阅读说明：本技术 一种山莴苣素的制备方法 (Preparation method of lactucin ) 是由 阿吉艾克拜尔·艾萨 魏哲洋 孙光映 罗玉琴 于 2020-05-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种山莴苣素的制备方法,该制备方法分别采用反相C18制备色谱和葡聚糖LH-20型凝胶色谱,从毛菊苣根提取物中分离得到富含山莴苣素的组分溶液,再通过减压浓缩结晶法得到高纯度的山莴苣素。该方法简单易行制备效率高,可获得纯度高于99%的山莴苣素对照品。所得山莴素对照品可用于药材标准化过程中的定量定性学研究。方法简单易行,纯化效率高,具有一定的应用价值。(The invention relates to a preparation method of lactucin, which adopts reversed phase C18 preparative chromatography and dextran L H-20 type gel chromatography respectively, separates component solution rich in lactucin from extract of hairy chicory root, and obtains high-purity lactucin by reduced pressure concentration crystallization.)

一种山莴苣素的制备方法

技术领域

本发明涉及一种山莴苣素的制备方法。该方法以毛菊苣根提取物为原料，通过反相C18制备色谱、葡聚糖LH-20柱层析色谱、浓缩结晶法的结合，获得纯度高于99％的山莴苣素对照品。

背景技术

毛菊苣为菊科菊苣属一年生草本植物，是新疆地区常用药材，主要以其地上部分入药，味微苦、咸，性凉，具有清肝利胆、健胃消食、利尿消肿之功效。主要应用于肝炎、肾炎、胃脘疼痛的治疗。近来研究表明，毛菊苣具备保肝降脂，降血糖和改善心脏功能的功效。随着国内外的学者对于菊苣属植物化学成分研究的不断深入，发现毛菊苣含有的主要化合物种类为黄酮类、倍半萜类、三萜类、香豆素类、甾醇类和生物碱类等。毛菊苣中含有的倍半萜类化合物十分丰富，这些种类的倍半萜味苦，是该植物苦味的主要来源。毛菊苣中含有的山莴苣素、山莴苣苦素等为该植物代表性成分，也是该植物保肝降糖的主要活性成分之一。目前，获得山莴苣素的主要通过高速逆流色谱法来制备得到，其纯度可达97％以上。其所得化合物的纯度和制备效率有进一步提高的空间。在现代分离纯化技术中，反相C18制备色谱、葡聚糖凝胶LH-20柱色谱及结晶法由于操作简便，制备效率高，在化合物分离纯化过程中发挥着重要的作用。本发明基于山莴苣素的物理化学性质，设计了三种纯化方法的组合技术，可从毛菊苣根提取物中制备得到纯度高于99％的山莴苣素对照品。方法简单易行，纯化效率高，具有一定的应用价值。所得山莴苣素对照品可以用于富含山莴苣素的药材如毛菊苣根中山莴苣素的定性分析和定量分析，进而为药材的质量控制做出贡献。高纯度的山莴苣素对照品通过国家指定的定值单位定值合格后，又可以申请形成国家标准样品，从而产生一定的经济效益。

发明内容

本发明目的在于，提供一种山莴苣素的制备方法，该方法以毛菊苣根提取物为原料，分别采用反相C18制备色谱和葡聚糖LH-20型凝胶色谱，从毛菊苣根提取物中分离得到富含山莴苣素的组分溶液，再通过减压浓缩结晶法得到高纯度的山莴苣素。该方法简单易行制备效率高，可获得纯度高于99％的山莴苣素对照品。所得山莴素对照品可用于药材标准化过程中的定量定性学研究。方法简单易行，纯化效率高，具有一定的应用价值。

