阅读说明：本技术 一种具有抗糖基化功效的组合物及其应用 (Composition with anti-glycosylation effect and application thereof ) 是由 汪晓凌 朱华伟 罗珍 唐健 于 2019-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有抗糖基化功效的组合物及其应用。该抗糖基化组合物由如下质量份数的组分组成：桂花提取物0.1～5份、石榴提取物0.1～5份、石榴提取物0.01～0.1份,其中所述桂花提取物中多酚质量含量为≥10％,且毛蕊花糖苷质量含量≥10％；所述石榴提取物中多酚质量含量为≥30％,且安石榴苷质量含量≥8％；所述橄榄果提取物中多酚质量含量为≥10％,且羟基酪醇质量含量≥3％。通过本发明的特定配伍的特定品质的桂花提取物、石榴提取物和橄榄果提取物协同作用,显著降低了成纤维细胞糖基化反应终产物CML的产生、降低了AGEs的产生和增加SOD表达三个维度实现皮肤的抗糖化能力提升。(The invention discloses a composition with an anti-glycosylation effect and application thereof. The anti-glycosylation composition comprises the following components in parts by weight: 0.1-5 parts of osmanthus fragrans extract, 0.1-5 parts of pomegranate extract and 0.01-0.1 part of pomegranate extract, wherein the mass content of polyphenol in the osmanthus fragrans extract is more than or equal to 10%, and the mass content of verbascoside is more than or equal to 10%; the mass content of polyphenol in the pomegranate extract is more than or equal to 30 percent, and the mass content of punicalagin is more than or equal to 8 percent; the olive fruit extract contains more than or equal to 10% of polyphenol by mass and more than or equal to 3% of hydroxytyrosol by mass. By the synergistic effect of the specially-matched osmanthus fragrans extract, the pomegranate extract and the olive fruit extract with specific quality, the generation of a fibroblast glycosylation reaction end product CML is obviously reduced, the generation of AGEs is reduced, and three dimensions of SOD expression are increased, so that the anti-saccharification capacity of the skin is improved.)

一种具有抗糖基化功效的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及抗糖基化技术领域，更具体地，涉及一种具有抗糖基化功效的组合物及其应用。

背景技术

皮肤是由真皮、真皮表皮连接、表皮组成的覆盖器官。如所有其它器官一样，皮肤经受复杂的生理老化过程，逐渐导致真皮和表皮萎缩、干燥、弹性的减少以及细线和皱纹的出现。蛋白质是生命基础，它存在于皮肤、肌肉、血管等全身各个部位，正常成年人身体中有60％是水分，17～18％是由蛋白质构成，而紧致的皮肤则是由真皮层中的胶原蛋白和弹性蛋白构成的，一旦滞留体内的糖分与这些蛋白质结合，就会形成劣质蛋白质，形成晚期糖基化终末产物(AGEs)，即造成皮肤糖化。皮肤糖化主要指的就是肌肤的胶原蛋白纤维断裂，从而造成皮肤的松弛，暗沉，发黄等，而且这种还很容易导致皮肤上出现一些炎症反应，还会让胶原蛋白逐渐的失活，糖化过后的胶原蛋白与弹性蛋白将无法正常发挥作用，进而引发面部的松弛、皱纹。此外，真皮层的糖化会使皮肤逐渐变黄，角质层糖化后，肌肤的保皮肤老化的主要原因之一。

现有研究中公开了一些关于皮肤抗糖化的产品也研究，比如CN107080726A公开了一种皮肤美白方案，其中提到对的美容食品-抗糖化食品，包括橄榄提取物、桂花提取物和黄芪提取物，但其只探究了其对皮肤综合肤质的影响，并未具体研究皮肤糖基化深层机理，无法从糖化深层产物表达等内在影响上很好的解决皮肤糖化问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有皮肤抗糖化产品无法从基因表达层面深层次解决皮肤糖化的缺陷和不足，提供一种具有抗糖基化功效的组合物。

