阅读说明：本技术 抗衰老健康食品和化妆品以及源自葡萄籽的抗衰老成分的制造方法 (Anti-aging health food and cosmetic and method for producing anti-aging ingredient derived from grape seed ) 是由 永尾司 于 2017-12-15 设计创作，主要内容包括：问题：提供比白藜芦醇等已知的预计具有抗衰老作用的物质,具有更优异的抗衰老作用的抗衰老健康食品和化妆品以及具有优异的抗衰老作用的源自葡萄籽的抗衰老成分的制造方法。解决方案：本发明的抗衰老健康食品和抗衰老化妆品,含有经过粗提纯的源自葡萄籽的抗衰老成分,该成分包含60重量％以上的源自葡萄籽的多酚。(The problems are as follows: provided are anti-aging health foods and cosmetics having more excellent anti-aging effects than known substances expected to have anti-aging effects such as resveratrol, and a method for producing an anti-aging component derived from grape seeds having excellent anti-aging effects. The solution is as follows: the anti-aging health food and the anti-aging cosmetic of the present invention contain a crude purified anti-aging ingredient derived from grape seeds, which contains more than 60% by weight of polyphenols derived from grape seeds.)

抗衰老健康食品和化妆品以及源自葡萄籽的抗衰老成分的制 造方法

技术领域

本发明涉及抗衰老健康食品和化妆品以及源自葡萄籽的抗衰老成分的制造方法，更具体地，本发明涉及具有抗衰老作用优于白藜芦醇的抗衰老健康食品和化妆品以及具有优异的抗衰老作用的源自葡萄籽的抗衰老成分的制造方法。

背景技术

根据至今的关于防止衰老、寿命控制的研究，发现了预计具有抗衰老作用的化合物，例如白藜芦醇(反式-3，4'，5-三羟基二苯乙烯)。

例如，在非专利文献1中记载有，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，白藜芦醇通过刺激调节寿命的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的酶的Sir2，提高了酿酒酵母的稳定性，从而使酿酒酵母的寿命延长了70％的研究结果。

然而，另一方面，如非专利文献2中记载的，也报告有白藜芦醇不延长雄性和雌性小鼠的寿命，从而白藜芦醇不具有抗衰老作用的研究结果。

因此，虽然白藜芦醇预计具有抗衰老作用，但实际上尚未确定白藜芦醇是否具有抗衰老作用。

[现有技术文献]

[非专利文献]

非专利文献1：Konrad T.Howitz et al.，Nature 425，191-196(2003)非专利文献1：Richard A.Miller et al.，Journal of Gerontology：BIOLOGICAL SCIENCES 191-201(2010)

发明内容

本发明需要解决的问题

如上所述，对于预计具有抗衰老作用的白藜芦醇实际上是否具有抗衰老作用尚未确定。因此，需要一种更确定的具有抗衰老作用优于白藜芦醇的物质。

经深入研究，本发明人发现源自葡萄籽的多酚提取物具有优于白藜芦醇的抗衰老作用。

本发明的课题是，提供具有比白芦藜醇更为优异的抗衰老作用的源自葡萄籽的抗衰老成分及其制造方法，并且提供含有该抗衰老成分的抗衰老健康食品和抗衰老化妆品。

用于解决问题的方案

本发明权利要求1涉及抗衰老健康食品和化妆品，其特征在于含有经过粗提纯的源自葡萄籽的抗衰老成分，该成分包含60重量％以上的源自葡萄籽的多酚。

发明权利要求2涉及源自葡萄籽的抗衰老成分的制造方法，包括以下步骤：

步骤1、从欧洲葡萄(Vitis vinifera L.)、美洲葡萄(Vitis labrusca L.)、紫葛葡萄(Vitis coignetiae L.)、山葡萄(Vitis amurensis L.)以及白贺葡萄(Vitis shiragaiL.)中选择一种以上的葡萄籽进行预处理，并在35℃～60℃下干燥处于催芽状态的葡萄籽；

