阅读说明：本技术 一种用于杨梅的精油防腐驱虫剂 (Essential oil antiseptic insect repellent for waxberries ) 是由 宋达峰 李自成 何帆 于 2020-02-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于杨梅的精油防腐驱虫剂,其特征在于,按重量百分比计,所述精油防腐驱虫剂包括以下成分：1％-30％植物精油、0.1％-10％吐温80、其余为去离子水。所述植物精油优选为为山苍籽精油、桔子精油和龙脑樟精油,其质量配比为3∶2∶1。实验证明,采用这三种植物精油按照适合的比例混合,可产生协同作用,从而更好地实现功能。本发明精油防腐驱虫剂中的精油为植物精油,属于食品添加剂,对杨梅和人体安全,对环境污染小,另外,本发明中植物精油展着力比较好,可以使药液均匀粘附在杨梅表面,使保鲜效果均匀。(The invention discloses an essential oil antiseptic insect repellent for waxberries, which is characterized by comprising the following components in percentage by weight: 1 to 30 percent of vegetable essential oil, 0.1 to 10 percent of Tween 80 and the balance of deionized water. The plant essential oil is preferably litsea cubeba essential oil, orange essential oil and borneol camphor essential oil, and the mass ratio of the plant essential oil to the borneol essential oil is 3:2: 1. Experiments prove that the three plant essential oils are mixed according to a proper proportion to generate a synergistic effect, so that the functions are better realized. The essential oil in the essential oil anti-corrosion insect repellent belongs to food additives, is safe to waxberries and human bodies, and has small environmental pollution.)

一种用于杨梅的精油防腐驱虫剂

技术领域

本发明涉及保鲜技术领域，特别涉及一种用于杨梅的精油防腐驱虫剂。

背景技术

杨梅是我国特产水果之一，素有初疑一颗值千金之美誉。杨梅果实色泽鲜艳，汁液多，甜酸适口，营养价值高，且杨梅成熟时正是水果淡季，为市场提供了可食的时鲜水果，深受消费者欢迎。但杨梅易腐烂，不耐存储，极易招虫(果蝇)，所以杨梅的防腐、驱虫是其生产、加工及销售过程中一个非常重要的环节。现有防腐、驱虫技术主要包括物理方法和化学方法，化学方法包括药剂喷洒、浸泡处理等，物理保鲜成本较高，且会对杨梅的口感产生不利影响，因此在现有的防腐、驱虫技术中经常使用化学试剂对杨梅进行前期处理，但某些化学试剂的成分对身体有害，容易产出耐药性且对环境也造成一定的污染。

复合精油防腐、驱虫剂就是几种精油按不同组分混合，各种原料共同作用，具有较强的抗菌活性和抗氧化活性，抑制微生物对杨梅的腐败作用，从而起到果品防腐保鲜的效果。同时精油具有杀虫和驱虫的作，能较好的减少杨梅中果蝇等昆虫数量。目前已有研究中未见采用复合精油作为杨梅的保鲜驱虫剂。

因此为解决现有技术不足，本发明提供了一种防腐保鲜效果好，驱虫效果强，对杨梅和人体都安全环保的防腐、驱虫剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于杨梅的精油防腐驱虫剂，可以有效降低杨梅的腐败率和出虫率，提高杨梅的品质。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于杨梅的精油防腐驱虫剂，其特征在于，按重量百分比计，所述精油防腐驱虫剂包括以下成分：1％-30％植物精油、0.1％-10％吐温80、其余为去离子水。

进一步地，所述植物精油为山苍籽精油、桔子精油、龙脑樟精油中的一种或者多种的组合。

进一步地，所述植物精油为山苍籽精油、桔子精油和龙脑樟精油，其质量配比为3∶2∶1。实验证明，采用这三种植物精油按照适合的比例混合，可产生协同作用(协同作用是指从资源配置的决策中所能寻求到的各种共同努力的效果，也就是说“1+1>2”的效果)，从而更好地实现功能。山苍籽精油和桔子精油组合使其对抗菌、抗虫性均有提高，而当山苍籽精油:桔子精油：龙脑樟精油＝3:2:1时，协同作用最佳。