本发明的目的是提供一种所述具有抗糖基化功效的组合物在制备对抗皮肤糖基化制品中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种具有具有抗糖化功效的制剂，所述制剂由所述具有抗糖基化功效的组合物和其他可接受的辅料组成。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种具有抗糖基化功效的组合物，所述组合物由如下质量份数的组分组成：桂花提取物0.1～5份、石榴提取物0.1～2份、橄榄果提取物0.01～0.1份，

其中所述桂花提取物中多酚质量含量为≥10％，且毛蕊花糖苷质量含量≥10％；

所述石榴提取物中多酚质量含量为≥30％，且安石榴苷质量含量≥10％；

所述橄榄果提取物中多酚质量含量为≥10％，且羟基酪醇质量含量≥3％。

在本发明的抗糖基化组合物中，桂花提取物中毛蕊花糖苷可以抑制AGEs(糖基化终产物)的生成，尤其在其含量在10％以上，抑制效果更佳，还能够显著改善皮肤的暗哑、透明感以及提亮皮肤光泽。

本发明的桂花提取物、石榴提取物和橄榄果提取物中均含有多酚，且多酚质量含量均在10％以上，多酚类物质具有抗氧化、清除自由基、抗炎等功效，能有效加快糖分代谢速度，强化并净化肌肤。

石榴提取物中安石榴苷也可以抑制AGEs生成，其还具有防止蛋白结构被糖化破坏、减少糖基化前物MGO对皮肤活性的损害以及氧化的作用，其含量在10％以上可以有效加快糖分代谢，捕捉游离氧自由基，有效对抗各种氧化损伤，排浊祛黄，焕亮鲜活嫩肤。

橄榄果提取物中羟基酪醇可以提升抗氧化能力，其含量在10％以上可以显著增强抗氧化作用，抑制初级糖化产物氧化形成AGEs，改善肤色暗沉、不均，透亮肌肤。

现有技术中已经公开了相应桂花提取物、石榴提取物和橄榄果提取物具有一定的抗糖化作用，但并未明确其抗糖化机理，本发明的发明人无意中发现通过本发明的特定配伍的特定品质的桂花提取物、石榴提取物和橄榄果提取物协同作用，可以很好的从降低成纤维细胞糖基化反应、降低AGEs的产生和增加SOD表达三个维度实现皮肤的抗糖化能力提升。

其中，本发明的桂花提取物、石榴提取物和橄榄果提取物可以来源于市购，也可以通过提取得到：

桂花提取物的提取方法如下：

干燥粉碎的桂花粉末使用水、醇或其他食品可用加工助剂中一种或几种混合提取、浓缩、干燥得到桂花提取物。本发明的桂花可以选择四季桂、丹桂、金桂或银桂。

石榴提取物的提取方法如下：

石榴果粉碎或石榴果汁干燥而成的粉末使用水、醇、或其他食品可用加工助剂中一种或几种混合提取、浓缩、干燥得到石榴提取物。

橄榄果提取物的提取方法如下：

橄榄果粉碎或橄榄果汁干燥而成的粉末使用水、醇、或其他食品可用加工助剂中一种或几种混合提取、浓缩、干燥得到橄榄果提取物。

其中，本发明中所涉及的多酚质量含量、桂花提取物中毛蕊花糖苷的质量含量、石榴提取物中安石榴苷的质量含量和橄榄果提取物中羟基酪醇的是通过如下方法检测得到，具体为：

桂花提取物中多酚和毛蕊花糖苷的测定参考Q/HSHLY0001S-2018的测定方法；

橄榄果提取物中羟基酪醇通过HPLC发测定，测定方法如下：

1、试剂：甲醇(AR)、乙腈(色谱纯)、超纯水、标准品；

2、标准品：羟基酪醇(购自Tokyo Chemical Industry CO.LTD,98％)；

3、仪器和用具：电子天平(1/100000)、玻璃仪器:容量瓶、0.45μm微孔滤膜及针筒式过滤器、超声波清洗器、高效液相色谱仪、Agilent 1100输液泵、Agilent 1100可变波长紫外检测器、Agilent 1100化学工作站；