本发明所述的一种山莴苣素的制备方法，按下列步骤进行：

a、将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏；取所得浸膏，加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，再加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，将所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；

b、将步骤a得到的毛菊苣根提取物50-2000mg，超声溶解在50mL体积比20-100％的甲醇-水溶液中，离心除去沉淀，取上清液备用；

c、取一根反相C18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试C18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为20％-65％，柱温控制在-10℃-50℃，平衡色谱柱10-30min，待用；流速控制在100-180mL/min之间，将步骤b中所得萃取物溶液，收集山莴苣素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度85％的山莴苣素5-170mg；

d、以甲醇为装柱试剂，湿法填装一根长度为1.5m，内径为7cm的葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，取步骤c中所得纯度85％的山莴苣素5-170mg，加2-3mL甲醇溶解，上样至该葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，以纯甲醇为流动相冲洗葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，收集流出组分，得到每瓶溶液体积为5mL的组分，收集20瓶，使用高效液相色谱仪分别测定所得20瓶组分中山莴苣素的纯度，将纯度高于95％的组分溶液合并，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥；

e、将步骤c中浓缩干燥所得固体，在温度40-70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，得到纯度99％的山莴苣素对照品，过滤后所得结晶母液，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，再在40-70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，合并所得两批晶体，共得纯度99％的山莴苣素对照品3-105mg。

步骤b中毛菊苣根提取物为300-1000mg，溶解毛菊苣提取物样品的甲醇-水中甲醇含量为50-90％。

步骤c中使用填充填料质量为800g的反相C18制备色谱的纯化过程中，流动相中甲醇体积比为30-50％，柱温为-10-30℃。

步骤e中结晶温度为60-70℃。

本发明所述的一种山莴苣素的制备方法，该方法是在发明专利201110213474.0《一种山莴苣素和山莴苣苦素的制备方法》的基础上进一步的研究，将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏，取所得浸膏加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到后获得毛菊苣根提取物；再将提取物分别采用反相C18制备色谱和葡聚糖LH-20型凝胶色谱，从毛菊苣根提取物中分离得到富含山莴苣素的组分溶液，再通过减压浓缩结晶法得到高纯度的山莴苣素。该方法简单易行制备效率高，可获得纯度高于99％的山莴苣素对照品。所得山莴素对照品可用于药材标准化过程中的定量定性学研究。方法简单易行，纯化效率高，具有一定的应用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。

实施例1

a、将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏，取所得浸膏，加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到后获得毛菊苣根提取物；

b、将步骤a得到的毛菊苣根提取物50mg，超声溶解在50mL体积比35％的甲醇-水溶液中，离心除去沉淀，取上清液备用；

c、取一根反相C18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试C18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为35％，柱温控制在30℃，平衡色谱柱15min，待用；流速控制在180mL/min，将步骤b中所得萃取物溶液，收集山莴苣素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度85％的山莴苣素5mg；

d、以甲醇为装柱试剂，湿法填装一根长度为1.5m，内径为7cm的葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，取步骤c中所得纯度85％的山莴苣素5mg，加2mL甲醇溶解，上样至该葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，以纯甲醇为流动相冲洗葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，收集流出组分，得到每瓶溶液体积为5mL的组分，收集20瓶，使用高效液相色谱仪分别测定所得20瓶组分中山莴苣素的纯度，将纯度高于95％的组分溶液合并，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥；

e、将步骤c中浓缩干燥所得固体，在温度70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，得到纯度99％的山莴苣素对照品，过滤后所得结晶母液，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，再在70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，合并所得两批晶体，共得纯度99％的山莴苣素对照品3mg，回收率60％。

实施例2

a、将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏；取所得浸膏，加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，再加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，将所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；

b、将步骤a得到的毛菊苣根提取物300mg，超声溶解在50mL体积比35％的甲醇-水溶液中，离心除去沉淀，取上清液备用；

c、取一根反相C18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试C18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为20％-65％，柱温控制在30℃，平衡色谱柱10-30min，待用；流速控制在100-180mL/min之间，将步骤b中所得萃取物溶液，收集山莴苣素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度85％的山莴苣素27mg；

d、以甲醇为装柱试剂，湿法填装一根长度为1.5m，内径为7cm的葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，取步骤c中所得纯度85％的山莴苣素27mg，加2mL甲醇溶解，上样至该葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，以纯甲醇为流动相冲洗葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，收集流出组分，得到每瓶溶液体积为5mL的组分，收集20瓶，使用高效液相色谱仪分别测定所得20瓶组分中山莴苣素的纯度，将纯度高于95％的组分溶液合并，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥；

e、将步骤c中浓缩干燥所得固体，在温度65℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，得到纯度99％的山莴苣素对照品，过滤后所得结晶母液，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，再在70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，合并所得两批晶体，共得纯度99％的山莴苣素对照品20mg，回收率66.7％。