本发明还提供了一种杨梅驱虫防腐保鲜方法，采用上述精油防腐驱虫剂对杨梅鲜果进行熏蒸处理，熏蒸处理时间为2-6小时。

另一种杨梅驱虫防腐保鲜方法是，在杨梅采摘前15天、10天和5天，采用上述精油防腐驱虫剂均匀喷洒于杨梅树。

本发明所述植物精油采用本领域常用的萃取法或蒸馏法进行提取。

本发明具有以下优点及有益效果：

1、本发明精油防腐驱虫剂中的精油为植物精油，属于食品添加剂，对杨梅和人体安全，对环境污染小。

2、本发明精油防腐驱虫剂可使杨梅表面快速灭菌，减少活性微生物残留，不易腐败。

3、本发明精油防腐驱虫剂可使杨梅中果蝇幼虫数量大大减少，提高杨梅品质。

4、复方精油的展着力比较好，可以使药液均匀粘附在杨梅表面，使保鲜效果均匀。

5、本发明所选择的植物精油成本低廉，我国生产量大，较易获得。

附图说明

图1是“Y”型嗅觉仪结构示意图。

图2是3#精油对E.coli(A)和Salmonella(B)的存活率(％)影响示意图。

图3是3#精油处理后E.coli(A)和Salmonella(B)的胞外相对电导率(％)示意图。

图4是3#精油处理后E.coli(A)和Salmonella(B)的核酸泄露量(OD260)示意图。

图5是3#精油处理E.coli和Salmonella变化示意图。

图6是不同浓度的3#精油处理E.coli后存活率后细胞壁损伤程度(AKP活性)下降：A:400倍光学显微镜下的对照组；B,C,D分别是400倍荧光显微镜下不同浓度(对照，MIC,MBC)的精油处理后的E.coli。

具体实施方式

本发明公开了一种用于杨梅的精油防腐驱虫剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方案已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明。

为更好地阐述本发明，以下将通过具体的实施例进行说明。

1、抑菌圈试验

采用牛津杯扩散法测定精油抑菌活性。向培养皿中先后倒入固体培养基和半固体菌液(前者凝固后再倒入后者)，添加50μL纯精油于牛津杯中，同时以无菌水作为空白对照。37℃培养24h后测定抑菌圈的大小(减去牛津杯的直径)。

2、测定最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)

用96孔板法测定不同组合精油的MIC和MBC。用乙醇10倍稀释得到浓度范围0.01％-1％的精油，对照组用无水乙醇，37℃培养过夜后用酶标仪测定600nm处光密度值(OD)。与对照组比较，以OD值小于对照孔的最低浓度的为MIC。用接种环蘸取成倍的MIC浓度的精油与菌液混合物，接种于LB固体培养基上，37℃过夜培养后观察，以无菌落的最低浓度为MBC。

3、绘制生长曲线

将MIC、3×MIC精油和过夜培养菌液加入96孔板中，37℃过夜培养，在0h，4h，8h，12h，16h，20h，24h时记录OD₆₀₀，以时间为横坐标，OD₆₀₀为纵坐标绘制生长曲线。

4、测定相对电导率(REC)

过夜培养的菌液在4℃、6000G条件下离心8min后，用5％的葡萄糖溶液洗涤获得等渗菌，后用MIC、MBC浓度的精油处理，在37℃下每2h测定一次电导率，记为L2。取0h的电导率为L1。L0是将葡萄糖溶液中的菌液煮沸5min后测定的电导率。以下列公式计算REC：REC(％)＝(L2-L1)/L0×100。

5、测定核酸泄露

将过夜培养菌液在4℃、6000G条件下离心8min后，用磷酸盐缓冲液清洗3次后重新悬浮，分别加入MIC、MBC浓度的复合精油后37℃培养24h，每隔4h取上清液用酶标仪测定其OD₂₆₀。