4、色谱条件

色谱柱：Lnua C_ns.250mX 4.6mm，5μm

流动相：乙腈(B):水(D)＝5:95(V/V)

Time(min)	B％	D％
			0.00	5	95
10.00	8	92
			25.00	15	85
26.00	5	95

流速:1.0mL/min

检测波长:276nm

进样量:5μ

柱温:25℃

5、操作步骤

供试品溶液的制备：精密称取本品约60mg(20％)，置25ml容量瓶中，加30％甲醇，超声提取15min,冷却至室温，用30％甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，待测。

标准品溶液的制备：精密称取羟基酪醇适量，加30％甲醇配成浓度约为0.5mg/ml溶液。

将标准品溶液、供试品溶液各5μL分别注入HPLC仪。

5、结果计算：

其中，

A_样:样品峰面积；

A_标:标准品峰面积；

C_标:标准品浓度(mg/mL)Mn:样品称样量(mg)；

V_样:样品的定容体积(mL)P:标准品纯度(％)。

石榴提取物中多酚和橄榄果提取物中多酚含量根据Q/WXJ0031 S-2015测定。

石榴提取物中安石榴苷采用HPLC进行检测，具体方法如下：

1、化学试剂：甲醇(色谱纯)；冰醋酸(优级纯)；蒸馏水；标准品：安石榴甙(98.00％，Sigma-Aldrich)

2、色谱条件

3、标准溶液的制备

安石榴甙标准溶液的制备：准确称取约5mg纯安石榴甙于10ml容量瓶中，加入5毫升2％冰醋酸，超声波溶解标准品，并用2％冰醋酸稀释至刻度，将溶液充分混合，用0.2um膜滤器过滤后装于干净的高效液相色谱瓶，进样20μL溶液并记录色谱图。

样品溶液的制备：确称取150mg样品于50mL容量瓶中，添加2％的冰醋酸至约一半的体积和超声20min，冷却后，并用2％冰醋酸稀释至刻度，将溶液充分混合，用0.2um膜滤器过滤后装于干净的高效液相色谱瓶，进样20μL溶液并记录色谱图。

