子体处理的双精氨酸在磷酸缓冲液和肉汤中的抗菌效果都有了明显的提升。(The invention belongs to the field of food safety, and particularly relates to a double-arginine antibacterial agent treated by cold plasma, and a preparation method and application thereof. The excellent antibacterial effect of the double arginine is utilized, the cold plasma is used for carrying out surface modification on the double arginine powder, the antibacterial effect is further improved, and the novel safe, green and toxic-side-effect-free antibacterial agent is prepared. The novel antibacterial agent can effectively kill various food-borne pathogenic bacteria and nosocomial infectious bacteria such as methicillin-resistant staphylococcus aureus and the like, and compared with untreated double arginine, the antibacterial effect of the cold plasma treated double arginine in phosphate buffer solution and broth is obviously improved.)

一种冷等离子体处理的双精氨酸抗菌剂及制备方法和应用

技术领域

本发明属于食品安全领域，具体涉及一种冷等离子体处理的双精氨酸抗菌剂及制备方法和应用。

背景技术

现有的抗菌剂品种很多，绝大多数使用的是具有一定毒性的有机抗菌剂，如香草醛或乙基香草醛类化合物。在这种背景下，食品安全领域急需一种安全无毒，具有广谱抗菌效果的抗菌剂。

双精氨酸是一种最小的生物自组装材料之一，其结构式如下，是由两个精氨酸脱水缩合而成，一端是氨基-NH₂,一端是羧基-COOH,在等电点时以兼性离子形式存在，即一端是-NH₃ ⁺,一端是-COO^-。双精氨酸在许多溶剂都可以自组装，如甲醇、氯仿、水等，它是一种研究广泛的短肽，因为其是由氨基酸组成，因此也是一种应用前景广泛的生物自组装材料。

等离子体(plasma)是指高度电离的气体，气体在受到外界高能量作用时电离产生的由大量带电粒子离子、电子和中性粒子原子、分子所组成的表现为电荷中性的体系。等离子态的各种活性物质可以产生不同的自由基和官能团，这将改变材料的表面性质，但不会改变整体性能。低温等离子体中绝大部分粒子的能量均略高于聚合物中的化学键能，通过电场加速后低温等离子体完全有足够的能量引起聚合物表面的各种化学键发生断裂或重新组合，因而会对分子材料表面进行改性。例如利用等离子体技术处理一些纳米纤维膜，可以改变膜的表面性质，提高膜的溶解度。再如用等离子体处理低密度聚乙烯，会提高乳酸链球菌肽的吸附量，对食品达到抗菌保鲜效果。因此，我们尝试使用低温等离子体对双精氨酸进行表面处理改性，进一步提高双精氨酸的抗菌效果。

国内有很多关于冷等离子体的专利申请。中国专利CN107633993B公开了一种冷等离子体双辉光放电蔬果种子处理装置；中国专利CN106381690A公开了冷等离子体预处理制备高强度抗菌油水分离型材料的方法；中国专利CN109122816A公开了一种等离子体处理的墨角兰提取物的制备方法及应用。但是关于冷等离子体处理的双精氨酸的专利还没有。

将冷等离子体与双精氨酸相结合，制备得到具有优良抗菌效应的新型抗菌剂，具有较好的应用前景和市场价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种冷等离子体处理的双精氨酸抗菌剂及制备方法和其在食品安全领域中的应用。

本发明所述抗菌剂的制备方法是先用冷等离子体处理双精氨酸固体粉末，得到冷等离子体改性的双精氨酸；再将双精氨酸加入醋酸溶液中，充分搅拌溶解双精氨酸，得到的双精氨酸醋酸溶液即为抗菌剂。

所述冷等离子体以氮气和氧气的混合气体为激发气体，流量为100sccm，冷等离子体处理时间为3-5min，处理功率为300-500W。

所述氮气和氧气的体积比为1:1。

所述双精氨酸醋酸溶液中：双精氨酸浓度为2-10mg/mL，醋酸体积百分浓度为1％-5％。

所述的搅拌条件为在25r/min的转速条件下磁力搅拌30min。

低温等离子体中绝大部分粒子的能量均略高于聚合物中的化学键能，通过电场加速后低温等离子体完全有足够的能量引起聚合物表面的各种化学键发生断裂或重新组合，因而会对分子材料表面进行改性。本发明利用冷等离子的高能量的优势，对双精氨酸进行表面修饰，进一步提高双精氨酸的抗菌效果。冷等离子体处理的双精氨酸抗菌剂可以实现安全无毒，低剂量高效(经济)和广谱抗菌等效果。

附图说明

图1冷等离子体处理的双精氨酸抗菌剂对沙门氏菌的抗菌效果。

图2冷等离子体处理的双精氨酸抗菌剂在鸡肉肉汤中沙门氏菌的抗菌效果。

图3冷等离子体处理的双精氨酸抗菌剂对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抗菌效果。

图4冷等离子体处理的双精氨酸抗菌剂在猪肉肉汤中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抗菌效果。

