阅读说明：本技术 桂花花提取物在制备防治口唇疱疹药物中的应用 (Application of osmanthus flower extract in preparation of medicine for preventing and treating herpes labialis ) 是由 黄静 黄慧勤 徐一丹 于 2020-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开桂花(Osmanthus fragrans(Thunb.)Lour.)花提取物在制备防治口唇疱疹药物中的应用,所述药物中的活性成分为桂花花提取物,所述桂花花提取物为申请号为CN201710420375.7的中国发明专利申请中的公开的桂花净油。本发明将桂花花提取物作为活性物质用于防治由1型单纯疱疹病毒(HSV-1)感染,主要在口唇、唇缘及鼻孔附近等皮肤黏膜交界处反复发作的口唇疱疹病症(又称复发性唇疱疹)。桂花花提取物作为活性成分经皮肤吸收,提高了患者的免疫力,可治疗口唇疱疹,尤其是可将口唇疱疹的病程阻断在发生期(水泡没有破裂之前),使病程不再进入发展期。(The invention discloses application of a sweet Osmanthus flower extract (Osmanthus fragrans flower (Thunb.) L our.) in preparing a medicament for preventing and treating herpes labialis, wherein an active ingredient in the medicament is the sweet Osmanthus flower extract which is disclosed in Chinese invention patent application with the application number of CN 201710420375.7.)

桂花花提取物在制备防治口唇疱疹药物中的应用

技术领域

本发明属于药物制备领域，具体涉及桂花(Osmanthus fragrans(Thunb.)Lour.)花提取物在制备防治口唇疱疹药物中的应用。

背景技术

口唇疱疹(orolabial herpes)，也被称为“上火”，是单纯疱疹最常见的一种类型，是主要由1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1，HSV-1)感染引起的一种皮肤和黏膜疾病。人是单纯疱疹病毒惟一的自然宿主。该病毒具有传染性。病毒存在于病人、恢复者或者是健康携带者的水疱疱液、唾液及粪便中，通过直接接触传染或通过被唾液污染的物品间接传染。人体被单纯疱疹病毒感染后，病毒能在人体的正常黏膜、血液、唾液及感觉神经节细胞内长期潜伏，并在如感冒、发热、疲劳、心情抑郁、压力大、紧张焦虑、月经期间等身体免疫力低下时被激活而致病情反复发作，发作部位主要在口唇、唇缘及鼻孔附近等皮肤黏膜交界处，故又称复发性唇疱疹。

口唇疱疹是一种可以自愈的疾病，从发作到痊愈的自然病程约10-15天，自然病程一般可以分为三个阶段：第一阶段是发生期(2-3天)，即在在口唇、唇缘及鼻孔附近等皮肤黏膜交界处，出现刺激痛、灼痛、痒、张力增加等，继而出现密集成群或数群针头大小水疱，周围有轻度的红斑，并伴有难忍的痒痛感；第二阶段是发展期(3-4天)，即水疱破裂，患部出现渗液，形成浅表性糜烂；第三阶段为痊愈期(5-8天)，即患部逐渐干燥结痂、脱落后痊愈。愈后局部可留有暂时性色素沉着。虽然此病预后良好，但病程较长，病灶在口唇部位，痛痒不适，结痂后不敢张口，影响患者进食、言语、美观等。

目前关于口唇疱疹的处理方法是日常护理，即调整精神状态、避免疲劳和充分休息，辅助口服补充维生素C及复合维生素B。必要时外用或口服阿昔洛韦、利巴韦林等抗病毒药物。但抗病毒药物的临床治疗效果不佳，且不能有效缩短病程。

桂花是木樨科(Oleaceae)木犀属木犀(Osmanthus fragrans(Thunb.)Lour.)的习称，又名岩桂、九里香等，常绿乔木或灌木，花冠合瓣四裂，形小。由于桂花显著的甜美芳香的气味和味道，其作为食品加工领域中的添加成分已有广泛的应用和悠久的历史。

桂花(Osmanthus fragrans(Thunb.)Lour.)花中含有一定量的净油成分，是一类非挥发性脂溶性成分为主的油状物质，是一类重要次生代谢产物。净油的化学成分一般较复杂，根据其结构可分为萜类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物、含硫含氮杂环化合物。桂花净油的部分成分也是构成桂花特征性气味的成分。现有研究显示，尽管目前的桂花品种繁多，但至少在构成其特征性成分的组成上实际并无本质差异。

