阅读说明：本技术 西藏灵芝多糖glp-3及其制备方法与应用 (Tibetan ganoderma lucidum polysaccharide G L P-3 and preparation method and application thereof ) 是由 高雄 穆静静 谢意珍 胡惠萍 莫伟鹏 于 2020-04-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了西藏灵芝多糖GLP-3及其制备方法与应用,所述西藏灵芝多糖GLP-3提取于西藏灵芝粉末,其多糖含量为98.8％,重均分子量为159.7kDa,不含蛋白,主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖组成,其中葡萄糖的摩尔占比为92.7％,具有-OH、C-H、C＝O以及α-异构吡喃糖的特征吸收峰。本发明首次从西藏灵芝中分离制备出西藏灵芝多糖GLP-3,制备方法加入超滤步骤,直接按照多糖的分子量进行初步分离,降低了后续纯化的难度,且得到的多糖纯度较高；得到的多糖GLP-3可显著促进巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的能力,显著促进巨噬细胞RAW264.7产生NO、细胞因子和趋化因子,在免疫调节活性方面具有很好的食用和药用价值。(The invention discloses a Tibetan ganoderan G L P-3 and a preparation method and application thereof, wherein the Tibetan ganoderan G L P-3 is extracted from Tibetan ganoderan powder, the content of the polysaccharide is 98.8%, the weight-average molecular weight is 159.7kDa, the Tibetan ganoderan G L P-3 does not contain proteins, and the Tibetan ganoderan mainly comprises glucose, arabinose, xylose, mannose and galactose, wherein the molar ratio of the glucose is 92.7%, and the Tibetan ganoderan G L P-3 has characteristic absorption peaks of-OH, C-H, C ═ O and α -isopyranan.)

西藏灵芝多糖GLP-3及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及灵芝类多糖研究领域，具体涉及一种西藏灵芝多糖GLP-3及其制备方法与应用。

背景技术

灵芝(Ganoderma lucidum Karst)又称林中灵、琼珍，是多孔菌科真菌灵芝的子实体，隶属于真菌门(Eumycota)、担子菌亚门(Basi diomycotina)、曾菌纲(Hymenomycetes)、多孔菌目(Aphyllophoral es)、灵芝科(Gamodermataceae)、灵芝属(Ganoderma)类。灵芝药用在中国已有2000多年的历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品。2000年，已知灵芝属(Ganoderma)真菌约100余种，分布最广的为赤芝(G.lucidum)，其次为紫芝(G.japonicum)，还有树舌(G.applanatum)、松杉灵芝(G.tsugae)和簿树芝(G.capense)等均供药用。经过大量临床研究，灵芝对神经衰弱、高脂血症、冠心病、心律失常、克山病、高原不适症、肝炎、出血热、消化不良、气管炎等各有不同程度的疗效。

灵芝分类历史悠久，归类各有不同，《本草纲目》等古籍中以“六色”将灵芝归为：青芝、赤芝、黄芝、白芝、黑芝、紫芝。2015年，广东省微生物研究所李泰辉等人在真菌学杂志《Mycoscience》发表文章宣布他们在西藏林芝地区发现了一个灵芝新种-西藏灵芝Ganoderma leucocontextum。自此之后针对西藏灵芝的食用及药用价值急需进行系统研究。

从20世纪50年代开始，多糖因其独特的生理活性以及安全无毒的特点而受到广泛的关注，到60年代作为光谱免疫促进剂而逐渐成为研究的热点。到如今，已有300多种多糖类化合物被提取以及完成结构鉴定，并作为辅助治疗或直接治疗的药物。研究表明，众多的真菌多糖都具有免疫调节作用。作为一种天然免疫调节剂，真菌多糖不仅可以激活巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞、细胞毒T细胞以及自然杀伤细胞等免疫细胞，还能促进多种细胞因子(如TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-2)的释放和趋化因子的表达，促进抗体的合成，激活补体系统等。此外，真菌多糖还能对红细胞免疫系统、中性粒细胞免疫系统以及神经内分泌免疫功能产生一定程度的影响。

但现有技术中,对西藏灵芝多糖新成分的研究成果甚少,而且还未见通过超滤等方法分离西藏灵芝多糖，以及关于西藏灵芝多糖在免疫调节功效方面的报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种西藏灵芝多糖GLP-3及其制备方法与应用，以西藏灵芝为研究对象，对其分子量>100kDa的多糖进行分离纯化和生物活性研究，发现西藏灵芝多糖(>100kDa)的结构,以及其在免疫调节方面的食用和药用价值。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

