甘松萜类化合物及其分离和在制备抗胰腺癌药物中的应用
阅读说明：本技术 甘松萜类化合物及其分离和在制备抗胰腺癌药物中的应用 (Nardostachys chinensis terpenoid, separation method thereof and application of nardostachys chinensis terpenoid in preparation of anti-pancreatic cancer drugs ) 是由 杨军丽 桑春艳 于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了甘松萜类化合物的结构及分离方法,并通过CCK-8、诱导胰腺癌细胞凋亡实验发现,从甘松中分离出的天然甘松萜类化合物具有很好的抗胰腺癌活性,可作为活性成分用于制备治疗胰腺癌的药物。甘松萜类化合物的结构式如下：(Hair brushThe invention discloses a structure and a separation method of nardostachys chinensis benth terpenoid, and the experiments of CCK-8 and pancreatic cancer cell apoptosis induction show that the natural nardostachys chinensis benth terpenoid separated from nardostachys chinensis benth has good anti-pancreatic cancer activity and can be used as an active ingredient for preparing a medicament for treating pancreatic cancer. The structural formula of the nardostachys chinensis bunge terpenoid is as follows:)
技术领域
本发明涉及一种天然甘松萜类化合物及其分离方法，同时还涉及该甘松萜类化合物的抗胰腺癌生物活性及作为制备抗胰腺癌药物活性物质的应用，属于天然药物化学领域。
背景技术
胰腺癌（PC）被称为“癌中之王”，具有很高的侵袭性和致命性，是目前已知预后最差的恶性肿瘤之一。近年来，我国胰腺癌的发病率呈上升趋势，其死亡率居恶性肿瘤的前10位，5年生存率只有10%。胰腺癌患者中大约有80%-85%的患者无法手术切除或者已经发生转移，即使可以局部手术切除的患者，预后仍然很差，通过手术得到控制的患者只有10%~15%。药物治疗是胰腺癌治疗的主要手段之一，但由于耐药性和缺乏药物特异性，药物总体有效率不到20%。为了延长胰腺癌患者的生存期，迫切需要开发寻找更加安全有效的胰腺癌化疗药物。
天然产物作为药物的重要来源，在新药的发现和开发中发挥着重要的作用。60%以上的抗肿瘤药物与天然产物密切相关。虽然小分子靶向药物在癌症治疗中占主导地位。因此，寻找天然活性化合物，发现新型抗胰腺癌药物，有助于推动寻找高效抗胰腺癌药物。 甘松，中药名，为败酱科植物甘松Nardostachys jatamansi DC.的干燥根及根茎。理气止痛，开郁醒脾，外用祛湿消肿。有镇静、抗癫痫、抗抑郁、促神经生长、改善认知能力、保护心肌细胞、降血压、抑菌与抗疟、抗肿瘤等多种药理活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种天然甘松萜类化合物及其分离方法；
本发明的另一目的是对上述分离的天然甘松萜类化合物的抗胰腺癌活性进行研究，以期用于制备治疗抗胰腺癌的药物。
一、天然甘松萜类化合物的分离
本发明天然甘松萜类化合物的分离，包括以下步骤：
（1）将干燥的甘松根及茎用甲醇室温提取3次，每次7天，提取液合并，蒸发浓缩至无醇味，得到总提取液；
（2）将总提取物用水分散后，分别用石油醚（60-90℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相；