步骤2、将所述步骤1中干燥的葡萄籽粉末化；

步骤3、将所述步骤2中获得的葡萄籽粉末浸入水、乙醇、或者水和乙醇的混合溶剂中的一种以获得含有源自葡萄籽的多酚的提取物部分；

步骤4、将所述步骤3中得到的含有源自葡萄籽的多酚的提取物部分干燥并粉末化。

本发明权利要求3涉及权利要求1中记载的抗衰老健康食品和化妆品或者权利要求2中记载的源自葡萄籽的抗衰老成分的制造方法，其特征在于，所述葡萄籽选自阿吉提克(Agiorgitiko)、维欧尼(Viognier)、赤霞珠(Cabernet Sauvignon)、品丽珠(CabernetFranc)、佳美(Gamay)、佳利酿(Carignan)、佳美娜(Carmenere)、黑喜诺(Xinomavro)、歌海娜(Grenache)、琼瑶浆(Gewurztraminer)、肯纳(Kerner)、鸽笼白(Colombard)、甲州、苏丹娜(Sultana)、桑娇维塞(Sangiovese)、霞多丽(Chardonnay)、白诗南(Chenin Blanc)、西拉(Syrah)、仙粉黛(Zinfandel)、赛美蓉(Semillon)、长相思(Sauvignon Blanc)、丹娜(Tannat)、茨威格(Zweigelt)、丹魄(Tempranillo)、特雷比奥罗(Trebbiano)、内比奥罗(Nebbiolo)、黑珍珠(Nero D’Avola)、巴贝拉(Barbera)、皮诺塔吉(Pinotage)、黑皮诺(Pinot Noir)、灰皮诺(Pinot Gris)、白皮诺(Pinot Blanc)、味而多(Petit Verdot)、黑皇后(Black Queen)、贝利A麝香(Muscat Bailey A)、马尔贝克(Malbec)、米勒-图高(Muller-Thurgau)、慕合怀特(Mourvedre)、莫尼耶(Meunier)、勃艮第香瓜(Melon de Bourgogne)、梅洛(Merlot)、莫斯卡托(Moscato)、山赤霞珠、雷司令(Riesling)以及宝石卡本内(RubyCabernet)中的一种以上的酿酒用葡萄品种的种子。

发明效果

根据权利要求1的发明，由于抗衰老健康食品和化妆品含有经过粗提纯的源自葡萄籽的抗衰老成分，该成分包括60重量％以上的源自葡萄籽的多酚，因此具有优异的抗衰老效果，该抗衰老成分可以用于抗衰老健康食品和化妆品。

根据权利要求2的发明，源自葡萄籽的抗衰老成分的制造方法包括：步骤1、从欧洲葡萄(Vitis vinifera L.)、美洲葡萄(Vitis labrusca L.)、紫葛葡萄(Vitis coignetiaeL.)、山葡萄(Vitis amurensis L.)以及白贺葡萄(Vitis shiragai L.)中选择一种以上的葡萄籽进行预处理，将处于催芽状态的葡萄籽在35℃～60℃下干燥；步骤2、将所述步骤1中干燥的葡萄籽粉末化；步骤3、将所述步骤2中获得的葡萄籽粉末浸入水、乙醇、或者水和乙醇的混合溶剂中的一种以获得含有源自葡萄籽的多酚的提取物部分；以及步骤4、将所述步骤3中得到的含有源自葡萄籽的多酚的提取物部分干燥并粉末化。由此可以制造具有优异抗衰老作用的源自葡萄籽的抗衰老成分。

根据权利要求3的发明，权利要求1中记载的抗衰老健康食品和化妆品或者权利要求2中记载的源自葡萄籽的抗衰老成分的制造方法中使用的葡萄籽选自阿吉提克(Agiorgitiko)、维欧尼(Viognier)、赤霞珠(Cabernet Sauvignon)、品丽珠(CabernetFranc)、佳美(Gamay)、佳利酿(Carignan)、佳美娜(Carmenere)、黑喜诺(Xinomavro)、歌海娜(Grenache)、琼瑶浆(Gewurztraminer)、肯纳(Kerner)、鸽笼白(Colombard)、甲州、苏丹娜(Sultana)、桑娇维塞(Sangiovese)、霞多丽(Chardonnay)、白诗南(Chenin Blanc)、西拉(Syrah)、仙粉黛(Zinfandel)、赛美蓉(Semillon)、长相思(Sauvignon Blanc)、丹娜(Tannat)、茨威格(Zweigelt)、丹魄(Tempranillo)、特雷比奥罗(Trebbiano)、内比奥罗(Nebbiolo)、黑珍珠(Nero D’Avola)、巴贝拉(Barbera)、皮诺塔吉(Pinotage)、黑皮诺(Pinot Noir)、灰皮诺(Pinot Gris)、白皮诺(Pinot Blanc)、味而多(Petit Verdot)、黑皇后(Black Queen)、贝利A麝香(Muscat Bailey A)、马尔贝克(Malbec)、米勒-图高(Muller-Thurgau)、慕合怀特(Mourvedre)、莫尼耶(Meunier)、勃艮第香瓜(Melon de Bourgogne)、梅洛(Merlot)、莫斯卡托(Moscato)、山赤霞珠、雷司令(Riesling)以及宝石卡本内(RubyCabernet)中一种以上的酿酒用葡萄品种的种子，因此可以提供具有更加优异的抗衰老作用的抗衰老健康食品和化妆品，或者可以制造具有更加优异的抗衰老作用的源自葡萄籽的抗衰老成分。