西藏灵芝多糖GLP-3，其基本重复单元的结构如下：

优选的，所述西藏灵芝多糖GLP-3的多糖含量为98.8％，重均分子量为159.7kDa。

优选的，所述西藏灵芝多糖GLP-3不含蛋白，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖组成，其中葡萄糖的摩尔占比为92.7％。

优选的，所述西藏灵芝多糖GLP-3具有-OH、C-H、C＝O以及α-异构吡喃糖的特征吸收峰。

本发明还提供如上所述的西藏灵芝多糖GLP-3的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)西藏灵芝粉末经脱脂，得到西藏灵芝脱脂粉末；

(2)往西藏灵芝脱脂粉末中加水，提取多次，得水提液，水提液减压浓缩，得浓缩液；

(3)浓缩液经沉淀，然后除蛋白，并经透析、冷冻干燥后获得粗多糖；

(4)取粗多糖配置成粗多糖溶液，将粗多糖溶液进行超滤，将超滤物冻干后，得到西藏灵芝多糖CGLP-3；

(5)取西藏灵芝多糖CGLP-3配置成西藏灵芝多糖CGLP-3溶液，西藏灵芝多糖CGLP-3溶液经离子交换柱分离洗脱；

(6)将洗脱后的溶液经降压浓缩，再经分子筛分离，再用一级水洗脱，采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，将出现峰的10-17管溶液合并，合并后的溶液经浓缩、透析、冷冻干燥后得到西藏灵芝多糖GLP-3。

优选的，步骤(1)包括：向西藏灵芝粉末中加入95％乙醇，按照料液比1:20，75℃提取2h，重复操作一次，最后将西藏灵芝烘干，得到西藏灵芝脱脂粉末；

步骤(2)包括：西藏灵芝脱脂粉末加水，按照料液比1:20，90℃提取2h，过滤后得水提液，重复操作2次，60℃减压浓缩，得浓缩液；

步骤(3)包括：向浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，4℃下静置16h沉淀多糖，离心收集沉淀，离心转速为6000rpm，离心时间为10min，将沉淀物溶解于一级水中，得多糖溶液；向多糖溶液中加入1/3倍体积的Sevage试剂，所述Sevage试剂为氯仿:正丁醇＝4:1，剧烈震荡30min，4℃下离心，离心转速为6000rpm，离心时间为10min，取上清液，重复操作，直到完全去除蛋白；随后将去除蛋白的多糖溶液采用5000Da透析袋透析72h，之后冷冻干燥得到粗多糖。

优选的，步骤(4)包括：取粗多糖1.5g，配置成浓度为3mg/mL的溶液，使用100kDa超滤膜进行超滤，冻干后，得到分子量>100kDa的西藏灵芝多糖CGLP-3；

步骤(5)包括：取西藏灵芝多糖CGLP-3 60mg，配置成浓度为10mg/mL的溶液，经DEAE纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱流速为2mL/min，洗脱时间为4min/管，之后用全自动部分收集器收集，并采用苯酚-硫酸法检测多糖的含量；

步骤(6)包括：将由0.1mol/L NaCl洗脱下来的溶液，经60℃降压浓缩后，再经Sephacryl S-300分子筛分离，用一级水洗脱，洗脱流速为1mL/min，洗脱时间为8min/管，之后采用全自动部分收集器收集，并采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，最后将出现峰的10-17管合并，经浓缩、透析、冷冻干燥后得到西藏灵芝多糖GLP-3。

上述方法中，步骤(5)是根据多糖所带电荷进行分离，步骤(6)是根据多糖分子量进行分离。目前多糖的分离方法较多，包括使用离子交换柱或使用分子筛分离等，但单一的分离方法得到的多糖往往不够均一。而本发明在离子交换柱和分子筛之前加了超滤的步骤，这样就可以预估多糖的大概分子量，对后续分子筛填料选择具有关键性作用。

本发明还提供如上所述的西藏灵芝多糖GLP-3在制备免疫调节剂药物中的应用。

本发明还提供如上所述的西藏灵芝多糖GLP-3在制备具有促进巨噬细胞吞噬作用和/或增加巨噬细胞NO产生量和/或增加巨噬细胞的细胞因子和趋化因子产生量功效的免疫调节剂药物中的应用。

所述免疫调节剂可被天然免疫受体TLR2识别，通过促进巨噬细胞的NO和/或细胞因子和/或趋化因子的产生量发挥其免疫调节功能。

优选的，细胞因子包括TNF-α、IL-6、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-10；趋化因子包括CXCL5、MIP-2、MCP-1。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明首次从西藏灵芝中分离出西藏灵芝多糖GLP-3，并确定其具体的活性用途；