流动相制备：流动相A(2％V/V冰醋酸水溶液)：取100mL容量瓶，加水50mL，加入2mL冰醋酸，定容混合均匀，用0.45um薄膜过滤器过滤。

流动相B(2％V/V冰醋酸甲醇溶液)：取100mL容量瓶，加甲醇水50mL，加入2mL冰醋酸，甲醇定容混合均匀，用0.45um薄膜过滤器过滤，超声除气。

4、分析

使用设定的色谱条件，记录上述制备的标准溶液和样品溶液的高效液相色谱图；

分析运行时间为32分钟，安石榴甙-1的保留时间(RT)为10.9分钟，安石榴甙-2为13.8分钟。由于流动相组成和色谱柱的变化，分析物的保留时间可能会改变。

5、安石榴甙含量计算

安石榴甙含量(％)＝样品面积*标准片浓度*标准片纯度/标准品面积*标准品浓度

优选地，所述组合物由如下质量份数的组分组成：桂花提取物0.5～3份、石榴提取物物0.5～5份、橄榄果提取物0.1～2份。

优选地，所述组合物由如下质量份数的组分组成：桂花提取物1～3份、石榴提取物物1～2份、橄榄果提取物0.1～2份。

例如可以为桂花提取物3份、石榴提取物物1份、橄榄果提取物0.1份；

桂花提取物2份、石榴提取物5份、橄榄果提取物1份；

桂花提取物0.5份、石榴提取物0.5份、橄榄果提取物1份；

或桂花提取物2份、石榴提取物2份、橄榄果提取物0.1份。

进一步优选地，所述组合物由如下质量份数的组分组成：桂花提取物3份、石榴提取物1份、橄榄果提取物0.1份。

优选地，所述组合物中：

桂花提取物中多酚质量含量为10％，且毛蕊花糖苷质量含量10％；

石榴提取物中多酚质量含量为30％，且安石榴苷质量含量10％；

橄榄果提取物中多酚质量含量为10％，且羟基酪醇质量含量3％。

上述具有抗糖基化功效的组合物在制备对抗皮肤糖基化制品中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明还保护一种具有抗糖化功效的制剂，所述制剂由所述具有抗糖基化功效的组合物和其他可接受的辅料组成。

其中需要说明的是，本发明的其他可接受的辅料是制备具体的制剂是目前市售产品常用添加辅料。

其中本发明的具有抗糖化功效的制剂可以为饮品制剂、护肤品、

所述食品或保健品包括：液体状的食品或保健品，或者固体、半固体状的食品或保健品；

其中，液体状的食品或保健品包括：饮料、口服液或牛奶；

固体或半固体状的食品或保健品包括：饼干、糕点、冲剂、糖果、巧克力、果冻、果酱、罐头、凝胶。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种具有抗糖基化功效的组合物，包括其中桂花提取物、石榴提取物和橄榄果提取物，组合物中的多酚类物质具有抗氧化、清除自由基、抗炎等功效。毛蕊花糖苷和安石榴苷可以抑制AGEs的生成，防止蛋白结构被糖化破坏、减少糖基化前物MGO对皮肤活性的损害以及氧化作用，橄榄果提取物的羟基酪醇可以提升抗氧化能力，显著增强抗氧化作用。

通过本发明的特定配伍的特定品质的桂花提取物、石榴提取物和橄榄果提取物协同作用，显著降低了成纤维细胞糖基化反应终产物CML的产生、降低了AGEs的产生和增加SOD表达三个维度实现皮肤的抗糖化能力提升。

附图说明

图1为糖化诱导成纤维细胞的CML表达情况。

图2为衰老小鼠模型AGEs表达情况。

图3为衰老小鼠模型SOD表达情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。

实施例1

一种具有抗糖基化功效的组合物，由如下质量份数的组分组成：桂花提取物3份、石榴提取物1份、橄榄果提取物0.1份，

其中桂花提取物中多酚质量含量为10％，且毛蕊花糖苷质量含量10％；

石榴提取物中多酚质量含量为30％，且安石榴苷质量含量10％；

橄榄果提取物中多酚质量含量为10％，且羟基酪醇质量含量3％。

桂花提取物的提取方法如下：

干燥粉碎的桂花粉末使用水、醇或其他食品可用加工助剂中一种或几种混合提取、浓缩、干燥得到桂花提取物。本发明的桂花可以选择四季桂、丹桂、金桂或银桂。

石榴提取物的提取方法如下：

石榴果粉碎或石榴果汁干燥而成的粉末使用水、醇、或其他食品可用加工助剂中一种或几种混合提取、浓缩、干燥得到石榴提取物。

橄榄果提取物的提取方法如下：

橄榄果粉碎或橄榄果汁干燥而成的粉末使用水、醇、或其他食品可用加工助剂中一种或几种混合提取、浓缩、干燥得到橄榄果提取物。

桂花提取物中多酚和毛蕊花糖苷的测定参考Q/HSHLY0001S-2018的测定方法；

橄榄果提取物中羟基酪醇通过HPLC发测定，测定方法如下：

6、试剂：甲醇(AR)、乙腈(色谱纯)、超纯水、标准品；

7、标准品：羟基酪醇(购自Tokyo Chemical Industry CO.LTD,98％)；

8、仪器和用具：电子天平(1/100000)、玻璃仪器:容量瓶、0.45μm微孔滤膜及针筒式过滤器、超声波清洗器、高效液相色谱仪、Agilent 1100输液泵、Agilent 1100可变波长紫外检测器、Agilent 1100化学工作站；