申请号为CN201710420375.7的中国发明专利申请中公开了一种桂花花提取物——桂花净油，而目前桂花花提取物主要作为香料使用或者普通的护肤使用，关于桂花花提取物在制备防治口唇疱疹药物中的应用尚未见报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种桂花花提取物的新用途，即桂花花提取物在制备防治口唇疱疹药物中的应用。基于该应用，可以将桂花花提取物作为活性成分用于口唇疱疹皮肤病的治疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

桂花花提取物在制备防治口唇疱疹药物中的应用，所述药物的活性成分为桂花花提取物，所述桂花花提取物为申请号为CN201710420375.7的中国发明专利申请中的公开的桂花净油。

所述药物为医药品、医疗器械或者化妆品。

所述桂花花提取物质量百分比浓度范围为0.01-2％。

所述药物的给药方式为外用给药。

所述药物的剂型为乳膏、敷剂、霜、凝胶、凝露、乳液、水剂。

所述药物还包括其他辅料，所述辅料为制备药物、医疗器械或者化妆品所允许使用的相应剂型的辅料。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明将桂花花提取物作为活性物质用于防治口唇疱疹皮肤病，桂花花提取物作为活性成分经皮肤吸收后，提高了患者的免疫力，可治疗口唇疱疹，尤其是可将口唇疱疹的病程阻断在发生期(水泡没有破裂之前)，使病程不再进入发展期。桂花花提取物具有较好的免疫调节作用，将桂花花提取物作为治疗口唇疱疹的药物的活性成分，正是利用其免疫调节的功效，通过皮肤吸收后，达到治疗口唇疱疹的目的。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1

一种防治口唇疱疹药物，具体为水剂，该药物的原料为桂花花提取物、角鲨烷、PEG-40氢化蓖麻油、苯氧乙醇和纯水，其中桂花花提取物的质量百分比浓度为0.01％，角鲨烷的质量百分比浓度为1％，PEG-40氢化蓖麻油的质量百分比浓度为0.1％，苯氧乙醇的质量百分比浓度为0.3％，余量为纯水。采用常规方法，先取桂花花提取物、角鲨烷和PEG-40氢化蓖麻油，水浴加热至70-80℃，即得A相；另取苯氧乙醇加入到纯水中，水浴加热至70-80℃，即得B相。在70-80℃保温和搅拌下，缓慢将B相加入到A相中，充分搅拌均匀，放置冷却至室温，即得水剂。使用时，将该水剂涂在患处即可。

实施例2

一种防治口唇疱疹药物，具体为敷剂，该药物的原料为桂花花提取物、PEG-40氢化蓖麻油、透明质酸、苯氧乙醇和纯水，其中桂花花提取物的质量百分比浓度为0.05％，PEG-40氢化蓖麻油的质量百分比浓度为0.05％，透明质酸的质量百分比浓度为0.1％，苯氧乙醇的质量百分比浓度为0.3％，余量为纯水。采用常规方法，先取桂花花提取物和PEG-40氢化蓖麻油，水浴加热至70-80℃，即得A相；另取透明质酸加入到纯水中，充分溶胀均匀后，在加入苯氧乙醇，混匀，水浴加热至70-80℃，即得B相。在70-80℃保温和搅拌下，缓慢将B相加入到A相中，充分搅拌均匀，放置冷却至室温，即得敷料液。将裁减的无纺布片浸入敷料液，待无纺布片充分吸收敷料液后，分片包装，即得敷剂。使用时，将用该敷剂敷于患处即可。

实施例3

一种防治口唇疱疹药物，具体为乳液，其中桂花花提取物的质量百分比浓度为0.1％，二甲基硅氧烷的质量百分比浓度为1％，甘油的质量百分比浓度为5％，鲸蜡硬脂醇的质量百分比浓度为3％，角鲨烷的质量百分比浓度为3％，自乳化单苷酯的质量百分比浓度为2％，苯氧乙醇的质量百分比浓度为0.5％，余量为纯水。采用乳液常规的制备方法，将水、苯氧乙醇和甘油混合溶解，加热至70-80℃，即得A相；将桂花花提取物、二甲基硅氧烷、鲸蜡硬脂醇、角鲨烷和自乳化单苷酯混合，加热至70-80℃融化，得到B相；在保持70-80℃温度并搅拌下，将A相缓慢加入到B相中，充分乳化均质，在搅拌下放冷至室温，即得乳液。使用时，将乳液涂抹在患处即可。