（3）乙酸乙酯相通过硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯（10:1~0:1，v/v）梯度洗脱，得到九个组分Fr.1~Fr.9；组分Fr.3中有大量结晶，用石油醚洗涤，剩余部分通过硅胶柱分离并用石油醚-乙酸乙酯（10:1-0:1, v/v）梯度洗脱，得到十二个组分Fr.3.1~Fr.3.12；其中Fr.3.11通过硅胶柱纯化得到化合物2；
（4）组分Fr.4通过硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯（10:1-1:1, v/v）梯度洗脱，得到九个组分Fr.4.1-Fr.4.9；其中组分Fr.4.3用 Sephadex LH-20凝胶分离并用二氯-甲醇（1:1, v/v）洗脱，得到三个组分Fr.4.3.1~Fr.4.3.3；Fr.4.3.2用C18 反相硅胶柱分离，甲醇/水（50:50~100:0，v/v）梯度洗脱，依次得到5个组分Fr.4.3.2.1~Fr.4.3.2.5；其中，Fr.4.3.2.2.1通过HPLC分离（甲醇/水= 50/50，流速10 mL/min）并再次用HPLC纯化（甲醇/水=55/45，流速10 mL /min），得到化合物6和化合物 1；
（5）组分Fr.4.4通过硅胶柱分离并用石油醚/丙酮（50:1-0:1，v/v）梯度洗脱，得到九个馏分Fr.4.4.1~Fr.4.4.9；Fr.4.4.4通过 ODS CC 分离并用甲醇/水（30%-100%，v/v）梯度洗脱，获得十四个组分Fr.4.4.4.1~Fr.4.4.4.12；其中Fr.4.4.4.10用甲醇洗涤并用氯仿重结晶得到化合物19；
（6）Fr.4.4.6通过 ODS CC 分离并用甲醇/水（30%-100%） 梯度洗脱，获得十五个组分 Fr.4.4.6.1~Fr.4.4.6.15；其中，Fr.4.4.6.2通过HPLC（甲醇/水= 50/50，流速10 mL/min）纯化，得到化合物14；Fr.4.4.6.7通过HPLC（甲醇/水= 80/20，流速10 mL/min）纯化，得到化合物16。
通过旋光值、紫外光谱UV、圆二色光谱C、光谱IR、红外(KBr)、氢谱1H 和碳谱13C 、NMR高分辨质谱HRESIMS对上述分离得到的化合物1、2、6、14、16进行分析，对化合物19进行单晶衍射图分析，确定化合物1、2、6、14、16、19的结构式如下：
二、天然甘松萜类化合物的抗胰腺癌活性
1、天然甘松萜类化合物抑制胰腺癌细胞增殖活性
本实验用人源胰腺癌细胞SW1990细胞，取对数生长期的SW1990细胞，接种于96孔板（每孔1×104个细胞），待细胞贴壁后，分别加入浓度范围为0.1-100 µM梯度的待测化合物，培养72 h，然后每孔加入10 µL CCK-8溶液继续培养4小时，振荡10 min，酶标仪450 nm测定吸光度值，采用CCK-8法检测天然甘松萜类化合物1、2、6、14、16、19对胰腺癌细胞SW1990细胞的增殖抑制作用，根据吸光值计算SW1990胰腺癌细胞的存活率，并计算测试化合物IC50值。
图1为化合物1、2、6、14、16、19对胰腺癌SW1990细胞抑制作用。图1A是化合物1对SW1990细胞的抑制作用，其IC50值为21.19±9.21 µM；图1B是化合物2对SW1990细胞的抑制作用，其IC50值为2.12±0.21 µM；图1C是化合物6对SW1990细胞的抑制作用，其IC50值为0.08±0.33 µM；图1D是化合物14对SW1990细胞的抑制作用，其IC50值为3.18±2.84 µM；图1E是化合物16对SW1990细胞的抑制作用，其IC50值为2.78±2.09 µM；图1F是化合物19对SW1990细胞的抑制作用，其IC50值为5.15±2.95 µM。图1的结果显示，化合物1、2、6、14、16、19对胰腺癌SW1990细胞都有显著的增殖抑制作用，表明化合物1、2、6、14、16、19能够明显抑制胰腺癌细胞的增殖，具有抗胰腺癌潜在作用，具有开发胰腺癌治疗药物的潜能。
2、天然甘松萜类化合物诱导胰腺癌细胞凋亡
取对数生长期细胞，普通洁净的盖玻片放入六孔板板中进行爬片，种入细胞后过夜，加入5 µM的化合物1、2、6、14、16、19，培养24 h，弃掉培养液，加入固定液，固定10 min，弃固定液，用PBS洗2遍，每次3 min，加入0.5 mL Hoechst染色液，染色5 min，用PBS洗2遍，在载玻片上滴加荧光淬灭剂，盖上贴有细胞的盖玻片，在倒置荧光显微镜下观察，拍照。