实施例3

a、将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏；取所得浸膏，加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，再加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，将所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；

b、将步骤a得到的毛菊苣根提取物1000mg，超声溶解在50mL体积比35％的甲醇-水溶液中，离心除去沉淀，取上清液备用；

c、取一根反相C18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试C18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为35％，柱温控制在30℃，平衡色谱柱15min，待用；流速控制在180mL/min，将步骤b中所得萃取物溶液，收集山莴苣素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度85％的山莴苣素90mg；

d、以甲醇为装柱试剂，湿法填装一根长度为1.5m，内径为7cm的葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，取步骤c中所得纯度85％的山莴苣素90mg，加3mL甲醇溶解，上样至该葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，以纯甲醇为流动相冲洗葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，收集流出组分，得到每瓶溶液体积为5mL的组分，收集20瓶，使用高效液相色谱仪分别测定所得20瓶组分中山莴苣素的纯度，将纯度高于95％的组分溶液合并，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥；

e、将步骤c中浓缩干燥所得固体，在温度70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，得到纯度99％的山莴苣素对照品，过滤后所得结晶母液，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，再在70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，合并所得两批晶体，共得纯度99％的山莴苣素对照品65mg，回收率65％。

实施例4

a、将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏；取所得浸膏，加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，再加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，将所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；

b、将步骤a得到的毛菊苣根提取物2000mg，超声溶解在50mL体积比35％的甲醇-水溶液中，离心除去沉淀，取上清液备用；

c、取一根反相C18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试C18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为35％，柱温控制在30℃，平衡色谱柱15min，待用；流速控制在180mL/min之间，将步骤b中所得萃取物溶液，收集山莴苣素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度85％的山莴苣素170mg；

d、以甲醇为装柱试剂，湿法填装一根长度为1.5m，内径为7cm的葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，取步骤c中所得纯度85％的山莴苣素170mg，加3mL甲醇溶解，上样至该葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，以纯甲醇为流动相冲洗葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，收集流出组分，得到每瓶溶液体积为5mL的组分，收集20瓶，使用高效液相色谱仪分别测定所得20瓶组分中山莴苣素的纯度，将纯度高于95％的组分溶液合并，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥；

e、将步骤c中浓缩干燥所得固体，在温度70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，得到纯度99％的山莴苣素对照品，过滤后所得结晶母液，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，再在70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，合并所得两批晶体，共得纯度99％的山莴苣素对照品105mg，回收率52.5％。

实施例5

a、将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏；取所得浸膏，加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，再加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，将所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；

b、将步骤a得到的毛菊苣根提取物1000mg，超声溶解在50mL体积比50％的甲醇-水溶液中，离心除去沉淀，取上清液备用；

c、取一根反相C18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试C18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为50％，柱温控制在0℃，平衡色谱柱10min，待用；流速控制在180mL/min之间，将步骤b中所得萃取物溶液，收集山莴苣素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度85％的山莴苣素110mg；

d、以甲醇为装柱试剂，湿法填装一根长度为1.5m，内径为7cm的葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，取步骤c中所得纯度85％的山莴苣素110mg，加3mL甲醇溶解，上样至该葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，以纯甲醇为流动相冲洗葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，收集流出组分，得到每瓶溶液体积为5mL的组分，收集20瓶，使用高效液相色谱仪分别测定所得20瓶组分中山莴苣素的纯度，将纯度高于95％的组分溶液合并，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥；

e、将步骤c中浓缩干燥所得固体，在温度70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，得到纯度99％的山莴苣素对照品，过滤后所得结晶母液，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，再在温度70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，合并所得两批晶体，共得纯度99％的山莴苣素对照品85mg，回收率85％。