附图说明

图1示出在实施例1～3、比较例1、对照组中计算出的衰老细胞的量的图。(a)是培养7天的细胞中衰老细胞的量，(b)是培养14天的细胞中衰老细胞的量，(c)是培养21天的细胞中衰老细胞的量。此外，将在对照组中算出的衰老细胞的量作为100％，实施例1～3以及比较例1中衰老细胞的量是以相对于对照组中的衰老细胞的量的比率来表示；

图2示出在实施例1～3、比较例1、对照组中测定的线粒体的量的图。(a)是培养7天的细胞中的线粒体的量，(b)是培养14天的细胞中的线粒体的量，(c)是培养21天的细胞中的线粒体的量。此外，将在对照组中算出的线粒体的量作为100％，实施例1～3以及比较例1的线粒体的量是以相对于对照组中的线粒体的量的比率来表示；

图3示出了在实施例1～3、比较例1、对照组中测定的由一定量的线粒体所负担的工作量的图。(a)是培养7天的细胞中的由一定量的线粒体所负担的工作量，(b)是培养14天的细胞中的由一定量的线粒体所负担的工作量，(c)是培养21天的细胞中的由一定量的线粒体所负担的工作量。此外，将在对照组中算出的由一定量的线粒体所负担的工作量作为100％，实施例1～3以及比较例1的由一定量的线粒体所负担的工作量是以相对于对照组中的由一定量的线粒体所负担的工作量的比率来表示；

图4示出在实施例1～3、比较例1、对照组中测定的凋亡细胞的量的图。(a)是培养7天的细胞中的凋亡细胞的量，(b)培养14天的细胞中的凋亡细胞的量，(c)是培养21天的细胞中的凋亡细胞的量。此外，将在对照组中算出的凋亡细胞的量作为100％，实施例1～3以及比较例1的凋亡细胞的量是以相对于对照组中的凋亡细胞的量的比率来表示；

图5示出了在实施例1～3、比较例1、对照组中测定的坏死细胞的量的图。(a)是培养7天的细胞中的坏死细胞的量，(b)是培养14天的细胞中的坏死细胞的量，(c)是培养21天的细胞中的坏死细胞的量。此外，将在对照组中算出的坏死细胞的量作为100％，实施例1～3以及比较例1的坏死细胞的量是以相对于对照组中的坏死细胞的量的比率来表示。

具体实施方式

以下，对本发明的抗衰老健康食品和化妆品以及源自葡萄籽的抗衰老成分的制造方法加以说明。

此外，在本说明书中，“衰老”是指细胞倍增能力降低的状态或细胞在G1期中成为不可逆地增殖停止的状态。这些状态涉及抑制促进细胞周期进程的基因，抑制细胞周期的p16^INK4a和p53的表达以及作为其靶标的转录因子p21^CIP1的表达。此外，衰老细胞对促分裂原诱导的细胞增殖具有抗性，导致衰老细胞的巨大化和扁平化。衰老细胞以例如衰老关联酸性β-半乳糖苷酶(SAβGal；sensence associatedβ-galactosidase)的活性作为生化标志物来表征细胞中的衰老现象，并且已证实可以用以表征生物体内的类似现象。