6、测定碱性磷酸酶(AKP)泄漏

在96孔板中加入120μL R1液，30μL R2液(R1,R2液为试剂盒：南京建成生物工程研究所)，3μL洗涤过的细菌悬浮液(方法同1.6)，再分别加入MIC,MBC浓度的复合精油，立即用酶标仪测定OD₄₀₅，2min后再次测定吸光度。

7、碘化丙啶(PI)分析

用PI染色试剂盒法(BBI Life Sciences，由组分A和B组成)进行测定。用无菌水将组分B缓冲液进行10倍稀释。将处理后菌液(方法同1.6)染色，静置孵育5-30min。将染色的细菌悬浮液制备成载玻片，用荧光显微镜观察染色情况。

8、对果蝇成虫的产卵实验

用1％吐温80将9种精油组合分别稀释到50倍液(浓度为20mL/L)。收集10天龄的雌果蝇200只，对照组和实验组各100只，每个浓度5管，每管20只雌果蝇。实验所用果蝇玉米培养基，在食物表面添加200μL浓度10％的亮蓝溶液、水100μL作为对照组，100μL精油稀释液作为实验组。将果蝇放在上述处理之后的食物上，并放到培养基中，22h之后，清除雌果蝇，显微镜下计数果蝇卵的个数。每种精油组合为一次实验。

9、对果蝇“Y”型管行为选择测定

采用“Y”型嗅觉仪测试果蝇对精油组合(山苍籽精油:桔子精油:龙脑樟精油＝3:2:1)的行为反应，该仪器由增氧仪，接口，空气加湿器，活性碳空气过滤装置和“Y”型管组成。各部件之间以硅胶管连接。嗅觉仪的2个侧臂长为15cm。直管长10cm，两臂夹角为70°(如图1所示)。测试时，将嗅觉仪的一臂作为处理，受试试剂为3#精油组合。分别用1mL丙酮将5、10、15μL 3#精油组合稀释为不同浓度后用微量进样器吸取等量精油均匀滴加在2cm²的滤纸上，将等量丙酮滴于滤纸上作为对照。将滤纸置于空气中待丙酮挥发后，将处理和对照滤纸分别放入相应的嗅觉测试臂中。测试臂中空气流量为200mL/min。从“Y”型嗅觉仪直管末端引入20头雌成虫。观察并记录成虫的行为反应，每次观察10min。测试过程中,停留在基臂的成虫视为未发生反应.进入处理臂的成虫视为选择性反应。利用上述方法，分别测定雌虫对不同浓度3#精油组合的反应。每个浓度处理10次重复。

每次测试后调换Y型管两臂方向。以消除几何位置对果蝇行为的影响。每作完一个处理，立即用95％乙醇清洗嗅觉仪整个装置，并于100℃烘箱中烘干备用。所有测试均在空气洁净且相对封闭的专用嗅觉测试室测定。

10、对杨梅的防腐实验

(1)挑选无机械伤、无病虫害、大小均匀的杨梅若干份，每份质量1000g，进行如下处理。用10％(体积分数)9种精油组合溶液分别浸没5cm见方的滤纸，并用水做对照。将4张滤纸其按一定间隔贴于熏蒸盒的底部以及四周盒壁上，将杨梅放入多孔放置盒后再放入对应的有支架的熏蒸盒内，避免杨梅表面与液体抑菌剂直接接触。密封处理后做好标记，于4℃恒温气候箱中熏蒸4h后对各组杨梅进行保鲜盒的分装与标记，再置于4℃恒温气候箱。分别于5d和10d测定各处理组杨梅果实的硬度、好果率和果蝇蛆虫数。

(2)挑选生长情况基本相同，处于生长环境适宜且相似的若干颗杨梅树。对照组不做任何处理，使其正常生长；实验组利用稀释成1％的3#精油溶液，分别于采摘前15天、10天和5天，共3次均匀喷洒于杨梅树上。采摘后置于4℃恒温气候箱，每隔5d测量一次腐烂级别和果蝇蛆虫数。