实施例4

一种防治口唇疱疹药物，具体为乳膏，其中桂花花提取物的质量百分比浓度为0.5％，鲸蜡醇的质量百分比浓度为5％，维生素E的质量百分比浓度为2％，甘油的质量百分比浓度为10％，白油的质量百分比浓度为40％，余量为矿酯，采用软膏常规的制备方法，取鲸蜡醇、矿油、维生素E、矿酯混合，加热至70-80℃熔化，即得A相；另取桂花花提取物和甘油，混合均匀后，加热至70-80℃，即得B相。最后将B相在搅拌下缓慢加入A相中，搅拌均匀后，放冷至室温，得到软膏剂。使用时，将软膏制剂涂抹在患处即可。

实施例5

一种防治口唇疱疹药物，具体为凝露，其中桂花花提取物的质量百分比浓度为1％，甘油的质量百分比浓度为5％，1，3-丙二醇的质量百分比浓度为5％，角鲨烷的质量百分比浓度为5％，苯氧乙醇的质量百分比浓度为0.3％，PEG-40氢化蓖麻油的质量百分比浓度为0.6％，卡波姆的质量百分比浓度为0.2％，氢氧化钾的质量百分比浓度为0.05％，余量为纯水。采用凝露的常规制备方法，取桂花花提取物、角鲨烷、PEG-40氢化蓖麻油，加热至70-80℃融化混合均匀，加入24倍量的热水(70-80℃)，充分乳化均质，即得A相；另取卡波姆，加水充分溶胀均匀，即得B相；另取氢氧化钾，加水溶解，并加热至70-80℃，即得C相。在B相中加入甘油、1，3-丙二醇，苯氧乙醇，充分混合均匀，加热至70-80℃，再加入A相，继续混合均匀，即得AB相。在保持70-80℃温度并搅拌下，将C相缓慢加入到AB相中，至凝露形成，并在缓慢搅拌下冷至室温，即得凝露。使用时，将凝露涂抹在患处即可。

实施例6

一种防治口唇疱疹药物，具体为霜剂，其中桂花花提取物的质量百分比浓度为1.5％，苯氧乙醇的质量百分比浓度为0.5％，甘油的质量百分比浓度为6％，鲸蜡硬脂醇的质量百分比浓度为6％，白凡士林的质量百分比浓度为8％，卡波姆的质量百分比浓度为0.2％，羊毛脂的质量百分比浓度为8％，自乳化单苷酯的质量百分比浓度为4％，氢氧化钾的质量百分比浓度为0.04％，余量为纯水。采用霜常规的制备方法，将桂花花提取物、鲸蜡硬脂醇、白凡士林、羊毛脂和自乳化单苷酯混合，加热至70-80℃熔化，即得A相。取卡波姆加入纯水中，充分溶胀后，加入苯氧乙醇和甘油，充分混合均匀，加热至70-80℃，即得B相；取氢氧化钾溶于适量纯水中，加热至70-80℃，即得C相。在保持70-80℃温度并搅拌下，将B相缓慢加入到A相中，充分乳化均质后，再加入C相，搅拌均匀后，在搅拌下冷却至室温，即得霜剂。使用时，将霜剂涂抹在患处即可。

实施例7

一种防治口唇疱疹药物，具体为凝胶，其中桂花花提取物的质量百分比浓度为2％，甘油的质量百分比浓度为10％，卡波姆的质量百分比浓度为8％，氢氧化钠的质量百分比浓度为0.5％，山梨酸钾的质量百分比浓度为3％，余量纯水。采用凝胶常规制备方法，将桂花花提取物溶于甘油和等量的纯水中，超声震荡至均匀，即得甘油相；另将卡波姆撒入纯水中，充分溶胀并搅拌均匀，即得卡波姆溶液。将溶有桂花花提取物的甘油相加入卡波姆溶液中，充分搅拌均匀，得到甘油卡波姆溶液。另将氢氧化钠和山梨酸钾用适量水溶解，得到碱液相。在搅拌下，将碱液相加入至甘油卡波姆溶液中，继续搅拌至凝胶形成即可。使用时，将凝胶制剂涂抹在患处即可。