本发明的抗衰老健康食品和化妆品，含有经过粗提纯的源自葡萄籽的抗衰老成分，该成分包含60重量％以上的源自葡萄籽的多酚。

本发明的抗衰老健康食品和化妆品中含有的包含源自葡萄籽的多酚成分的抗衰老成分，是通过以下的制造方法获得的。

<步骤1>

步骤1是对葡萄籽进行预处理，并干燥处于催芽状态的葡萄籽的步骤。

本发明对使用的葡萄籽所属的葡萄种类没有特别限制，例如，可从欧洲葡萄(Vitis vinifera L.)、美洲葡萄(Vitis labrusca L.)、紫葛葡萄(Vitis coignetiaeL.)、山葡萄(Vitis amurensis L.)以及白贺葡萄(Vitis shiragai L.)中选择一种以上的葡萄。

在其中，优选阿吉提克(Agiorgitiko)、维欧尼(Viognier)、赤霞珠(CabernetSauvignon)、品丽珠(Cabernet Franc)、佳美(Gamay)、佳利酿(Carignan)、佳美娜(Carmenere)、黑喜诺(Xinomavro)、歌海娜(Grenache)、琼瑶浆(Gewurztraminer)、肯纳(Kerner)、鸽笼白(Colombard)、甲州、苏丹娜(Sultana)、桑娇维塞(Sangiovese)、霞多丽(Chardonnay)、白诗南(Chenin Blanc)、西拉(Syrah)、仙粉黛(Zinfandel)、赛美蓉(Semillon)、长相思(Sauvignon Blanc)、丹娜(Tannat)、茨威格(Zweigelt)、丹魄(Tempranillo)、特雷比奥罗(Trebbiano)、内比奥罗(Nebbiolo)、黑珍珠(Nero D’Avola)、巴贝拉(Barbera)、皮诺塔吉(Pinotage)、黑皮诺(Pinot Noir)、灰皮诺(Pinot Gris)、白皮诺(Pinot Blanc)、味而多(Petit Verdot)、黑皇后(Black Queen)、贝利A麝香(MuscatBailey A)、马尔贝克(Malbec)、米勒-图高(Muller-Thurgau)、慕合怀特(Mourvedre)、莫尼耶(Meunier)、勃艮第香瓜(Melon de Bourgogne)、梅洛(Merlot)、莫斯卡托(Moscato)、山赤霞珠、雷司令(Riesling)以及宝石卡本内(Ruby Cabernet)等的酿酒用的葡萄品种，尤其优选赤霞珠、梅洛、西拉、黑皮诺。

在本说明书中，“催芽”是指葡萄籽进入开始发芽的状态。更具体地，指的是葡萄籽的胚芽部分稍微隆起并膨胀的状态。

该隆起的程度没有特别限制，例如，是比催芽前的葡萄籽胚芽部分的表面隆起1mm～2mm的状态。

此外，在本发明中，不建议选择处于已发芽状态的葡萄籽作为原料，因为处于已发芽状态的葡萄籽与待催芽状态的葡萄籽相比，抗衰老作用较低。

在本发明中，对葡萄籽进行预处理以使葡萄籽进入催芽状态的方法并没有特别限制，可以选择诸如低温处理、热浴处理、机械破坏等的物理方法，气体(乙炔，乙醚，氢气等)处理、生长素处理、赤霉素处理等的化学方法，也可以使用任何其他的常规用于使植物种子进入催芽状态的方法。