实施例1：

1#山苍籽精油

实施例2

2#桔子精油

实施例3

3#山苍籽精油∶桔子精油∶龙脑樟精油＝3∶2∶1

实施例4

4#山苍籽精油∶桔子精油＝1∶1

实施例5

5#山苍籽精油∶桔子精油＝1∶2

实施例6

6#龙脑樟精油

实施例7

7#桔子精油∶龙脑樟精油＝1∶2

实施例8

8#山苍籽精油∶龙脑樟精油＝1∶1

实施例9

9#山苍籽精油∶龙脑樟精油＝2∶1

结果分析

1、抗菌活性评估

不同组合精油的抗菌活性由精油对供试细菌、真菌的抑菌圈直径(表1)、MIC和MBC(表2)反映。如表1所示，复合精油对细菌的抑菌效果较好。不同精油组合中，3#组合对大肠杆菌、沙门氏菌、曲霉菌和青霉菌抑菌效果较好。MIC、MBC结果(表2)表明9种精油组合对上述菌株均有一定的抗菌活性，不同的精油之间和不同的供试菌之间抑菌效果的差异可能与精油的水溶性的强弱、细菌的细胞被膜结构等因素有关。

表1.不同精油组合对细菌、真菌的抑菌圈直径(mm)

表2.不同精油组合的MIC(％v/v)和MBC(％v/v)

2、精油对细菌、真菌活性的影响

在MIC和MBC测定的实验结果的基础上，测定在不同浓度(control,MIC,MBC)的3#精油作用下24h内大肠杆菌(图2中A)和沙门氏菌.(图2中B)的活菌数变化并绘制生长曲线图。两菌在不同浓度复合精油的作用下，细菌活性变化趋势基本一致，即未经精油处理(Control)的菌液，活菌数随时间逐渐增加；经精油处理(MIC)的菌液，活菌数几乎保持不变；经精油处理(MBC)的菌液，活菌数随时间逐渐减少。菌液培养前16h，精油对活菌数有显著影响，培养至16h后，菌液活菌数基本稳定。可见精油对细菌活性有影响，一定浓度的精油可降低细菌活性，而高浓度的精油可使细菌失活。

3、精油破坏细胞膜通透性

通过测定不同浓度(Control,MIC,MBC)复合精油处理大肠杆菌和沙门氏菌前后菌液相对电导率的变化情况来评价精油对细胞膜通透性的影响。如图3所示，对照组的电导率几乎无变化，而暴露于精油的菌液的电导率皆随着时间的增长而增大，随精油浓度的增大而增大。0-2h，菌液的电导率显著增加，2h后，电导率持续增加但增加速率降低。两种菌的相对电导率变化趋势近似相同，且MBC浓度下的电导率大于MIC浓度下的电导率。可见精油对细菌细胞膜产生了破坏作用，使细胞内的物质大量泄漏，从而导致电导率显著升高。

4、3#精油破坏细胞膜完整性

测定E.coli和Salmonella暴露在不同浓度(control,MIC,MBC)3#精油下24h内OD₂₆₀的变化，由图4，当菌液未暴露精油中(control)时，在培养24h后，其OD₂₆₀值未发生明显变化；当菌液暴露于精油(MIC,MBC)时，0-4h内其OD₂₆₀值迅速上升，4h-24h内OD₂₆₀继续上升，但速度较为缓慢且在MBC作用下OD₂₆₀的变化幅度远大于MIC作用下OD₂₆₀的变化幅度。可见精油对细菌细胞膜有较大破坏作用，导致细胞内核酸等大分子释放出细胞，随着精油用量的增加而增加，随着处理时长的延长而增加。