实施例6

a、将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏；取所得浸膏，加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，再加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，将所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；

b、将步骤a得到的毛菊苣根提取物1000mg，超声溶解在50mL体积比20％的甲醇-水溶液中，离心除去沉淀，取上清液备用；

c、取一根反相C18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试C18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为20％，柱温控制在50℃，平衡色谱柱15min，待用；流速控制在180mL/min，将步骤b中所得萃取物溶液，收集山莴苣素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度85％的山莴苣素85mg；

d、以甲醇为装柱试剂，湿法填装一根长度为1.5m，内径为7cm的葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，取步骤c中所得纯度85％的山莴苣素85mg，加2mL甲醇溶解，上样至该葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，以纯甲醇为流动相冲洗葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，收集流出组分，得到每瓶溶液体积为5mL的组分，收集20瓶，使用高效液相色谱仪分别测定所得20瓶组分中山莴苣素的纯度，将纯度高于95％的组分溶液合并，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥；

e、将步骤c中浓缩干燥所得固体，在温度70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，得到纯度99％的山莴苣素对照品，过滤后所得结晶母液，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，再在温度70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，合并所得两批晶体，共得纯度99％的山莴苣素对照品51mg，回收率51％。

实施例7

a、将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏；取所得浸膏，加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，再加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，将所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；

b、将步骤a得到的毛菊苣根提取物1000mg，超声溶解在50mL体积比65％的甲醇-水溶液中，离心除去沉淀，取上清液备用；

c、取一根反相C18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试C18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为65％，柱温控制在-10℃，平衡色谱柱15min，待用；流速控制在100mL/min，将步骤b中所得萃取物溶液，收集山莴苣素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度85％的山莴苣素115mg；

d、以甲醇为装柱试剂，湿法填装一根长度为1.5m，内径为7cm的葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，取步骤c中所得纯度85％的山莴苣素115mg，加3mL甲醇溶解，上样至该葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，以纯甲醇为流动相冲洗葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，收集流出组分，得到每瓶溶液体积为5mL的组分，收集20瓶，使用高效液相色谱仪分别测定所得20瓶组分中山莴苣素的纯度，将纯度高于95％的组分溶液合并，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥；

e、将步骤c中浓缩干燥所得固体，在温度70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，得到纯度99％的山莴苣素对照品，过滤后所得结晶母液，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，再在温度70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，合并所得两批晶体，共得纯度99％的山莴苣素对照品87mg，回收率87％。

实施例8

a、将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏；取所得浸膏，加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，再加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，将所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；

b、将步骤a得到的毛菊苣根提取物1000mg，超声溶解在50mL体积比50％的甲醇-水溶液中，离心除去沉淀，取上清液备用；

c、取一根反相C18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试C18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为40％，柱温控制在5℃，平衡色谱柱10min，待用；流速控制在120mL/min，将步骤b中所得萃取物溶液，收集山莴苣素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度85％的山莴苣素90mg；

d、以甲醇为装柱试剂，湿法填装一根长度为1.5m，内径为7cm的葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，取步骤c中所得纯度85％的山莴苣素90mg，加3mL甲醇溶解，上样至该葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，以纯甲醇为流动相冲洗葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，收集流出组分，得到每瓶溶液体积为5mL的组分，收集20瓶，使用高效液相色谱仪分别测定所得20瓶组分中山莴苣素的纯度，将纯度高于95％的组分溶液合并，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥；

e、将步骤c中浓缩干燥所得固体，在温度40℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，得到纯度99％的山莴苣素对照品，过滤后所得结晶母液，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，再在40℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，合并所得两批晶体，共得纯度99％的山莴苣素对照品30mg，回收率30％。