如上所述，在本发明中，对用于使葡萄籽进入催芽状态的预处理方法没有特别限制，例如，可以通过以下更具体的预处理方法使葡萄籽进入催芽状态。

首先，将葡萄籽浸入30～60℃的水中。

浸泡时间没有限制，但优选为20～80小时。

然后，将浸泡在30～60℃的水中的葡萄籽捞起并在空气中自然干燥。

自然干燥的温度没有限制，但优选为10～50℃。

自然干燥的时间没有限制，但优选为1～10小时。

接下来，将在空气中自然干燥的葡萄籽浸入15～45℃的水中。

浸泡时间没有限制，但优选为10～200分钟。

然后，将浸泡在15～45℃的水中的葡萄籽捞起并在空气中自然干燥。

自然干燥的温度没有限制，但优选为10～50℃。

自然干燥的时间没有限制，但优选为3～12小时。

重复将葡萄籽浸入15～45℃的水中的步骤和在空气中使其自然干燥的步骤，使葡萄籽保持间歇式含水的状态，直到葡萄籽的胚芽部分在自然干燥后稍微隆起并膨胀为止。

待葡萄籽处于自然干燥且葡萄籽的胚芽部分稍微隆起并膨胀的状态，将葡萄籽置于足以杀伤各种细菌程度的温度(80℃以下)下2～5天，使葡萄籽进一步干燥。

此外，可以根据季节、环境温度和湿度适当地改变该干燥时间。

经过该催芽刺激处理后，葡萄籽内的酚类分子会从薄酚层剥落并聚合生成多种多酚。

白藜芦醇就是其中的一种多酚，其分子量约250左右，但该新生成的成分的特征是聚合物结构大，分子量可以达到4000。

<步骤2>

步骤2是将步骤1中干燥的处于催芽状态的葡萄籽粉末化的步骤。

粉末化方法没有限制，可以使用常规方法，例如用研磨机等进行粉末化。

<步骤3>

步骤3是用溶剂提取粉末化的葡萄籽的步骤。

通过该步骤3，得到源自葡萄籽的多酚构成的葡萄籽抗衰老成分。

作为溶剂，可以使用水、乙醇或水和乙醇的混合溶剂。

可以通过向100重量份的葡萄籽粉末中添加50～1000重量份的溶剂来进行提取。

如上所述，该源自葡萄籽的多酚构成的葡萄籽抗衰老成分含有分子量约为4000(3500～4500)的聚合物成分。

<步骤4>

接下来，将步骤3中得到的源自葡萄籽的多酚构成的葡萄籽抗衰老成分干燥，然后粉末化。

干燥方法并没有限制，优选使用减压干燥。

粉末化方法没有限制，可以使用常规方法，如用研磨机进行粉末化。

通过以上的步骤，可以得到源自葡萄籽的多酚构成的葡萄籽抗衰老成分的粉末。

通过上述方法获得的源自葡萄籽的抗衰老成分经粗提纯，含有50重量％～80重量％的多酚。

为了达到优异的抗衰老效果，源自葡萄籽的抗衰老成分优选经过粗提纯的含有60重量％以上的多酚。

源自葡萄籽的抗衰老成分中含有的多酚是各品种的葡萄籽中含有的多酚，例如白藜芦醇、丹宁等。

源自葡萄籽的抗衰老成分中所含有的多酚内，原花青素聚合物占50重量％～80重量％。

本发明人确认含有上述成分的源自葡萄籽的抗衰老成分具有抗衰老作用。

此外，在本说明书中，粗提纯是指仅经提取、干燥、粉末化而含有杂质，并且没有进行浓缩等加工的状态。通过上述的步骤1～4得到的源自葡萄籽的抗衰老成分是粗提纯物。

通过在健康食品中加入源自葡萄籽的抗衰老成分，可以得到本发明的抗衰老健康食品。

通过在健康食品中加入源自葡萄籽的抗衰老成分，可以容易地日常摄取源自葡萄籽的抗衰老成分。

本发明的抗衰老健康食品可以与常用的食品原料使用的添加剂，例如，葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甜菊糖苷、甜茶苷、玉米糖浆、乳糖、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、L-抗坏血酸、dl-α-生育酚、异抗坏血酸钠、甘油、丙二醇、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯阿拉伯树胶、卡拉胶、酪蛋白、明胶、果胶、琼脂、维生素B、烟酰胺、泛酸钙、氨基酸、钙盐、色素、香料、防腐剂等适当配合并按常规方法制备。