5、3#精油破坏细胞壁

碱性磷酸酶(AKP)存在于细胞膜和细胞壁之间，当细菌细胞壁受损时，AKP将会从细胞内泄露。因此胞外的AKP活性能表征细菌细胞壁的完整性和通透性。实验测定大肠杆菌和沙门氏菌暴露于不同浓度(control,MIC,MBC)3#精油下24h内AKP的变化量，由图5，对照组的磷酸酶活性很低，这部分活性可能是来源于细胞处于PBS缓冲环境中的正常、少量的细胞死亡；而用3#精油处理的大肠杆菌和沙门氏菌胞外出现大量AKP，且通过比较MIC和MBC处理后的差异，说明3#精油能够迅速引起(2min)细胞壁损伤且在一定范围内高浓度的精油效果更佳。细胞壁具有维持细胞正常形态和控制物质进出的作用，其损伤最终极可能造成细胞死亡。

6、荧光显微镜下的3#精油处理后的细菌死亡情况

PI通常用于确认细胞存活状态。图6为不同浓度(Control,MIC,MBC)3#精油处理后大肠杆菌的显微镜图像(图6中A图)和荧光显微镜(图6中C-D图)，荧光显微镜下，由图6可知，在荧光显微镜下观察，未经精油处理(图6中B图)的菌液细胞未被染成红色，而暴露于精油中(图6中C-D图)的菌液经培养后，细胞在显微镜下呈现红色，且暴露于MBC中的菌液在显微镜下呈现的红色荧光面积明显大于MIC处理后的菌液。结果表明，复合精油可以导致细菌死亡，且精油浓度越高，细菌死亡率越高。

7、产卵对于雌性的寿命影响是存在的，在延长寿命的前提下，探究高浓度复合精油组合能否影响果蝇的产卵。结果表明精油组合对果蝇产卵有影响(表3)。在精油组合处理的环境里的雌性果蝇相比较于对照组的产卵量有显著差异。实验组产卵量显著降低。

表3：精油组合对果蝇产卵的影响

8、“Y’型管嗅觉测定结果表明，不同浓度的3#精油组合对果蝇雌虫的嗅觉反应与对照相比差异均显著.说明不同浓度的3#精油组合对果蝇雌虫均具有显著的趋避活性。且随着3#精油组合浓度的提高，对雌虫的趋避效果提高。

9.(1)对照组杨梅在5d时开始出现腐烂、颜色较暗淡、部分软化、出水、部分开裂、轻微发霉等现象，好果率为75％，果蝇蛆虫约90条/kg杨梅；而复方精油处理组均色泽饱满，无以上现象，其中3#复方精油处理组好果率高达98％，果蝇蛆虫约15条/kg杨梅。10d后对照组出现严重软化、开裂及腐烂现象，好果率仅为20％，果蝇蛆虫约520条/kg杨梅；精油处理组中，1％(体积分数)3#复方精油溶液处理组出现少量轻微发霉，好果率高达90％，果蝇蛆虫约75条/kg杨梅。结果表明，在杨梅保鲜中3#复方精油可有效保持果实品质。

(2)采摘时，对照组和实验组的杨梅均基本处于0级，对照组有少量杨梅处于1级、2级；采摘5天后，对照组腐烂面积在50％以上(3级)的杨梅达到34％，果蝇蛆虫约210条/kg杨梅；3#复方精油溶液处理组仅为3％，果蝇蛆虫约30条/kg杨梅。说明在杨梅生长过程中使用3#复方精油喷洒可以有效降低杨梅的腐败率和出虫率，提高杨梅的品质。

总结：现在越来越趋向使用复方精油，复方精油是指按一定比例混合的精油组合，若精油选择适合且比例正确即能产生协同作用(协同作用是指从资源配置的决策中所能寻求到的各种共同努力的效果，也就是说“1+1>2”的效果)，从而更好地实现功能。山苍籽精油和桔子精油组合使其对抗菌、抗虫性均有提高，而当山苍籽精油:桔子精油：龙脑樟精油＝3:2:1时，协同作用最佳。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。