一种从马蔺子中分离Hopeaphenol或/和Isohopeaphenol的方法
阅读说明：本技术 一种从马蔺子中分离Hopeaphenol或/和Isohopeaphenol的方法 (A method of Hopeaphenol or/and Isohopeaphenol is separated from Chinese small iris ) 是由 王洪伦 铁芳芳 王继飞 付洋洋 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从马蔺子中分离Hopeaphenol或/和Isohopeaphenol的方法,所述方法包括以下内容：(1)将马蔺子用碱性溶液提取,并收集提取液；(2)向收集的提取液中滴加酸性溶液,调pH＝1-3,静置、沉淀,收集沉淀物；(3)将收集的沉淀物用有机溶剂溶解后,除去溶剂,得到马蔺子碱提酸沉物；(4)将所得马蔺子碱提酸沉物溶解于有机溶剂中,收集液体部分；(5)将步骤(4)所收集的液体通过制备色谱得到组分S2；(6)将步骤(5)所得的组分S2,进行第二次半制备分离,依次得到流分产物S22和流分产物S23；所述S22特征峰的保留时间为21-22min,所述S23特征峰的保留时间为23-24min。(The invention discloses a kind of methods that Hopeaphenol or/and Isohopeaphenol is separated from Chinese small iris, and the method includes the following contents: (1) extracting Chinese small iris with alkaline solution, and collect extracting solution；(2) acid solution is added dropwise into the extracting solution of collection, adjusts pH=1-3, stands, precipitating, collects sediment；(3) after dissolving the sediment of collection with organic solvent, solvent is removed, the sub- alkali carries acid hypostasis of Chinese small iris is obtained；(4) the sub- alkali carries acid hypostasis of gained Chinese small iris is dissolved in organic solvent, collects liquid portion；(5) liquid collected by step (4) is obtained into component S2 by preparing chromatography；(6) by the resulting component S2 of step (5), second of half preparative separation is carried out, flow point product S22 and flow point product S23 are successively obtained；The retention time of the S22 characteristic peak is 21-22min, and the retention time of the S23 characteristic peak is 23-24min.)
技术领域
本发明涉及天然植物提取领域，尤其是一种从马蔺子中分离Hopeaphenol或/和Isohopeaphenol的方法。
背景技术
白藜芦醇(3,4',5-三羟基-反式茋)是在植物中发现的天然存在的酚类化合物，常见的白藜芦醇四聚体茋类次生代谢物有α-viniferin、ε-viniferin、hopeaphenol、isohopeaphenol、heyneanol A等。药理研究表明：白藜芦醇及白藜芦醇四聚体茋类次生代谢物对脂类代谢具有抗血小板凝集、影响脂类代谢等生物功能，并且可以通过抗氧化和抗突变作用而抑制癌症、通过抑制环氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)来抑制癌症的增殖、通过抑制p53蛋白的表达来抑制肿瘤细胞的转移、以及可用于治疗老年人退化疾病等。因此，白藜芦醇及白藜芦醇四聚体茋类次生代谢物在植物防御反应及人类健康保健等多个领域均具有重要的应用开发潜力。