通过在化妆品中加入源自葡萄籽的抗衰老成分，可以得到本发明的化妆品。

通过在化妆品中加入源自葡萄籽的抗衰老成分，可以日常使用源自葡萄籽的抗衰老成分。

此外，本发明的抗衰老化妆品中所含的源自葡萄籽的抗衰老成分的形态没有特别限制，为了更容易渗透入皮肤，优选为多层的微胶囊状。

本发明的抗衰老化妆品可以与美白剂、活性氧去除剂、抗氧化剂、紫外线防止剂等常用添加剂适当配合并按常规方法制备。

虽然本发明的抗衰老健康食品和抗衰老化妆品中的源自葡萄籽的抗衰老成分的摄取量并没有限定，但是为了达到优异的抗衰老作用，优选每日的摄取量至少为50mg以上。

若本发明的抗衰老健康食品和抗衰老化妆品中的源自葡萄籽的抗衰老成分的每日摄取量小于50mg，则抗衰老作用可能无法充分发挥，因此并不可取。

此外，本发明的抗衰老健康食品和抗衰老化妆品中的源自葡萄籽的抗衰老成分即使每日摄取超过7500mg(体重60千克)，效果的增益也很小。

因此，本发明的抗衰老健康食品和抗衰老化妆品中的源自葡萄籽的抗衰老成分优选每日摄取50mg～7500mg。

此外，本发明的抗衰老健康食品和抗衰老化妆品可以根据预期用途适当地与赋形剂，pH调节剂，防腐剂，螯合剂，稳定剂等配合。

此外，虽然本发明的抗衰老健康食品和抗衰老化妆品中含有的源自葡萄籽的抗衰老成分的每公斤体重对应的摄取量并没有限定，但是为了达到优异的抗衰老作用，例如，理想摄入量为0.8～125mg/kg/日。

若本发明的抗衰老健康食品和抗衰老化妆品中的源自葡萄籽的抗衰老成分的每公斤体重对应的摄取量小于0.8mg/kg/日，则抗衰老作用可能无法充分发挥，因此并不可取。

此外，本发明的抗衰老健康食品和抗衰老化妆品中的源自葡萄籽的抗衰老成分即使摄取超过125mg/kg/日，效果也没有变化。

由此，本发明的抗衰老健康食品和抗衰老化妆品中的源自葡萄籽的抗衰老成分的优选摄取量为0.8～125mg/kg/日。

[实施例]

现基于以下的实施例对本发明的抗衰老健康食品和化妆品并源自葡萄籽的抗衰老成分作进一步的说明，但是本发明的抗衰老健康食品和化妆品并源自葡萄籽的抗衰老成分的制造方法并不限于实施例。

<实施例1：源自葡萄籽的抗衰老成分的制造>

将赤霞珠葡萄籽在约40℃的水中浸泡45-60小时，然后将该葡萄籽捞起并在室温(约25℃)下在空气中自然干燥(室内储存)3～5小时。

将自然干燥的葡萄籽浸入25～30℃的水中60～80分钟，然后将该葡萄籽捞起并在室温(约25℃)下在空气中自然干燥(室内储存)3小时。

将葡萄籽在30℃的水中浸渍并自然干燥3小时，重复三次，观察干燥的葡萄籽，确认约5～15％的葡萄籽的胚芽部分隆起约1mm。此外，上述过程称为催芽处理。

当确认葡萄籽的胚芽部分隆起时结束催芽处理，并且用远红外干燥器在45℃下将葡萄籽进一步干燥3天。

将葡萄籽干燥3天后，用研磨机粉末化葡萄籽，得到葡萄籽粉。

接下来，将50重量份葡萄籽粉末添加到100重量份水中，并且提取溶解在水中的部分以获得源自葡萄籽的抗衰老成分。

将得到的源自葡萄籽的抗衰老成分减压干燥后，用研磨机粉碎，得到粉末化的源自葡萄籽的抗衰老成分。

测定粉末化的源自葡萄籽的抗衰老成分中所含的多酚总量。

多酚的总量采用AOAC国际的官方方法(AOAC官方方法952.03，第15版)(也称为福林·丹尼斯(Folin·Denis)法)进行测定。

在福林·丹尼斯法中，通过用分光光度计测定在碱性中酚类的羟基将磷钨酸和钼酸还原并生成的蓝色(波长为700～770nm)来定量多酚的总量。

定量分析表明，源自葡萄籽的抗衰老成分含有69重量％的多酚。

此外，可以确认源自葡萄籽的抗衰老成分中所含的多酚内，71重量％(即源自葡萄籽的抗衰老成分的49重量％)是原花青素聚合物。

以下，将本实施例中制备的源自葡萄籽的抗衰老成分称为实施例，将作为比较对象的白藜芦醇(SIGMA公司制，产品编号：R5010)称为比较例。

以下，在实施例3～5中，对本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分的抗衰老作用进行了研究。

<实施例2：正常人成纤维细胞、实施例和比较例的制备>

·正常人成纤维细胞的制备

首先，制备用于各项试验的正常人成纤维细胞。

使正常人成纤维细胞(由仓敷纺织株式会社制造，产品编号：KF-4109)进入睡眠状态后，放入基本培养基(DMEM(由Nacalai Tesque公司制造，产品编号：08456-65)，10％FBS(由BioWest公司制造，产品编号：S1820，批号No.516536)，1％抗生素(青霉素-链霉素混合溶液(由Nacalai Tesque公司制造，产品编号：26253-84)))中，在CO₂培养器(5％CO₂，37℃)中培养至达到必要的细胞数量。