将桂花花提取物为活性成分制备的药物进行功能实验。

一、桂花花提取物治疗口唇疱疹的案例。

实验对象：口唇疱疹患者30例，年龄18～65岁。

诊断标准：符合《中国临床皮肤科学》单纯疱疹的诊断标准以及全国卫生专业技术资格考试专家委员会《全科医学》的诊断要点。

纳入标准：凡符合口唇疱疹诊断标准，且处于发生期(即水泡没有破裂之前)，未使用任何外用药物，且无其他内外科及皮肤科疾病的患者。

排除标准：水泡已经破裂，有渗出，已形成浅表性溃疡的患者；不能规则用药的患者；已经使用其他内服或外用药物的患者。

将入选患者随机分为桂花花提取物治疗组和阿昔洛韦对照组，每组各15例。各组患者在年龄、性别、病程、病情等方面均具有可比性。

治疗方法。

桂花花提取物治疗组：使用桂花花提取物的质量百分比浓度为0.5％的乳膏。

阿昔洛韦对照组：阿昔洛韦乳膏(国药准字H20063386，江西吉安三力制药有限公司)。

使用方法：各组分别以桂花花提取物乳膏或阿昔洛韦乳膏轻搽患处，每2小时1次，每天6-8次。

其他要求及评价时间节点：各组均要求按日常护理，并于第一次治疗后的第24小时和第48小时进行疗效评价。

疗效判定。

痊愈：小水泡完全消退，痛痒感消失；

显效：小水泡消退≥70％，痛痒感基本消失；

有效：小水泡消退≥40％，有轻度痛痒感；

无效：小水泡消退＜40％，或水泡破裂，痛痒感不减轻。

总显效率(％)＝痊愈率(％)+显效率(％)，同时观察不良反应与耐受性。

统计学处理：数据采用Excel处理，采用F-检验，P＜0.05：有显著性差异；P＜0.01：有极显著性差异。

实验结果。

A.两组治疗显效率比较结果见表1。

表1两组显效率比较结果(使用药物第48小时，例数)

由表1可见，患者经过桂花提取物的治疗3天后，总显效率达80％(痊愈11例，显效1例)。而采用阿昔洛韦乳膏治疗，总显效率仅为33.3％(痊愈3例，显效2例)；可见，采用含有桂花提取物的制剂对口唇疱疹的治疗效果显著高于对照组的治疗效果(p<0.05)。

B.治疗后不同时间节点治疗效果的比较(表2)。

表2.治疗后不同时间节点治疗效果的比较(例)

由表2可见，患者经过桂花提取物的第一次治疗后的第24小时，总显效率达60％(痊愈6例，显效3例)。而仅采用阿昔洛韦乳膏治疗第一次治疗后的第24小时，总显效率仅有26.7％(痊愈1例，显效3例)。可见，采用含有桂花提取物的制剂对口唇疱疹的治疗效果在不同时间点均显著高于对照组的治疗效果(p<0.05)。

C.不良反应

治疗期间均未发现与本发明药物有关和可能有关的严重不良反应。

二、桂花花提取物提高机体免疫力的实验

为了探究桂花花提取物治疗口唇疱疹的原理，本发明还进行了桂花花提取物调节机体免疫力的实验，具体为。

1材料和方法。

1.1样品：桂花(Osmanthus fragrans(Thunb.)Lour.)花提取物，由发明人加工提供，常温下为黄棕色～棕色半固体。

1.2实验试剂与仪器。

1.2.1主要试剂。

本发现所用的主要试剂见表3。

表3.主要试剂

主要试剂	厂家
		刀豆蛋白A(Con A)	SIGMA
RPMI-1640	美国Invitrogen公司
		小牛血清	四川科伦药业股份有限公司
Hank’s液	SIGMA
		SA缓冲液	SIGMA
2-巯基乙醇(2-ME)	SIGMA
		MTT	SIGMA
酸性异丙醇	四川科伦药业股份有限公司
		绵羊红细胞(SRBC)	四川科伦药业股份有限公司
琼脂糖	四川科伦药业股份有限公司
		青霉素	四川科伦药业股份有限公司
链霉素	四川科伦药业股份有限公司
		生理盐水	四川科伦药业股份有限公司
印度墨汁	北京笃信精细制剂厂