2、西藏灵芝多糖GLP-3经GPC测定，其重均分子量为159.7kDa；经紫外吸收光谱分析，GLP-3中无蛋白。经GC-MS分析，GLP-3主要由葡萄糖(92.7％)组成，以及少量的阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖。经红外光谱分析，GLP-3具有-OH、C-H、C＝O以及α-异构吡喃糖等多糖特征吸收峰，并结合甲基化和核磁分析，解析了GLP-3的化学结构，确定西藏灵芝多糖GLP-3为新物质；

3、西藏灵芝多糖GLP-3在50-200μg/mL浓度范围内，与对照组相比，可显著促进巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的能力；可显著促进巨噬细胞RAW264.7产生NO；可显著增加巨噬细胞RAW264.7细胞因子(TNF-α、IL-6、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-10)和趋化因子(C XCL5、MIP-2、MCP-1)等的产生量；GLP-3在200μg/mL浓度时，可被天然免疫受体TLR2识别，通过促进巨噬细胞的NO、细胞因子和趋化因子的产生，来发挥其免疫调节功能；

4、与现有制备方法相比，本西藏灵芝多糖GLP-3的提取方法优势在于加入超滤步骤，直接按照多糖的分子量进行分离，降低了后续纯化的难度，且得到的多糖纯度较高，达到98.8％。

附图说明

图1是西藏灵芝多糖GLP-3的DEAE纤维素柱层析洗脱图；

图2是西藏灵芝多糖GLP-3的Sephacryl S-300分子筛洗脱图；

图3是西藏灵芝多糖GLP-3的紫外吸收光谱；

图4是西藏灵芝多糖GLP-3的GPC图；

图5是西藏灵芝多糖GLP-3的单糖组成图；

图6是西藏灵芝多糖GLP-3的红外光谱图；

图7是西藏灵芝多糖GLP-3的¹³C NMR图谱；

图8是西藏灵芝多糖GLP-3的¹H NMR图谱；

图9是西藏灵芝多糖GLP-3的HH-COSY图谱；

图10是西藏灵芝多糖GLP-3的HSQC图谱；

图11是西藏灵芝多糖GLP-3的HMBC图谱；

图12是西藏灵芝多糖GLP-3对巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性影响图；

图13是西藏灵芝多糖GLP-3对巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的影响图；

图14是西藏灵芝多糖GLP-3对巨噬细胞RAW264.7产生NO的影响图；

图15是西藏灵芝多糖GLP-3对巨噬细胞RAW264.7产生细胞因子的影响图；

图16是西藏灵芝多糖GLP-3对巨噬细胞RAW264.7产生趋化因子的影响图；

图17是TLR2和TLR4抗体对经西藏灵芝多糖GLP-3诱导的巨噬细胞RAW264.7产生NO的影响图；

图18是TLR2和TLR4抗体对经西藏灵芝多糖GLP-3诱导的巨噬细胞RAW264.7产生TNF-α的影响图；

图19是TLR2和TLR4抗体对经西藏灵芝多糖GLP-3诱导的巨噬细胞RAW264.7产生IL-6的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在未作特别说明的情况下，本发明所采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1

一)西藏灵芝多糖GLP-3的制备

向西藏灵芝粉末中加入95％乙醇，按照料液比1:20，75℃提取2h，重复操作一次，最后将西藏灵芝烘干，得到西藏灵芝脱脂粉末；往西藏灵芝脱脂粉末中加水(西藏灵芝脱脂粉末与水按照料液比1:20)，90℃提取2h，过滤后得水提液，重复操作2次，60℃减压浓缩，得浓缩液；

向浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，4℃下静置16h沉淀多糖，4℃下离心收集沉淀物，离心转速6000rpm,离心时间10min,将沉淀物溶解于一级水中，得到多糖溶液；

向多糖溶液中加入1/3倍体积的Sevage试剂，所述Sevage试剂为氯仿:正丁醇＝4:1，剧烈震荡30min后,4℃温度下离心，离心转速6000rpm,离心时间10min,取上清液，重复操作，直到完全去除蛋白；随后将去除蛋白的多糖溶液采用5000Da透析袋进行透析72h；之后冷冻干燥得粗多糖；