实施例9

a、将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏；取所得浸膏，加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，再加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，将所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；

b、将步骤a得到的毛菊苣根提取物1000mg，超声溶解在50mL体积比50％的甲醇-水溶液中，离心除去沉淀，取上清液备用；

c、取一根反相C18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试C18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为50％，柱温控制在0℃，平衡色谱柱30min，待用；流速控制在100mL/min，将步骤b中所得萃取物溶液，收集山莴苣素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度85％的山莴苣素110mg；

d、以甲醇为装柱试剂，湿法填装一根长度为1.5m，内径为7cm的葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，取步骤c中所得纯度85％的山莴苣素110mg，加2mL甲醇溶解，上样至该葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，以纯甲醇为流动相冲洗葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，收集流出组分，得到每瓶溶液体积为5mL的组分，收集20瓶，使用高效液相色谱仪分别测定所得20瓶组分中山莴苣素的纯度，将纯度高于95％的组分溶液合并，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥；

e、将步骤c中浓缩干燥所得固体，在温度60℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，得到纯度99％的山莴苣素对照品，过滤后所得结晶母液，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，再在60℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，合并所得两批晶体，共得纯度99％的山莴苣素对照品82mg，回收率82％。

实施例10

a、将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏；取所得浸膏，加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，再加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，将所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；

b、将步骤a得到的毛菊苣根提取物1000mg，超声溶解在50mL体积比90％的甲醇-水溶液中，离心除去沉淀，取上清液备用；

c、取一根反相C18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试C18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为50％，柱温控制在0℃，平衡色谱柱20min，待用；流速控制在150mL/min，将步骤b中所得萃取物溶液，收集山莴苣素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度85％的山莴苣素120mg；

d、以甲醇为装柱试剂，湿法填装一根长度为1.5m，内径为7cm的葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，取步骤c中所得纯度85％的山莴苣素120mg，加3mL甲醇溶解，上样至该葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，以纯甲醇为流动相冲洗葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，收集流出组分，得到每瓶溶液体积为5mL的组分，收集20瓶，使用高效液相色谱仪分别测定所得20瓶组分中山莴苣素的纯度，将纯度高于95％的组分溶液合并，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥；

e、将步骤c中浓缩干燥所得固体，在温度60℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，得到纯度99％的山莴苣素对照品，过滤后所得结晶母液，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，再在温度60℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，合并所得两批晶体，共得纯度99％的山莴苣素对照品90mg，回收率90％。

实施例11

a、将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏；取所得浸膏，加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，再加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，将所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；

b、将步骤a得到的毛菊苣根提取物1000mg，超声溶解在50mL浓度100％的甲醇中，离心除去沉淀，取上清液备用；

c、取一根反相C18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试C18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为50％，柱温控制在0℃，平衡色谱柱20min，待用；流速控制在160mL/min，将步骤b中所得萃取物溶液，收集山莴苣素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度85％的山莴苣素70mg；

d、以甲醇为装柱试剂，湿法填装一根长度为1.5m，内径为7cm的葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，取步骤c中所得纯度85％的山莴苣素90mg，加2mL甲醇溶解，上样至该葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，以纯甲醇为流动相冲洗葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，收集流出组分，得到每瓶溶液体积为5mL的组分，收集20瓶，使用高效液相色谱仪分别测定所得20瓶组分中山莴苣素的纯度，将纯度高于95％的组分溶液合并，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥；

e、将步骤c中浓缩干燥所得固体，在温度60℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，得到纯度99％的山莴苣素对照品，过滤后所得结晶母液，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，再在60℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，合并所得两批晶体，共得纯度99％的山莴苣素对照品63mg，回收率63％。