1.2.2主要仪器。

本发现所用的主要仪器见表4。

表4.主要仪器

主要仪器	厂家
		电子天平	Sartorius
高速台式离心机	长沙湘仪离心机仪器公司
		低温高速离心机	Thermo Scientific
723分光光度计	Sartorius
		二氧化碳培养箱	美国Thermo Fisher科技有限公司
自动酶标读数仪	美国Thermo Fisher科技有限公司
		游标卡尺(精度为0.02mm)	江西工具厂
BME显微镜	Leica
		立式冷藏柜	中国海尔
流式细胞仪	BIO-RAD
		24孔培养板	Nunc
96孔培养板	Nunc
		微量注射器	Nunc
微孔加样枪(器)	德国Eppendorf公司
		SW-CJ-IF型超净工作台	江苏苏净集团苏州安泰空气技术有限公司

1.3实验动物。

由四川省中医药科学院实验动物中心提供的昆明种小鼠160只，全雌，体重18g-22g，生产许可证号为：SCXK(川)2018-19，SPF级。饲料来源于邳州市小河科技有限公司，生产许可证号为：苏饲证(2014)03058。实验动物房为屏障系统，实验动物使用许可证号为：SYXK(川)2016-043。温度20℃-25℃，相对湿度40％-70％，明暗交替周期为12h。饲养期间，动物的进食行为和饮水行为自由充分、不受干扰，饮水和饲料均为无菌状态。

2实验方法。

2.1剂量设计与分组。

动物适应性喂养3天，随机分为第一、二、三、四组，每组40只(见表5)，其中：第一组用于ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验；第二组用于抗体生成细胞实验、血清溶血素测定和迟发性变态反应实验；第三组用于小鼠碳廓清实验；第四组用于脏器/体重比值和脾细胞的Treg/Th17比值分析。每组小鼠按体重随机分为溶剂对照组(金龙鱼食用调和油)和桂花花提取物低、中、高剂量组(50mg/kg·BW、150mg/kg·BW、450mg/kg·BW)，小鼠按10mL/kg·BW每天一次经口灌胃，连续给予30天，每周称一次体重，根据体重变化调整灌胃体积。

表5.动物实验剂量设计及分组

2.2脏器/体重比值。

末次灌胃后的次日，将第四组小鼠称体重，脱颈椎处死小鼠，无菌条件下迅速取出脾脏、胸腺，用滤纸吸去脏器外部污迹，电子分析天平称重。按下式计算相应的脏器系数。桂花提取物Osthin组的脏器系数高于溶剂对照组的脏器系数，可判定该项实验结果阳性。

脏器系数＝脏器重量(g)/体重(g)。

2.3 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)。

2.3.1试剂配制。

RPMI1640完全培养液：RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10％小牛血清，1％谷氨酰胺(200mmol/L)，青霉素(100U/mL)，链霉素(100μg/L)及5×10-5mol/L的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2，即完全培养液。

ConA液：用双蒸水配制成100μg/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱(-20℃)保存。

无菌Hank's液：用前以3.5％的无菌NaHCO₃调pH7.2-7.4。

MTT液：将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。

酸性异丙醇溶液：96mL异丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl，临用前配制。

2.3.2脾细胞悬液制备。

末次灌胃后的次日，将第一组小鼠无菌取脾，在装有无菌Hank’s液平皿中，用镊子将脾磨碎，制成细胞悬液，200目筛过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)，然后取沉淀悬浮于1mL的完全培养液中，台酚兰染色计数(应在95％以上)。将细胞浓度调整为3×106个/mL。

2.3.3淋巴细胞增殖反应。

将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μLConA液，另一孔作对照，置5％CO₂孵箱37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔继续培养4h，培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，使紫色结晶完全溶解，然后分装到96孔培养板，每孔做3个平行孔，用2010型酶标仪，在570nm波长测定光密度值。

2.3.4结果判定。

用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值的差代表淋巴细胞的增殖能力。桂花花提取物组的光密度差值高于溶剂对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。

2.4迟发型变态反应(DTH，足跖增厚法)。

2.4.1绵羊红细胞(SRBC)细胞悬液制备。

取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液。

2.4.2致敏。

小鼠用2％(v/v)SRBC腹腔免疫，每只鼠注射0.2mL(约1×108个SRBC)。

2.4.2 DTH的产生与测定。

免疫4天后，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20％(v/v)SRBC，每只鼠20μL(约1×108个SRBC)，注射后于24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。