取粗多糖1.5g，配置成浓度为3mg/mL的溶液，使用100kDa超滤膜进行超滤，冻干后，得到分子量>100kDa的西藏灵芝多糖CGLP-3；

取CGLP-3 60mg，配置成浓度为10mg/mL的溶液，经DEAE纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0mol/L NaCl溶液洗脱，洗脱流速为2mL/min，洗脱时间为4min/管，洗脱曲线如图1所示；洗脱后用全自动部分收集器收集，采用苯酚-硫酸法检测多糖含量；接下来将由0.1mol/L NaCl洗脱下来的溶液在60℃下降压浓缩后，经Sephacryl S-300分子筛分离，用一级水洗脱，洗脱流速为1mL/min，洗脱时间为8min/管，洗脱曲线如图2所示；洗脱后用全自动部分收集器收集，采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，将出现峰的10-17管合并，经浓缩、透析、冷冻干燥得西藏灵芝多糖GLP-3。

二)西藏灵芝多糖GLP-3的紫外光谱分析

取一定量的GLP-3溶于一级水中，制成浓度为1mg/mL的溶液，在U-2910分光光度计上扫描分析，波长范围为200-400nm，结果如图3所示，其在260nm和280nm均无特征吸收峰，表明GLP-3中无蛋白质和核酸。

三)西藏灵芝多糖GLP-3的分子量的测定

GLP-3的平均相对分子量通过Waters ACQUITY APC测得，该系统配备WatersACQUITY APC AQ 900和ACQUITY APC AQ 450柱(2.5μm×4.6mm×150mm,粒径2.5μm，规格4.6mm×150mm)，柱温为35℃，流动相为NaNO₃(100nM)，流速为0.4mL/min，根据从不同分子量(5.2、11.6、23.8、48.6、148、273、410、668kDa)的葡聚糖标准中得到的校准曲线，估算了GLP-3的分子量，结果如图4所示。

四)西藏灵芝多糖GLP-3的单糖组成分析

取2mg多糖，用1mL的2M三氟乙酸水解90min，并用旋转蒸发仪蒸干。残基加入2mL双蒸水，用100mg硼氢化钠还原，加入冰醋酸中和，旋蒸，110℃烘箱烘干，然后加入1mL乙酸酐乙酰化100℃反应1h，冷却，然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复5次。氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10mL，分析采用Shimadzu GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品；

GC-MS条件：RXI-5SIL MS色谱柱30m×0.25mm×0.25μm；程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min。

其中标准品顺序为：鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。结果如图5所示。

由GC-MS结果可知，西藏灵芝多糖GLP-3的单糖组成种类及比例为阿拉伯糖:木糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖＝2.4:3.3:0.8:92.7:0.8。

五)西藏灵芝多糖GLP-3的红外光谱分析

取2mg多糖，加入100mg干燥的溴化钾粉末混匀研磨，倒入压片模具压片30s，置于样品扫描窗口，在4000-400cm^-1的范围内进行红外光谱扫描，结果如图6所示，可以看出：出现了多糖的特征吸收峰。在3394.61cm^-1处有一个强而宽的吸收峰，表明了多糖链-OH的拉伸振动。另一方面，由于游离糖的C-H拉伸振动，弱吸收峰为2930.12cm^-1，1649.58cm^-1处的谱带对应于C＝O的价振动。另外，在1155.46、1080.71、1023.40cm^-1为α-异构吡喃糖的特征峰。

六)西藏灵芝多糖GLP-3的甲基化分析

多糖样品置于反应瓶中，加入DMSO，快速加入NaOH粉末，封闭，在超声作用下溶解，再加入碘甲烷反应。最后加入水到上述混合物中终止甲基化反应。取甲基化后的多糖，用1mL的2M三氟乙酸水解90min，再用旋转蒸发仪蒸干。残基加入2mL双蒸水，60mg硼氢化钠还原8小时，加入冰醋酸中和，旋蒸，101℃烘箱烘干，然后加入1mL乙酸酐乙酰化100℃反应1h,冷却，然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复4次。氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10mL，分析采用Shimadzu GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品；

GC-MS条件：RXI-5SIL MS色谱柱30m×0.25mm×0.25μm；程序升温条件为：起始温度120℃，以4℃/min升温至280℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min。

结果如下表1所示。

表1-西藏灵芝多糖GLP-3的甲基化糖残基GC-MS分析

甲基化产物	糖苷键类型	摩尔比	主要的质谱碎片(m/z)
				2,3,4,6-Me<sub>4</sub>-Gl	Glcp-(1→	0.050	43,71,87,101,117,129,145,161,205
2,3,6-Me<sub>3</sub>-Glcp	→4)-Glcp-(	0.875	43,87,99,101,113,117,129,131,161,173
				2,3-Me<sub>2</sub>-Glcp	→4,6)-Glcp-	0.075	43,71,85,87,99,101,117,127,159,161,2