9、色谱条件

色谱柱：Lnua C_ns.250mX 4.6mm，5μm

流动相：乙腈(B):水(D)＝5:95(V/V)

Time(min)	B％	D％
			0.00	5	95
10.00	8	92
			25.00	15	85
26.00	5	95

流速:1.0mL/min

检测波长:276nm

进样量:5μ

柱温:25℃

5、操作步骤

供试品溶液的制备：精密称取本品约60mg(20％)，置25ml容量瓶中，加30％甲醇，超声提取15min,冷却至室温，用30％甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，待测。

标准品溶液的制备：精密称取羟基酪醇适量，加30％甲醇配成浓度约为0.5mg/ml溶液。

将标准品溶液、供试品溶液各5μL分别注入HPLC仪。

10、结果计算：

其中，

A_样:样品峰面积；

A_标:标准品峰面积；

C_标:标准品浓度(mg/mL)Mn:样品称样量(mg)；

V_样:样品的定容体积(mL)P:标准品纯度(％)。

石榴提取物中多酚和橄榄果提取物中多酚含量根据Q/WXJ0031 S-2015测定。

石榴提取物中安石榴苷采用HPLC进行检测，具体方法如下：

5、化学试剂：甲醇(色谱纯)；冰醋酸(优级纯)；蒸馏水；标准品：安石榴甙(98.00％，Sigma-Aldrich)

6、色谱条件

7、标准溶液的制备

安石榴甙标准溶液的制备：准确称取约5mg纯安石榴甙于10ml容量瓶中，加入5毫升2％冰醋酸，超声波溶解标准品，并用2％冰醋酸稀释至刻度，将溶液充分混合，用0.2um膜滤器过滤后装于干净的高效液相色谱瓶，进样20μL溶液并记录色谱图。

样品溶液的制备：确称取150mg样品于50mL容量瓶中，添加2％的冰醋酸至约一半的体积和超声20min，冷却后，并用2％冰醋酸稀释至刻度，将溶液充分混合，用0.2um膜滤器过滤后装于干净的高效液相色谱瓶，进样20μL溶液并记录色谱图。