N.D.表示未检测出。

具体实施方式

通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此。

实施例1

冷等离子体处理的双精氨酸抗菌剂对沙门氏菌的抗菌效果

1实验材料

2实验方法

1)等离子体处理的双精氨酸的制备

将双精氨酸固体粉末置于等离子体处理仪中，用300-500W的冷等离子体处理3-5分钟。未处理的双精氨酸固体粉末和等离子体处理的双精氨酸固体粉末分别加入到3％醋酸溶液中分别得到9mg/mL的浓度,在25r/min的转速条件下磁力搅拌30min充分溶解，得到所述抗菌剂。

2)在PBS中的抗菌效果

①沙门氏菌接种于营养肉汤液体培养基中，37℃振荡(150rpm)培养24h得到对数生长期的沙门氏菌。

②将对数生长期的沙门氏菌加入到无菌磷酸缓冲液中，得到10^5-6CFU/mL浓度范围的菌悬液。然后将步骤1)中所配的两种抗菌剂溶液按抗菌剂溶液：菌悬液体积比1:2的比例分别加入菌悬液中，不处理的菌悬液为对照组。

③将经过不同处理的沙门氏菌37℃条件下培养1天，利用平板菌落计数法测定沙门氏菌的残存菌数。实验一式三份，结果取平均值。

3)在鸡肉肉汤中的抗菌效果评价

①称取一定量刚购买的新鲜鸡肉于均质袋中，加9倍体积的蒸馏水，使用均质机进行均质破碎，再使用四层纱布进行过滤，将滤液分装与蓝色盖试剂瓶中，121℃高压蒸汽灭菌30min备用。

②向各试剂瓶中加入一定量生长至对数期的沙门氏菌，使得每个试剂瓶中沙门氏菌菌悬液浓度为10^4-5CFU/mL。

③将步骤1)中所配的两种抗菌剂溶液按抗菌剂溶液：菌悬液体积比1:2的比例分别加入菌悬液中，不处理的菌悬液为对照组。

④将上述经过不同处理的试剂瓶放入37℃的恒温培养箱中培养2天，每天计算其残存菌数。残存菌落用平板计数法计算。

3实验结果

1)在PBS中的抗菌结果

由图1可以看出，等离子体处理的双精氨酸和不经冷等离子体处理的双精氨酸对沙门氏菌都起到了抑制效果，其中等离子体处理的双精氨酸的抗菌效果更佳，说明等离子体改善了双精氨酸的性质，提升了双精氨酸的抗菌效果。

2)在鸡肉肉汤中的抗菌效果

鸡肉肉汤中含有丰富的营养物质，可以促进沙门氏菌的增长繁殖。由图2可以看出，等离子体处理的双精氨酸在鸡肉肉汤中也有较好的抗菌效果，2天后残存菌数为0。

实施例2

冷等离子体处理的双精氨酸抗菌剂对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抗菌效果

1实验材料

2实验方法

1)等离子体处理的双精氨酸的制备

将双精氨酸固体粉末置于等离子体处理仪中，用300-500W的冷等离子体处理3-5分钟。未处理的双精氨酸固体粉末和等离子体处理的双精氨酸固体粉末分别加入到3％醋酸溶液中分别得到9mg/mL的浓度,在25r/min的转速条件下磁力搅拌30min充分溶解，得到所述抗菌剂。

2)在PBS中的抗菌效果

①耐甲氧西林金黄色葡萄球菌接种于营养肉汤液体培养基中，37℃振荡(150rpm)培养48h得到对数生长期的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

②将对数生长期的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌加入到无菌磷酸缓冲液中得到10^{5 -6}CFU/mL浓度范围的菌悬液。然后将步骤1)中所配的两种抗菌剂溶液按抗菌剂溶液：菌悬液(体积比1:2)分别加入菌悬液中，不处理的菌悬液为对照组。

③将经过不同处理的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌37℃条件下培养1天，利用平板菌落计数法测定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的残存菌数。实验一式三份，结果取平均值。

3)在猪肉肉汤中的抗菌效果评价

①称取一定量刚购买的新鲜猪肉于均质袋中，加9倍体积的蒸馏水，使用均质机进行均质破碎，再使用四层纱布进行过滤，将滤液分装与蓝色盖试剂瓶中，121℃高压蒸汽灭菌30min备用。

②向各试剂瓶中加入一定量生长至对数期的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，使得每个试剂瓶中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌悬液浓度为10^4-5CFU/mL。

③将步骤1)中所配的两种抗菌剂溶液按抗菌剂溶液：菌悬液体积比1:2的比例分别加入菌悬液中，不加处理的菌悬液为对照组。

④将上述经过不同处理的试剂瓶放入37℃的恒温培养箱中培养2天，每天计算其残存菌数。残存菌落用平板计数法计算。

3实验结果

1)在PBS中的抗菌结果

由图3可知，在不经冷等离子体处理的双精氨酸作用24h后，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌减少了2.69Log CFU/mL，杀菌率达到99.8％；而在冷等离子体处理的双精氨酸抗菌剂作用后，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌减少了5.5Log CFU/mL，杀菌率达到99.999％以上。结果表明，冷等离子体处理过双精氨酸对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)有很好的抗菌效果。

2)在猪肉肉汤中的抗菌效果

据文献报道，MRSA在猪肉中的检出率较高。猪肉肉汤中含有丰富的营养物质，可以促进耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的增长繁殖。由图4可以看出，等离子体处理的双精氨酸在猪肉肉汤中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)有较好的抗菌效果，2天后残存菌数为0。