马蔺，别名马莲、马兰、兰花草等，是被子植物门鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属(Iris)的多年生草本宿根植物。广泛分布于我国的西北、华北、华东和东北等地，同时中西亚、俄罗斯、蒙古及朝鲜也有分布。马蔺是一种传统的中草药，据《中华本草》中记载，马蔺为植物马蔺的全草，其性味苦、微甘，性微寒。归肾、膀胱、肝经。其具有清热解毒，利尿通淋，活血消肿的功能，用于治疗喉痹，淋浊，关节痛，痈疽恶疮等症，且马蔺的叶、花、根和种子也均可入药。马蔺花晒干后即可入药，性咸，味酸、苦，微凉，有清热凉血的功能，用于咽喉肿疼、吐血等症的治疗；马蔺根性平、味甘，具有清热解毒等功效，用于治疗牙痛、急性传染性肝炎、咽炎等症；其种子有清热解毒、利湿止血的功效，可用于黄疸、白带、泻痢、吐血等疾病的治疗。现代药理学表明马蔺具有多种药理作用，如放射增敏性、抗生物、增强免疫、抗癌、改善糖脂代谢等作用。到目前为止，已经从马蔺中分离得到多种化学成分，包括黄酮类、类黄酮类、苯醌类、甾醇和挥发油等。
但从马蔺中分离得到白藜芦醇四聚体茋类次生代谢物的研究几乎没有，同时也未见报道从马蔺中分离得到低聚茋类四聚体Hopeaphenol或/和Isohopeaphenol。
发明内容
针对上述不足，本发明旨在提供一种从马蔺子中分离Hopeaphenol或/和Isohopeaphenol的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：一种从马蔺子中分离Hopeaphenol或/和Isohopeaphenol的方法，包括以下内容：
(1)将马蔺子用碱性溶液提取，并收集提取液；
(2)向步骤(1)收集的提取液中滴加酸性溶液至pH＝1-3，静置、沉淀，收集沉淀物；
(3)将步骤(2)收集的沉淀物用有机溶剂溶解后，除去溶剂，得到马蔺子碱提酸沉物；
(4)将步骤(3)所得马蔺子碱提酸沉物溶解于有机溶剂中，收集液体部分；
(5)将步骤(4)所收集的液体通过制备色谱得到组分S2，以色谱图中峰高最高的特征峰为参照峰，相对于该参照峰，所述组分S2的相对保留时间为0.812948-0.862218min，优选相对保留时间为0.851378min；所述参照峰的保留时间为40.593min；所述S2特征峰的保留时间为33-35min，优选为34.56min；(6)将步骤(5)所得的组分S2，进行第二次半制备分离，依次得到流分产物S22和流分产物S23；所述S22特征峰的保留时间为21-22min，优选为21.954min，所述S23特征峰的保留时间为23-24min，优选为23.636min；
其中，所述流分产物S22为Hopeaphenol；所述流分产物S23为Isohopeaphenol。
上述流分产物S22 Hopeaphenol的结构式如图5所示，上述流分产物S23Isohopeaphenol的结构式如图6所示。
所述步骤(1)中，马蔺子在进行提取前先粉碎；进一步地，粉碎目数为30-50目，优选为30目；更进一步地，所述马蔺子优选为马蔺子种仁。在粉碎步骤之前，可先将马蔺子清洗、阴干再脱皮。
步骤(1)中所述的碱性溶液为NaOH溶液；进一步地，所述NaOH溶液的质量浓度为3-6％，优选为5％；更进一步地，所述马蔺子与碱性溶液的料液比为20-24kg：55-65L，优选为22kg：60L。
步骤(1)所述的提取时间为10-15h，优选为12h。
步骤(2)中所述酸性溶液为H2SO4；更进一步地，所述加入酸性溶液后，提取液pH＝3。步骤(3)中所述的有机溶剂为乙醇，优选为95％乙醇。
作为本发明的一个具体实施例，步骤(3)中所述去除溶剂采用蒸发和/或干燥，所述蒸发为减压浓缩蒸发；所述干燥温度为60-75℃，优选为65℃。
所述步骤(4)中，马蔺子碱提酸沉物与有机溶剂的料液比为15-25g：40-60ml，优选为20g：50ml；进一步地，步骤(4)中所述的有机溶剂为甲醇溶液。
所述步骤(5)具体为：将步骤(4)所收集的过滤溶液在C18制备柱上制备，得到组分S2；流动相：5～30％乙腈水溶液；采用如下程序进行梯度洗脱：0min，5～10％乙腈水溶液；35～45min，20～30乙腈水溶液；进一步地，采用如下程序进行梯度洗脱：0min，5％乙腈水溶液；40min，30％乙腈水溶液。
所述步骤(5)的制备参数为：色谱柱：Hedera C18，20*250mm，10μm的填料；流速：40～50mL/min；柱温：25～35℃。检测波长：210nm。
所述步骤(6)具体为：将所得到的组分S2，用甲醇溶解后，进行第二次半制备分离，依次得到流分产物S22和流分产物S23；进一步地，所述第二次半制备分离的参数为：30％的乙腈进行等度洗脱，色谱柱为20*250mm的C18半制备色谱柱。
所述第二次半制备分离的参数为：色谱柱：Hedera C18，20*250mm，10μm的填料；流速：40～50mL/min；柱温：25～35℃；检测波长：210nm。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1)本发明采用碱提酸沉结合半制备型液相色谱法快速高效分离制备Hopeaphenol或/和Isohopeaphenol，并且本发明所得的Hopeaphenol的纯度可达97.26％，Isohopeaphenol的纯度可达92.08％。
