阅读说明：本技术 含D型脯氨酸和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽及制备方法 (β hairpin antibacterial peptide containing D-type proline and glycine corner and preparation method thereof ) 是由 单安山 邵长轩 菅俏 于 2020-03-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种含D型脯氨酸和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽及制备方法。本发明抗菌肽WKFpG其序列如SEQ ID No.1所示。本发明以刚性D-Pro-Gly转角为转角单元,通过在β-发卡侧链的非氢键位点对称放置色氨酸和赖氨酸,利用其交互作用辅助D-Pro-Gly转角形成发卡结构,设计出抗菌肽模板XWYKYZZXWYKY-NH<Sub>2</Sub>。本抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引起的感染性疾病药物中的应用。本抗菌肽氨基酸序列长度仅有12,揭示刚性pG转角对于β-发夹抗菌肽的生物学活性的影响,对多种革兰氏阴性菌和阳性菌具有高效的抑制作用,而且溶血活性较低,治疗指数达到110.30,相较于含有NG转角的相同侧链的β-发卡抗菌肽提高了1.5倍,具有成为绿色高效抗生素替代品的发展潜力。(The invention provides an β hairpin antibacterial peptide containing D-type proline and glycine corner and a preparation method thereof.A sequence of the antibacterial peptide WKFpG is shown as SEQ ID No. 1. the invention takes rigid D-Pro-Gly corner as a corner unit, tryptophan and lysine are symmetrically placed at non-hydrogen bond sites of β -hairpin side chains, and the interaction of the tryptophan and the lysine is utilized to assist the D-Pro-Gly corner to form a hairpin structure, so that an antibacterial peptide template XWYKYZZXWKY-NH is designed 2 . The antibacterial peptide is applied to the preparation of medicaments for treating infectious diseases caused by gram-positive bacteria or/and gram-negative bacteria. The antibacterial agent has antibacterial effectThe length of the peptide amino acid sequence is only 12, the influence of rigid pG corner on the biological activity of β -hairpin antibacterial peptide is revealed, the peptide has high-efficiency inhibition effect on various gram-negative bacteria and gram-positive bacteria, the hemolytic activity is low, the therapeutic index reaches 110.30, the peptide is improved by 1.5 times compared with β -hairpin antibacterial peptide containing the same side chain of NG corner, and the peptide has the development potential of being a green high-efficiency antibiotic substitute.)

含D型脯氨酸和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含D型脯氨酸和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽及制备方法。

背景技术

在过去的几十年中，抗生素的过度使用和不当使用促进了药物残留和细菌耐药性的出现，这引发了严重的全球健康问题，并促使动物生产或其他行业的经济产出减少。探索新型治疗策略已成为当务之急。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)作为宿主防御的第一线几乎在所有多细胞生物体中都起着固有的作用，显示出对多种病原体的抑制活性。尽管近年来已报道了细菌中AMPs的多种作用靶标，但毫无疑问，大多数AMPs在其阳离子结构域与细菌表面带负电荷的脂质之间发生静电相互作用后，将其疏水结构域插入细胞质膜中。这种非受体膜溶解机制使细菌不利于产生对AMPs的抗性。因此，AMPs被认为是抗生素替代品的重要竞争者。

迄今为止，抗菌肽数据库已包含来自细菌，古细菌，原生生物，真菌，植物和动物的3,000多种AMPs。但是，从天然来源分离出的这些AMPs的应用通常受到其序列长度，缺乏功效和过度的细胞毒性的限制。在AMPs开发的所有阶段中，研究人员综合蛋白质工程和抗菌肽的构效关系已经发明了一系列方法，例如序列截短，基序杂交和氨基酸置换来解决这些难题。但是，这些研究受制于母肽模版的固定性和复杂性，对于抗菌肽的结构功能关系难以清晰有效的揭示。同时，在过去几十年对于抗菌肽的研究当中，大部分都是针对线性α螺旋抗菌肽，β-折叠抗菌肽因为其复杂的结构构成以及生产中难以实现的二硫键，被研究的不够广泛。因此，通过氨基酸合理排布设计简短的β-结构两亲模版对于研究β-折叠抗菌肽的结构功能关系以及β-折叠抗菌肽的临床应用有着深远的意义。β-发夹结构作为β-折叠结构的单片层，由一个β-转角和两条反向平行的侧链组成，是研究β-折叠抗菌肽十分简便有效的形式。现有许多研究通过固定β-转角设计不同侧链以达到改善生物学活性的目的，但不同β-转角对于β-发夹抗菌肽的结构和生物学活性的影响尚不明确。现有的具有β-发夹抗菌肽序列模式过长、合成方式复杂，抑菌活性低效，生物安全性不高的问题。

发明内容

基于以上不足之处，本发明提供一种含D型脯氨酸和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽及制备方法，解决β-折叠抗菌肽制备过程中序列过长、毒性较高、合成困难、合成成本高等问题。