2.4.3结果判定。

以攻击前后足跖厚度差值(足跖肿胀度)来表示DTH的程度。桂花花提取物组的厚度差值高于溶剂对照组的厚度差值，可判定该项实验结果阳性。

2.5抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)。

2.5.1制备补体。

采集豚鼠血，分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清)，将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，4℃冰箱放置30min，经常振荡，离心取上清，分装，-70℃保存；用时以SA缓冲液按1:15稀释。

2.5.2玻片涂膜。

在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖(0.5g琼脂糖加双蒸水至100mL，加热溶解)，干后备用。

2.5.3免疫动物。

每只鼠经腹腔注射0.2mL2％(v/v)的SRBC细胞悬液，约2×108个SRBC。

2.5.4脾细胞悬液制备。

将免疫4～5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hank’s液的平皿内，磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000r/min)10min，用Hank’s液洗2遍，最后将细胞悬浮在5mL RPMI1640培养液中，台酚兰染色计数(应在95％以上)，并将细胞浓度调整为5×106个/mL，制成脾细胞悬液。

2.5.5空斑的测定。

将琼脂糖配制成1％水溶液，水浴，温度45℃，与等量双倍浓度Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加10％(用SA缓冲液配制)压积SRBC 50μL，脾细胞悬液各20μL做两个平行样，迅速混匀后，倾倒于琼脂糖薄层玻片上，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，然后将补体加入到玻片架凹槽内，继续温育

1.5h，计数溶血空斑数。

2.5.6结果判定。

用空斑数/106脾细胞来表示。桂花花提取物组的溶血空斑数高于溶剂对照组的溶血空斑数，可判定该项实验结果阳性。

2.6血清溶血素测定(血凝法)。

2.6.1免疫动物及血清分离。

每只小鼠腹腔注射2％(v/v)SRBC 0.2mL免疫，继续灌胃5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置1h后，2000r/min离心10min，收集血清，用生理盐水将血清作倍比稀释，每份稀释12孔，将不同稀释度的血清置于血凝板中，每孔100μL，再加入0.5％SRBC悬液100μL，混匀，置湿盒37℃3h后观察结果，记录每孔的凝集程度。

2.6.2结果判定。

血清凝集程度一般分为5级(0-IV)记录，按下式计算抗体积数。桂花花提取物组的抗体积数高于溶剂对照组的抗体积数，可判定该项实验结果阳性。

抗体水平＝(S1+2S2+3S3……nSn)

式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。

0级：红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清皙；

I级：红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞；

II级：凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点；

III级：凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点；

IV级：凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。计算抗体积数。

2.7小鼠碳廓清实验。

2.7.1溶液配制。

注射用墨汁：将印度墨汁原液用生理盐水稀释5倍；

Na₂CO₃溶液：取0.1g Na₂CO₃，加蒸馏水至100mL。

2.7.2注射墨汁。

按体重从小鼠尾静脉注射稀释后的印度墨汁(按0.1mL/10g)，墨汁注入后立即计时。

2.7.3测定。

于注入墨汁后第2、10min分别从内眦静脉丛取血20μL，加到2mL Na₂CO₃溶液中，以Na₂CO₃溶液作空白对照，用723分光光度计在600nm处测定光密度值(OD)。

取血后将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。

2.7.4结果判定。

以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a。桂花花提取物组的抗体积数高于溶剂对照组的抗体积数，可判定该项实验结果阳性。

K＝(lgOD1－lgOD2)/(t2－t1)。

吞噬指数a＝体重/(肝重+脾重)×K1/3。

2.8数据处理及结果判定。

实验数据的结果用均数±标准差(x±s)来表示，运用SPSS 25.0软件进行统计分析，多组独立样本均数检验用单因素方差分析(即one-way ANOVA)。分析前先进行方差齐性检验，如果方差齐，则计算F值，当P＞0.05时表示各样本均数差异无统计学意义；当P＜0.05时表示各样本均数差异有统计学意义，并采用Dunnett-t检验进行桂花花提取物各剂量组与溶剂对照组的两两比较。如果方差不齐或数据为呈非正态分布，则用秩和检验进行分析。

细胞免疫和体液免疫功能测定中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定相应免疫功能测定结果阳性；桂花花提取物在细胞免疫功能、体液免疫功能和单核—巨噬细胞系统碳廓清功能三个方面任两个方面结果阳性，可判定桂花花提取物具有增强免疫力的作用。

3实验结果.