结果如图2所示，图2A为空白对照组，细胞形态均一，细胞核完整；图2B为化合物1，浓度为5 µM；图2C为化合物2，浓度为5 µM；图2D为化合物6，浓度为5 µM；图2E为化合物14，浓度为5 µM；图2F为化合物16，浓度为5 µM；图2G为化合物19，浓度为5 µM。通过hoechest33258染色实验发现，和对照组细胞核形态完整、密度均匀、细胞核形态均一等状态比较，化合物1、2、6、14、16、19 能够使SW1990细胞核发生皱缩裂解，细胞核染色质不均匀分布，有典型的细胞凋亡形态（图2中箭头所示）。该实验结果表明甘松中分离得到的天然甘松萜类化合物1、2、6、14、16、19能够诱导胰腺癌细胞SW1990细胞发生细胞凋亡。
综上所述，本发明通过CCK-8法、诱导胰腺癌细胞凋亡实验，表明本发明从甘松中分离出的天然甘松萜类化合物1、2、6、14、16、19具有很好的抗胰腺癌活性，可作为活性成分，用于制备治疗胰腺癌的药物。
附图说明
图1为化合物1、2、6、14、16、19对胰腺癌SW1990细胞抑制作用。
图2为化合物1、2、6、14、16、19诱导胰腺癌细胞发生凋亡。
具体实施方式
实施例1
将50kg干燥的甘松根及根茎用甲醇室温提取3次，每次7天，提取液合并， 蒸发浓缩至无醇味，得到总提取液9Kg，将总提取物用水分散后，分别用石油醚（90℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。
乙酸乙酯相（1.14 Kg）通过硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯（10:1-0:1, v/v）梯度洗脱，得到九个组分（Fr.1-Fr.9）。其中组分Fr.3中有大量结晶（77g），用石油醚洗涤。Fr.3的剩余部分（23g）通过硅胶柱分离并用石油醚-乙酸乙酯（10:1-0:1, v/v）梯度洗脱，得到十二个组分 (Fr.3.1-Fr.3.12)。Fr.3.11（132 mg）通过硅胶柱纯化得到化合物2（13mg）。
组分Fr.4（59 g）通过硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯（10:1-1:1, v/v）梯度洗脱，得到九个组分Fr.4.1-Fr.4.9）。Fr.4.3（2.51 g）用 Sephadex LH-20凝胶分离并用二氯-甲醇（1:1, v/v）洗脱，得到三个组分（Fr.4.3.1-Fr.4.3.3）。Fr.4.3.2（1.64 g）用C18 反相硅胶柱分离，甲醇/水（50:50~100:0，v/v）梯度洗脱，依次得到5个组分 (Fr.4.3.2.1-Fr.4.3.2.5)。其中，Fr.4.3.2.2.1（178 mg）通过HPLC分离（甲醇/水= 50/50，流速10 mL/min）并再次用HPLC纯化（甲醇/水=55/45，流速10 mL /min）得到化合物6（4.8 mg, tR =29.3 min）和化合物 1（8.5 mg, tR = 32.4 min）。
组分Fr.4.4（26 g）通过硅胶柱分离并用石油醚/丙酮（50:1-0:1，v/v）梯度洗脱，得到九个馏分（Fr.4.4.1-Fr.4.4.9）。Fr.4.4.4（ 926 mg）通过 ODS CC 分离并用甲醇/水（30%-100%，v/v）梯度洗脱以获得十四个组分（Fr.4.4.4.1-Fr.4.4.4.12）。Fr.4.4.4.10（32.8mg）用甲醇洗涤并用氯仿重结晶得到化合物19（13.3mg）。
Fr.4.4.6（1.54 g）也通过 ODS CC 分离并用甲醇/水（30%-100%） 梯度洗脱以获得十五个组分 (Fr.4.4.6.1-Fr.4.4.6.15)。Fr.4.4.6.2（54mg）通过HPLC（甲醇/水= 50/50，流速10 mL/min）纯化，得到化合物14（15.2mg，tR＝31.2min）。 Fr.4.4.6.7（149mg）通过HPLC（甲醇/水= 80/20，流速10 mL/min）纯化，得到化合物16(110.8mg，tR＝12.3min)。