2)这两个低聚茋类四聚体化合物还未见报道从马蔺子种仁中分离纯化得到，本发明为首次从马蔺中分离出两个低聚茋类四聚体Hopeaphenol或/和Isohopeaphenol。
附图说明
图1为组分S2在色谱柱上分离色谱图；
图2为组分S22和S23在色谱柱上分离色谱图；
图3为组分S22纯度分析图；
图4为组分S23纯度分析图；
图5为化合物S22的化学结构式图；
图6为化合物S23的化学结构式图；
图7为化合物S22的H谱图；
图8为化合物S22的C谱图；
图9为化合物S23的H谱图；
图10为化合物S23的C谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所用仪器与试剂均如下所示：
仪器：安捷伦1260系列高效液相色谱仪，配备G1311C四元梯度泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G1315D检测器；汉邦NP7000C高效液相制备色谱仪、RE52-98旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)
试剂：分析和制备级乙腈均来自云南新蓝景化学工业有限公司，色谱用水为娃哈哈纯净水，应用于HPLC的有机溶剂为色谱纯。
下述实施例中，检测Hopeaphenol或/和Isohopeaphenol纯度所用方法为利用HPLC通过面积归一化法得到，计算方式为：目标化合物纯度％＝目标化合物峰面积/总峰面积*100％。
实施例1
通过以下步骤从马蔺子种仁中分离Hopeaphenol或/和Isohopeaphenol：
(1)将22kg经清洗、阴干再脱皮后的马蔺子种仁，粉碎目数至30目，用60L 5％NaOH溶液常温浸泡提取12h，并收集提取液。
(2)向步骤(1)收集的提取液中滴加H2SO4至pH＝3，室温静置使其产生沉淀后，离心，收集沉淀物。
(3)将步骤(2)收集的沉淀物用无水乙醇溶解后，经过减压浓缩蒸发、65℃干燥除去溶剂，得到马蔺子碱提酸沉物。
(4)将步骤(3)所得马蔺子碱提酸沉物20g溶解于50ml甲醇溶液中，收集液体部分。
(5)将步骤(4)所收集的液体在C18制备柱上制备，得到保留时间为34.56min的特征峰组分S2，详见图1；制备参数为：色谱柱：Hedera C18，20*250mm，10μm的填料；洗脱梯度：0min，5％乙腈水溶液；40min，30％乙腈水溶液；流速：40～50mL/min；柱温：25～35℃；检测波长：210nm。
(6)将步骤(5)所得的组分S2用甲醇溶解，进行第二次半制备分离，得到保留时间为21.954min的特征峰流分产物S22 Hopeaphenol和保留时间为23.636min的特征峰流分产物S23 Isohopeaphenol，详见图2；第二次半制备分离的参数为：色谱柱：Hedera C18，20*250mm，10μm的填料；洗脱剂：30％乙腈等度洗脱；流速：40～50mL/min；柱温：25～35℃；检测波长：210nm。
实施例2
通过以下步骤从马蔺子种仁中分离Hopeaphenol或/和Isohopeaphenol：
(1)将20kg经清洗、阴干再脱皮后的马蔺子种仁，粉碎目数至30目，用65L 3％NaOH溶液常温浸泡提取15h，并收集提取液。
(2)向步骤(1)收集的提取液中滴加H2SO4至pH＝1，室温静置使其产生沉淀后，离心，收集沉淀物。
(3)将步骤(2)收集的沉淀物用无水乙醇溶解后，经过减压浓缩蒸发、75℃干燥除去溶剂，得到马蔺子碱提酸沉物。
(4)将步骤(3)所得马蔺子碱提酸沉物15g溶解于60ml甲醇溶液中，收集液体部分。
(5)将步骤(4)所收集的液体在C18制备柱上制备，得到保留时间为34.56min的特征峰组分S2，详见图1；制备参数为：色谱柱：Hedera C18，20*250mm，10μm的填料；洗脱梯度：0min，5％乙腈水溶液；40min，30％乙腈水溶液；流速：40～50mL/min；柱温：25～35℃。检测波长：210nm。
(6)将步骤(5)所得的组分S2用甲醇溶解，进行第二次半制备分离，得到保留时间为21.954min的特征峰流分产物S22 Hopeaphenol和保留时间为23.636min的特征峰流分产物S23 Isohopeaphenol，详见图2；第二次半制备分离的参数为：色谱柱：Hedera C18，20*250mm，10μm的填料；洗脱剂：30％乙腈等度洗脱；流速：40～50mL/min；柱温：25～35℃；检测波长：210nm。
实施例3
通过以下步骤从马蔺子种仁中分离Hopeaphenol或/和Isohopeaphenol：
(1)将24kg经清洗、阴干再脱皮后的马蔺子种仁，粉碎目数至50目，用55L 6％NaOH溶液常温浸泡提取10h，并收集提取液。
(2)向步骤(1)收集的提取液中滴加H2SO4至pH＝2，室温静置使其产生沉淀后，离心，收集沉淀物。