3.1桂花花提取物对小鼠体重的影响.

由表6可见，第一、二、三、四组动物的初始体重均衡(P>0.05)；第一、二、三、四组各剂量组动物的初始体重基本一致。饲养期间各组小鼠体重呈增长趋势，但在整个实验期间每组小鼠各剂量组体重的增长无统计学意义(P>0.05)。因此，实验小鼠的体重不受桂花花提取物的影响。

表6.桂花花提取物对小鼠体重的影响(x±s，n＝10)

组别

初期体重

第1周体重

第2周体重

第3周体重

结束时体重

增重

1-A

20.80±1.03

25.40±0.97

29.90±2.69

31.90±2.81

33.90±2.08

13.10±2.38

1-B

20.90±1.29

25.20±1.14

29.30±1.89

30.90±1.79

32.60±1.71

11.70±1.64

1-C

21.10±1.37

26.50±1.72

29.60±2.46

31.50±2.72

33.80±1.87

12.70±1.70

1-D

21.30±0.95

25.70±1.89

28.90±1.85

31.10±2.03

33.40±2.59

12.10±2.89

2-A

20.50±0.85

24.50±1.51

28.30±1.89

29.60±2.37

32.50±1.90

12.00±2.21

2-B

20.70±1.16

25.50±1.27

28.90±1.29

31.40±1.17

33.20±1.23

12.50±1.78

2-C

20.80±1.03

24.20±1.14

29.20±1.32

31.10±1.52

33.40±1.51

12.60±2.22

2-D

20.40±1.17

25.60±1.51

28.90±1.45

31.60±1.08

34.20±1.23

13.80±1.81

3-A

20.60±1.27

24.30±1.16

27.50±1.43

29.50±1.51

32.50±1.65

11.90±1.85

3-B

20.40±0.97

24.90±1.52

28.60±1.71

30.60±1.58

33.30±1.49

12.90±1.45

3-C

20.20±0.79

24.30±0.82

28.90±1.20

31.00±1.05

33.20±1.14

13.00±1.05

3-D

21.10±1.20

26.30±1.49

29.00±1.41

30.70±1.25

32.90±0.88

11.80±1.14

4-A

20.90±0.99

25.10±0.99

28.60±2.41

30.60±2.22

32.40±2.68

11.50±2.88

4-B

21.40±0.97

25.70±1.57

29.70±1.49

32.00±1.41

34.10±2.08

12.70±2.54

4-C

20.60±1.27

26.10±1.66

30.30±2.54

32.20±2.44

34.00±2.31

13.40±2.72

4-D

20.80±0.92

25.60±1.43

28.90±1.52

31.90±1.85

33.50±1.96

12.70±1.64

注：表6中1、2、3、4分别为第一、二、三、四组；A、B、C、D分别代表溶剂对照组、桂花花提取物低剂量组(50mg/kg·BW)、桂花花提取物中剂量组(150mg/kg·BW)、桂花花提取物高剂量组(450mg/kg·BW)。

3.2桂花花提取物对小鼠脏器系数的影响.

与溶剂对照组相比，各剂量组小鼠的胸腺系数增加(F＝8.440，P<0.01)；其中，桂花花提取物低、中、高剂量组的胸腺系数均高于溶剂对照组的胸腺系数(P＜0.05或P＜0.01)，桂花花提取物高剂量组的胸腺系数为0.50±0.08(P<0.01)。与溶剂对照组相比，各剂量组小鼠的脾脏系数增加(F＝4.710，P<0.01)；其中，桂花花提取物高剂量组的脾脏系数高于溶剂对照组的脾脏系数(P＜0.05)，桂花花提取物高剂量组的脾脏系数为0.44±0.08(见表7)。可见小鼠灌胃桂花花提取物后能有效地增加各剂量组小鼠脏器系数，提示桂花花提取物对胸腺和脾脏具有保护作用。

表7.小鼠脏器系数(x±s，n＝10)

组别	胸腺系数(％)	脾脏系数(％)
			溶剂对照组	0.32±0.05	0.28±0.04
桂花花提取物低剂量组	0.43±0.09*	0.31±0.05
			桂花花提取物中剂量组	0.46±0.08**	0.39±0.05
桂花花提取物高剂量组	0.50±0.08**	0.44±0.08*

注：*P<0.05(与溶剂对照组比较)；**P<0.01(与溶剂对照组比较)。

3.3桂花花提取物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响.