七)西藏灵芝多糖GLP-3的核磁共振分析

将45mg GLP-3溶于0.5mL D₂O进行检测。西藏灵芝多糖GLP-3核磁共振分析：结果如图7-11所示，根据图7-11的核磁图谱对各残基的各个碳和氢的化学位移值进行归属，归属结果如下表2所示。

表2-西藏灵芝多糖GLP-3中各糖残基的氢、碳信号归属

结合单糖组成、红外光谱、甲基化和核磁共振分析可知GLP-3的基本重复单元的结构如下：

分析结果表明：GLP-3分支结构少，主链连接方式为→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4,6)-β-D-Glcp-(1→的糖苷键，而端基β-D-Glcp-(1→通过O-4键连接在主链上。

实施例2

一)西藏灵芝多糖GLP-3对巨噬细胞RAW264.7的毒性实验

取RAW264.7细胞(1×10⁵个/孔)接种于96孔板，于37℃、5％的CO₂培养箱中培养24h；弃去旧培养液，加入不同浓度的GLP-3(50、100、200、400μg/mL)，培养24h；取出96孔板，弃去旧培养基，加入200μL CCK-8(200μL无血清培养基/3μL CCK-8原液，作为对照组)，于37℃、5％的CO₂培养箱中培养1h，之后用酶标仪测定450nm吸光值，结果如图12所示。从图12中可以看出，GLP-3在50-400μg/mL浓度范围内，对巨噬细胞RAW264.7均无毒性。

二)西藏灵芝多糖GLP-3对巨噬细胞RAW264.7的中性红吞噬实验

取RAW264.7细胞(1×10⁵个/mL)接种于96孔板，于37℃、5％的CO₂培养箱中培养4h；弃去旧培养液，加入不同浓度的GLP-3(50、100、200μg/mL)和LPS(1μg/mL)，培养24h；弃去旧培养基，加入100μL中性红溶液(0.1％)，于37℃、5％的CO₂培养箱中培养1h，弃去中性红溶液，DPBS洗3遍，加入100μL醋酸乙醇溶液(醋酸:乙醇＝1:1，作为对照组)，室温下裂解2h，之后用酶标仪测定540nm吸光值，结果如图13所示。从图13中看出，GLP-3在50-200μg/mL浓度范围内，与对照组相比，可显著促进巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的能力。

三)西藏灵芝多糖GLP-3对巨噬细胞RAW264.7释放NO、细胞因子和趋化因子的影响

取RAW264.7细胞(1×10⁵个/孔)接种于96孔板，于37℃、5％的CO₂培养箱中培养24h；弃去旧培养液，加入不同浓度的GLP-3(50、100、200μg/mL)和LPS(1μg/mL)，对照组只加入培养基，培养24h；收集细胞培养上清液，用于测定NO、细胞因子和趋化因子的产生量。NO使用Griess试剂测定，取100μL上层培养液到新板，向新板加入Griess试剂100μL，用酶标仪测定542nm吸光值，结果如图14所示。细胞因子和趋化因子的产生量采用Luminex MagPix上的MILLIPLEX MAP小鼠高灵敏度T细胞磁珠面板测定，结果如图15、16所示。从图15、16中可以看出，GLP-3在50-200μg/mL浓度范围内，与对照组相比，可显著促进巨噬细胞RAW264.7产生NO；可显著增加巨噬细胞RAW264.7细胞因子(TNF-α、IL-6、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-10)和趋化因子(CXCL5、MIP-2、MCP-1)等的产生量。

四)西藏灵芝多糖GLP-3对巨噬细胞RAW264.7的抗体抑制实验

取RAW264.7细胞(1×10⁵个/孔)接种于96孔板，用5μg/mL TLR2、TLR4、TLR2和TLR4或同型对照抗体预处理1h；之后加入200μg/mL GLP-3，培养24h；收集细胞培养上清液，用于测定NO、TNF-α、IL-6。NO使用Griess试剂测定，取100μL上层培养液到新板，向新板加入Griess试剂100μL，用酶标仪测定542nm吸光值，TNF-α、IL-6使用ELISA试剂盒测定，结果如图17-19所示。从图17-19中看出，GLP-3在200μg/mL浓度时，可被天然免疫受体TLR2识别，通过促进巨噬细胞NO、细胞因子和趋化因子的产生，来发挥其免疫调节功能。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。