(3)将步骤(2)收集的沉淀物用无水乙醇溶解后，经过减压浓缩蒸发、60℃干燥除去溶剂，得到马蔺子碱提酸沉物。
(4)将步骤(3)所得马蔺子碱提酸沉物25g溶解于40mL甲醇溶液中，收集液体部分。
(5)将步骤(4)所收集的液体在C18制备柱上制备，得到保留时间为34.56min的特征峰组分S2，详见图1；制备参数为：色谱柱：Hedera C18，20*250mm，10μm的填料；洗脱梯度：0min，5％乙腈水溶液；40min，30％乙腈水溶液；流速：40～50mL/min；柱温：25～35℃；检测波长：210nm。
(6)将步骤(5)所得的组分S2用甲醇溶解，进行第二次半制备分离，得到保留时间为21.954min的特征峰流分产物S22 Hopeaphenol和保留时间为23.636min的特征峰流分产物S23 Isohopeaphenol，详见图2；第二次半制备分离的参数为：色谱柱：Hedera C18，20*250mm，10μm的填料；洗脱剂：30％乙腈等度洗脱；流速：40～50mL/min；柱温：25～35℃；检测波长：210nm。
实验例1
将S22和S23分别进行高效液相色谱检测以确定纯度。
其检测条件：色谱柱：Kromasil C18，5μm，4.6*250mm；流动性：10-50％乙腈水；检测时间：0-40min；检测波长210nm；结果详见图3、图4，其中Hopeaphenol的纯度达到97.26％，Isohopeaphenol的纯度达到92.08％。
上述流分S22和流分S23产物的结构确认结果如下所示：
流分S22：
1H NMR(600MHz,CD3OD)δ:7.09(2H,d,J＝8.6Hz,H-2a,6a),6.89(2H,d,J＝8.4Hz,H-2b,6b),6.72(2H,d,J＝8.6Hz,H-3a,5a),6.53(2H,d,J＝8.7Hz,H-3b,5b),6.35(1H,d,J＝2.0Hz,H-12a),6.21(1H,d,J＝1.8Hz,H-14a),5.80(1H,d,J＝12.1Hz,H-7a),5.75(1H,brs,H-7b),5.72(1H,d,J＝2.2Hz,H-12b),5.06(1H,d,J＝2.2Hz,H-14b),4.12(1H,d,J＝12.1Hz,H-8a),3.85(1H,s,H-8b)；详见图7。
13C-NMR(151MHz,CD3OD)δ:159.4(s,C-11a),159.3(s,C-11b),158.9(s,C-4a),157.3(s,C-4b),157.0(s,C-13b),155.5(s,C-13a),142.5(s,C-9a),141.3(s,C-9b),136.0(s,C-1b),131.0(C-1a),130.5(s,C-2a,6a),129.7(s,C-2b,6b),122.0(s,C-10a),119.6(s,C-10b),116.1(s,C-3a,5a),115.3(s,C-3b,5b),111.8(s,C-14b),106.3(s,C-14a),101.0(s,C-12a),95.4(s,C-12b),89.0(s,C-7a),49.9(s,C-8a),48.6(s,C-8b),41.8(s,C-7b)；详见图8。
流分S23：
1H NMR(600MHz,CD3OD)δ:7.51(2H,d,J＝8.6Hz,H-2a,6a),6.97(2H,d,J＝8.5Hz,H-2b,6b),6.39(3H,m,H-12a,2b,6b),6.31(2H,m,H-3b,5b),6.20(1H,d,J＝2.3Hz,H-14a),5.79(1H,d,J＝2.1Hz,H-12b),5.65(1H,d,J＝10.3Hz,H-7a),5.42(1H,J＝2.1Hz,H-14b),5.37(1H,brd,J＝10.3Hz,H-8a),5.03(1H,brs,H-7b),3.40(1H,brs,H-8b)；详见图9。
13C-NMR(151MHz,CD3OD)δ:160.6(s,C-11b),159.3(s,C-11a),159.1(s,C-4a),158.3(s,C-13b),157.0(s,C-13a),155.1(s,C-4b),142.3(s,C-9b),141.1(s,C-9a),138.2(s,C-1b),131.7(C-1a),131.1(s,C-2a,6a),130.1(s,C-2b,6b),118.9(s,C-10a),117.8(s,C-10b),116.9(s,C-3a,5a),114.9(s,C-3b,5b),110.2(s,C-14b),107.5(s,C-14a),102.7(s,C-12a),95.4(s,C-12b),94.6(s,C-7a),54.2(s,C-8a),53.4(s,C-8b),44.1(s,C-7b)；详见图10。
由上可知，所得流分S22产物为Hopeaphenol，其结构式如图5所示；所得流分S23产物为Isohopeaphenol，其结构式如图6所示。