根据表8的结果，与溶剂对照组相比，各剂量组小鼠的光密度差值增大(F＝5.991，P<0.01)；其中，桂花花提取物中、高剂量组的光密度差与溶剂对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，并呈现一定的量效关系，桂花花提取物高剂量组的光密度差值为0.30±0.06(P<0.01)。表明桂花花提取物能提高小鼠的淋巴细胞增殖能力。

表8.桂花花提取物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响(x±s，n＝10)

组别	光密度差
		溶剂对照组	0.19±0.03
桂花花提取物低剂量组	0.25±0.05
		桂花花提取物中剂量组	0.27±0.08*
桂花花提取物高剂量组	0.30±0.06**

注：*P<0.05(与溶剂对照组比较)；**P<0.01(与溶剂对照组比较)。

3.4桂花花提取物桂花花提取物对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响。

结果如表9所示，与溶剂对照组相比，各剂量组小鼠的厚度差值(mm)随着剂量的增加而增加(F＝4.213，P<0.05)；其中，桂花花提取物高剂量组的厚度差值与溶剂对照组的厚度差值相比差异具有统计学意义(P＜0.01)桂花花提取物高剂量组的厚度差为1.25±0.16，由此可见，桂花花提取物对小鼠由绵羊红细胞攻击产生的迟发性变态反应在24h内有增强作用。

表9.桂花花提取物对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响(x±s，n＝10)

组别	厚度差(mm)
		溶剂对照组	0.95±0.11
桂花花提取物低剂量组	1.10±0.17
		桂花花提取物中剂量组	1.14±0.19
桂花花提取物高剂量组	1.25±0.16**

注：**P<0.01(与溶剂对照组比较)。

3.5桂花花提取物对抗体生成细胞的影响。

如表10，与溶剂对照组相比，各剂量组小鼠的溶血空斑数呈升高趋势(F＝5.192，P<0.01)；其中，桂花花提取物中、高剂量组的溶血空斑数与溶剂对照组的溶血空斑数比较有差异(P＜0.05或P＜0.01)，桂花花提取物高剂量组的溶血空斑数达到298.75±43.40(P＜0.01)，表明桂花花提取物能使抗体生成细胞数增加。

表10.桂花花提取物对抗体生成细胞的影响(x±s，n＝10)

注：*P<0.05(与溶剂对照组比较)；**P<0.01(与溶剂对照组比较)。

3.6桂花花提取物对小鼠血清溶血素的影响。

如表11所示，与溶剂对照组相比，桂花花提取物各剂量组小鼠的抗体积数虽然有一定的增加，但其差异没有统计学意义((F＝2.204，P>0.05)。

表11.桂花花提取物对小鼠血清溶血素的影响(x±s，n＝10)

组别	抗体积数
		溶剂对照组	134.50±16.70
桂花花提取物低剂量组	137.20±16.04
		桂花花提取物中剂量组	139.90±14.34
桂花花提取物高剂量组	149.90±8.84

3.7桂花花提取物对小鼠单核—巨噬细胞碳廓清功能的影响。

桂花花提取物能增强小鼠单核-巨噬细胞清除体内碳的能力，改善吞噬功能(F＝3.901，P<0.05)。与溶剂对照组相比，桂花花提取物高剂量组的吞噬指数a增大(P＜0.05)，其值为6.80±0.54，提示桂花花提取物对小鼠单核-巨噬细胞系统碳廓清功能有促进作用。结果如表12。

表12.桂花花提取物对小鼠单核—巨噬细胞碳廓清功能的影响(x±s，n＝10)

组别	吞噬指数a
		溶剂对照组	5.86±0.55
桂花花提取物低剂量组	6.01±0.73
		桂花花提取物中剂量组	6.65±0.82
桂花花提取物高剂量组	6.80±0.54*

注：*P<0.05(与溶剂对照组比较)。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作地等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。