流动相制备：流动相A(2％V/V冰醋酸水溶液)：取100mL容量瓶，加水50mL，加入2mL冰醋酸，定容混合均匀，用0.45um薄膜过滤器过滤。

流动相B(2％V/V冰醋酸甲醇溶液)：取100mL容量瓶，加甲醇水50mL，加入2mL冰醋酸，甲醇定容混合均匀，用0.45um薄膜过滤器过滤，超声除气。

8、分析

使用设定的色谱条件，记录上述制备的标准溶液和样品溶液的高效液相色谱图；

分析运行时间为32分钟，安石榴甙-1的保留时间(RT)为10.9分钟，安石榴甙-2为13.8分钟。由于流动相组成和色谱柱的变化，分析物的保留时间可能会改变。

5、安石榴甙含量计算

安石榴甙含量(％)＝样品面积*标准片浓度*标准片纯度/标准品面积*标准品浓度

实施例2

一种具有抗糖基化功效的组合物，由如下质量份数的组分组成：桂花提取物2份、石榴提取物5份、橄榄果提取物1份，

其中桂花提取物、石榴提取物和橄榄果提取物与实施例1相同。

实施例3

一种具有抗糖基化功效的组合物，由如下质量份数的组分组成：桂花提取物1份、石榴提取物2份、橄榄果提取物2份，

其中桂花提取物、石榴提取物和橄榄果提取物与实施例1相同。

实施例4

一种具有抗糖基化功效的组合物，由如下质量份数的组分组成：桂花提取物0.5份、石榴提取物0.5份、橄榄果提取物1份，

其中桂花提取物、石榴提取物和橄榄果提取物与实施例1相同。

实施例5

一种具有抗糖基化功效的组合物，由如下质量份数的组分组成：桂花提取物2份、石榴提取物2份、橄榄果提取物0.1份，

其中桂花提取物、石榴提取物和橄榄果提取物与实施例1相同。

实施例6

一种具有抗糖基化功效的组合物，由如下质量份数的组分组成：桂花提取物3份、石榴提取物1份、橄榄果提取物0.1份，

其中桂花提取物中多酚质量含量为10％，且毛蕊花糖苷质量含量10％；

石榴提取物中多酚质量含量为40％，且安石榴苷质量含量8％；

橄榄果提取物中多酚质量含量为10％，且羟基酪醇质量含量3％。

对比例1

一种具有抗糖基化功效的提取物，所述提取物为桂花提取物。

对比例2

一种具有抗糖基化功效的提取物，所述提取物为石榴提取物。

对比例3

一种具有抗糖基化功效的提取物，所述提取物为橄榄提取物。

对比例4

一种具有抗糖基化功效的组合物，由如下质量份数的组分组成：桂花提取物3份、石榴提取物1份、橄榄果提取物0.1份，

其中桂花提取物中多酚质量含量为8％，且毛蕊花糖苷质量含量8％；

石榴提取物中多酚质量含量为40％，且安石榴苷质量含量10％；

橄榄果提取物中多酚质量含量为10％，且羟基酪醇质量含量3％。

对比例5

一种具有抗糖基化功效的组合物，由如下质量份数的组分组成：桂花提取物3份、石榴提取物1份、石榴提取物0.1份，

其中桂花提取物中多酚质量含量为8％，且毛蕊花糖苷质量含量8％；

石榴提取物中多酚质量含量为20％，且安石榴苷质量含量8％；

橄榄果提取物中多酚质量含量为8％，且羟基酪醇质量含量2％。

结果检测

(1)利用皮肤细胞验证测试样品抗糖化能力

皮肤成纤维细胞糖化标志基因表达分析：

N～ε-羧甲基赖氨酸(CML)为晚期糖基化终产物，通过检测CML水平反应皮肤细胞糖化程度。

检测方法：

将成纤维细胞种于24孔板中，使用400μM甲基乙二醛和乙二醛处理细胞，以诱导糖基化。样品组处理细胞7天后进行免疫荧光实验，800μM氨基胍为阳性对照，实验组为实施例和对比例的组合物，质量浓度为0.01％。

观察活性成分处理后CML的表达情况。

结果如图1，柱状图为荧光显微镜拍摄后对红色像素的分析后结果。实施例1于降低成纤维细胞糖基化反应的效果最为显著。

(2)利用小鼠衰老模型验证测试样品抗糖化能力

采用D-半乳糖(1g/kg)造模，D-半乳糖每天现配现用。正常组皮下注射同等给药体积的生理盐水，给药体积为0.1ml/10g，连续每日背部皮下注射42天。受试物每日灌胃给药(实施例和对比例的组合物)；诱导组每日给予生理盐水。42天后，处死动物，取血进行生化指标和病理检测(SOD活力、AGEs)。

结果如图2，3，实施例1降低衰老小鼠AGEs的产生及增加SOD表达的效果最为显著。

(3)数据处理

所有组别与诱导糖化对照组对比进行显著性差异分析，使用t检验进行统计学差异分析，结果如表1和表2所示。结果用星号表示*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

表1

从上述表1的数据可以看出，本发明提供的抗糖基化组合物通过桂花提取物、石榴提取物和橄榄果提取物的协同作用，可以很好的抑制糖基化终产物AGEs的产生，AGEs含量接近空白组的27.83±7.76，显著低于诱导糖化对照组的42.42±9.53，相应的成纤维细胞糖基化反应终产物CML也有明显的降低，且显著增加了SOD表达的效果，从CML、AGEs和SOD三个维度实现皮肤的抗糖化能力提升。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。