实施例12

a、将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏；取所得浸膏，加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，再加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，将所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；

b、将步骤a得到的毛菊苣根提取物1000mg，超声溶解在50mL甲醇含量为20％的甲醇-水中，离心除去沉淀，取上清液备用；

c、取一根反相C18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试C18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为50％，柱温控制在0℃，平衡色谱柱20min，待用；流速控制在160mL/min，将步骤b中所得萃取物溶液，收集山莴苣素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度85％的山莴苣素50mg；

d、以甲醇为装柱试剂，湿法填装一根长度为1.5m，内径为7cm的葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，取步骤c中所得纯度85％的山莴苣素50mg，加2mL甲醇溶解，上样至该葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，以纯甲醇为流动相冲洗葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，收集流出组分，得到每瓶溶液体积为5mL的组分，收集20瓶，使用高效液相色谱仪分别测定所得20瓶组分中山莴苣素的纯度，将纯度高于95％的组分溶液合并，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥；

e、将步骤c中浓缩干燥所得固体，在温度60℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，得到纯度99％的山莴苣素对照品，过滤后所得结晶母液，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，再在60℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，合并所得两批晶体，共得纯度99％的山莴苣素对照品35mg，回收率35％。

实施例13

a、将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏；取所得浸膏，加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，再加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，将所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；

b、将步骤a得到的毛菊苣根提取物1000mg，超声溶解在50mL体积比90％的甲醇-水溶液中，离心除去沉淀，取上清液备用；

c、取一根反相C18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试C18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为50％，柱温控制在0℃，平衡色谱柱10min，待用；流速控制在150mL/min，将步骤b中所得萃取物溶液，收集山莴苣素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度85％的山莴苣素120mg；

d、以甲醇为装柱试剂，湿法填装一根长度为1.5m，内径为7cm的葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，取步骤c中所得纯度85％的山莴苣素120mg，加3mL甲醇溶解，上样至该葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，以纯甲醇为流动相冲洗葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，收集流出组分，得到每瓶溶液体积为5mL的组分，收集20瓶，使用高效液相色谱仪分别测定所得20瓶组分中山莴苣素的纯度，将纯度高于95％的组分溶液合并，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥；

e、将步骤c中浓缩干燥所得固体，在温度70℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，得到纯度99％的山莴苣素对照品，过滤后所得结晶母液，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，再在温度60℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，合并所得两批晶体，共得纯度99％的山莴苣素对照品92mg，回收率92％。

实施例14

a、将毛菊苣根粉碎，以浓度为70％的甲醇水溶液，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取3次，过滤，合并，减压浓缩后获得浸膏；取所得浸膏，加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，再加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，将所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；

b、将步骤a得到的毛菊苣根提取物1000mg，超声溶解在50mL体积比90％的甲醇-水溶液中，离心除去沉淀，取上清液备用；

c、取一根反相C18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试C18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为50％，柱温控制在0℃，平衡色谱柱10min，待用；流速控制在150mL/min，将步骤b中所得萃取物溶液，收集山莴苣素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度85％的山莴苣素120mg；

d、以甲醇为装柱试剂，湿法填装一根长度为1.5m，内径为7cm的葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，取步骤c中所得纯度85％的山莴苣素120mg，加3mL甲醇溶解，上样至该葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，以纯甲醇为流动相冲洗葡聚糖LH-20型凝胶色谱柱，收集流出组分，得到每瓶溶液体积为5mL的组分，收集20瓶，使用高效液相色谱仪分别测定所得20瓶组分中山莴苣素的纯度，将纯度高于95％的组分溶液合并，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥；

e、将步骤c中浓缩干燥所得固体，在温度40℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，得到纯度99％的山莴苣素对照品，过滤后所得结晶母液，在温度50℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，再在温度60℃条件下加甲醇溶解成清亮的饱和溶液，至于温度4℃冰箱中过夜放置，得到无色透明结晶，过滤，并用石油醚洗涤，合并所得两批晶体，共得纯度99％的山莴苣素对照品45mg，回收率45％。

本发明所述的一种山莴苣素的制备方法，该方法简单易行制备效率高，可获得纯度高于99％的山莴苣素对照品，将所得山莴素对照品可用于药材标准化过程中的定量定性学研究。方法简单易行，纯化效率高，具有一定的应用价值。