新化合物1、2、6、14、16、19的表征数据如下：
化合物1：黄色胶状物；旋光值[α] -170.2 (浓度c 0.83，溶剂为甲醇); 紫外光谱UV (MeOH) λmax (log ɛ) 241nm (3.86), 320nm (3.09); 圆二色光谱CD(MeOH) λmax(Δɛ) 203nm (+3.21), 270nm (-1.93), 337nm (-2.07); 红外光谱IR (KBr) v max 3448,2925, 1726, 1650, 1451, 1267, 1072, 750, 663 cm-1; 氢谱1H 和碳谱13C NMR见表1；高分辨质谱HRESIMS m/z255.1366 [M+Na]+(calcd for C15H20O2Na, 255.1356)。
化合物2：无色胶状；旋光值[α]-42.9 (浓度c 0.15，溶剂为甲醇); 紫外光谱UV(MeOH) λmax (log ɛ) 239 nm (3.60), 271 nm (2.25); 圆二色光谱CD (MeOH) λmax (Δɛ) 228 nm (-4.91); 红外光谱IR (KBr) v max 3426, 2951, 1689, 1635, 1444, 1416,1121, 1019, 768, 733, 618 cm-1; 氢谱1H 和碳谱13C NMR见表1；高分辨质谱HRESIMS m/ z289.1414 [M+Na]+(calcd for C15H22O4Na, 289.1410)。
化合物6：淡黄色粉末；旋光值[α]+ 47.2（浓度c 0.43，溶剂为甲醇）；紫外光谱UV (MeOH) λmax (log ɛ) 202 nm (2.99), 245 nm (3.22), 300 nm (2.31); 圆二色光谱CD (MeOH) λmax (Δ ɛ) 225 nm (+4.03), 318 nm (－0.63); 红外光谱IR (KBr)v max3396, 2923, 2853, 1678, 1427, 1263, 1220, 1132, 801, 721, 614 cm-1；氢谱1H和碳谱13C NMR见表1；高分辨质谱HRESIMS m/z 273.1464 [M + Na]+ (calcd. forC15H22O3Na, 273.1461)。
化合物14：白色粉末; 旋光值[α]+15.6 (浓度c 0.28，溶剂为甲醇); 紫外光谱UV (MeOH) λmax (log ɛ) 229 nm (4.02), 278 nm (3.93); 圆二色光谱CD (MeOH) λ max(Δɛ) 249 nm (-2.19); 红外光谱IR (KBr) v max 3441, 2929, 1773, 1718, 1644,1258, 1202, 1097, 884, 790, 750 cm-1; 氢谱1H 和碳谱13C NMR见表1；高分辨质谱HRESIMS m/z287.1265 [M+Na]+(calcd for C15H20O4Na, 287.1254)。
化合物16：黄色粉末; 旋光值[α]+78.3 (浓度c 0.45，溶剂为甲醇); 紫外光谱UV (MeOH) λmax (log ɛ) 202 nm (3.96), 254 nm (3.81); 圆二色光谱CD (MeOH)λmax(Δɛ) 215 nm (+2.47), 254 nm (+5.85); 红外光谱 IR (KBr) v max 3434, 2957, 2924,2853, 1734, 1651, 1285, 1125, 1073, 1047 cm-1; 氢谱1H 和碳谱13C NMR见表1；高分辨质谱HRESIMS m/z481.1572 [M+Na]+(calcd for C22H31ClO8Na, 481.1600)。
化合物19：黄色条状晶体，其单晶衍射图如下：
实施例2
即分别以从甘松中分离出的天然甘松萜类化合物1、2、6、14、16、19为药物活性组分，以药学或生理学可接受的辅料及常规药物制剂的制备工艺制成内服制剂（包括散剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、粉剂、丸剂、片剂、口服液）或注射剂。