本发明所采用的技术方案如下：一种含D型脯氨酸和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽WKFpG，所述的抗菌肽WKFpG以D-Pro-Gly转角为转角单元，通过在β发卡侧链的非氢键位点放置两对色氨酸和赖氨酸，利用其交互作用辅助D-Pro-Gly转角形成发卡结构，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还公开如上所述的一种含D型脯氨酸和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽WKFpG的制备方法，技术特点如下：以刚性D-Pro-Gly转角为转角单元，通过在β发卡侧链的非氢键位点放置两对色氨酸和赖氨酸，利用其交互作用辅助D-Pro-Gly转角形成发卡结构，设计出抗菌肽模板XWYKYZZXWYKY-NH₂，当X＝R，Y＝F，ZZ＝pG时，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的另一目的在于提供如上所述的含D型脯氨酸和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽WKFpG在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引起的感染性疾病药物中的应用。

本发明的有益效果及优点：通过本方法制备的抗菌肽，结构稳定，序列长度短，不含抗菌肽生产中难以实现的二硫键，制备技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现WKFpG对大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等多种菌株有高效的抑制作用，对十种细菌抑制活性的几何平均数达到4.64，而且具有很低的溶血活性，治疗指数达到110.30，相较于含有NG转角的相同侧链的β-发卡抗菌肽提高了1.5倍，表明D型脯氨酸甘氨酸转角有利于提高抗菌肽的抑菌活性。综上所述，WKFpG是一种具有较高应用价值的抗菌肽。

附图说明

图1为抗菌肽WKFpG的高效液相色谱图；

图2为抗菌肽WKFpG的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗菌肽的设计RWFKFpGRWFKF-NH₂

抗菌肽WKFpG的氨基酸序列为：

Arg Trp Phe Lys Phe D-Pro Gly Arg Trp Phe Lys Phe-NH₂

1 5 10 12

以刚性D-Pro-Gly转角为转角单元，通过在β-发卡侧链的非氢键位点放置两对色氨酸和赖氨酸，利用其交互作用辅助D-Pro-Gly转角形成发卡结构，设计出抗菌肽模板XWYKYZZXWYKY-NH₂，其中X为正电荷氨基酸，Y为疏水性氨基酸，ZZ为β-转角单元，当X＝R，Y＝F，ZZ＝pG时,抗菌肽命名为WKFpG。抗菌肽的序列如表1肽WKFpG所示。以Asn-Gly转角形成发卡结构，形成的抗菌肽的序列如表1肽WKFNG所示。

表1衍生肽的氨基酸序列

WKFpG和WKFNG的序列长度均为12，均由两个色氨酸和四个苯丙氨酸提供充足的疏水性，转角单元为D-Pro-Gly/Asn-Gly转角单元。均含两个精氨酸两个赖氨酸，将肽的C端酰胺化以提高一个正电荷，总电荷数为+5。

实施例2

固相化学合成法合成WKFpG抗菌肽

1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH 7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1、2所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。

实施例3：抗菌肽抗菌活性的测定

1、抗菌活性的测定：微量肉汤稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁵个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养18h，用酶标仪在492nm(OD₄₉₂)处测定光吸收值，确定最小抑菌浓度。测试进行3次重复，每次重复两个平行。检测结果见表2。

表2抗菌肽的抑菌活性(μM)

通过表2可以看出，WKFpG对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出较高的抑菌活性。含D-Pro-Gly转角的抗菌肽WKFpG要比含Asn-Gly转角的抗菌肽WKFNG抑菌活性有所提高,特别是对于鼠伤寒沙门氏菌，抑菌活性提高了1.7-3.3倍。

2、溶血活性的测定：收集1mL新鲜的红细胞悬浮液，并用PBS(pH 7.4)稀释10倍。将50μL hRBC溶液与50μL溶于PBS的倍比稀释肽在37℃孵育1小时。用0.1％Triton X-100处理的hRBC悬浮液用作阳性对照，未处理的hRBC悬浮液用作阴性对照。离心(1000g，5分钟，4℃)后从混合物中收集50μL上清液，并转移至新的96孔微孔板中。溶血百分比使用以下公式计算：溶血率(％)＝[(处理样品的OD₅₇₀–阴性对照的OD₅₇₀)/(阳性对照的OD₅₇₀–阴性对照的OD₅₇₀)]×100％。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见表3。

表3抗菌肽溶血活性的测定

WKFpG和WKFNG在检测范围内均未表现出溶血活性，使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值计算其治疗指数，WKFpG治疗指数达到110.30，较WKFNG提高了1.55倍。

综合以上结果显示，以刚性D-Pro-Gly转角为转角单元，以色氨酸赖氨酸为跨链交互作用设计出的抗菌肽WKFpG具有较高的治疗指数，表明其具有较强的替代抗生素的潜力。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 含D型脯氨酸和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽及制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Trp Phe Lys Phe Pro Gly Arg Trp Phe Lys Phe

1 5 10