培养后，使用胰蛋白酶/EDTA(2.5克/1-胰蛋白酶/1mmol/l-EDTA溶液(由NacalaiTesque公司制造，产品编号：32777-44))剥离正常人成纤维细胞，并计量细胞数后，将细胞用于后续各项测试。

·实施例以及比较例的制备

接下来，制备实施例和比较例。

将实施例和对比例分别称重，并溶解在基本培养基中，使其浓度为1％(w/v)。

溶解后，为了除去不溶物，将溶解在基本培养基中的实施例以及比较例分别进行离心分离(120，000rpm(2，000s^-1)，10分钟)。

离心后，回收上清液，并使用灭菌过滤器过滤灭菌，用于各项试验。

<实施例3：抗衰老效果确认试验>

通过测量广泛用作细胞衰老标记物的β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase；SA-β-gal)活性，证实了实施例以及比较例的抗衰老作用。

SA-β-gal在衰老细胞中过量表达已经证实，并且通过该衰老标记物测定细胞的衰老现象不仅适用于培养细胞，也已被确认可用于生物体内的测量。

通过抗衰老效果确认试验确认衰老细胞的量并以此作为抗衰老作用的综合指标，能最具体地表征抗衰老的效果。

(试验程序)

将在基本培养基中制备的正常人成纤维细胞以1×10⁴个细胞/0.1ml/孔的方式置于96孔板(用于荧光观察的黑色板(由住友电木公司制造，产品编号号：MS-8096F))中，接种并培养24小时。

培养后，用以下不同条件下的培养基替换原培养上清液，再次培养正常人成纤维细胞。

各培养基的条件如下，将在各条件下培养的细胞分别称为实施例1～3、比较例1以及对照组。

实施例1：含有0.002重量％的本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分的基本培养基；

实施例2：含有0.01重量％的本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分的基本培养基；

实施例3：含有0.05重量％的本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分的基本培养基；

比较例1：含有0.0023重量％的白藜芦醇的基本培养基；

对照组：基本培养基(不包括本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分和白藜芦醇)

此后，在实施例4～5中，也使用上述实施例1～3，对比例1以及对照组。

此外，将比较例1中的白藜芦醇浓度设为0.0023重量％的原因是，当白藜芦醇浓度大于0.0023重量％时，在后述的坏死测定试验中，坏死细胞的数量会过多增加，难以精确测量。

在上述各条件下培养正常人成纤维细胞最多至21天。

培养基每2～3天更换一次。

培养完成后，除去培养上清液，用PBS(由日水制药株式会社制造，产品编号：05913)洗涤细胞两次。

向洗涤后的正常人成纤维细胞中加入含有稀释1000倍的巴弗洛霉素A1的基本培养基，并将正常人成纤维细胞在37℃下培养60分钟。

培养后，将含有1000倍稀释的SPiDER-βGal工作溶液以及100倍稀释的核染色试剂Hoechst 33342溶液(由同仁化学研究所公司制造，产品编号：346-07951)的基本培养基加入培养有正常人成纤维细胞的培养基中，在37℃下进一步培养30分钟。

培养后，用基本培养基洗涤正常人成纤维细胞。

洗涤后，将基本培养基加入到正常人成纤维细胞中，并在荧光显微镜(由基恩士公司制造，产品名称：BZ-X7000)下拍摄核染色(活细胞)和衰老细胞的图像。

从各荧光观察图像计算出衰老细胞的量。

此外，使用的上述巴弗洛霉素A1和SPiDER-βGal工作溶液均来源于细胞传感检测试剂盒-SPiDER-βGal(由同仁化学研究所公司制造，产品号：SG03)。

(结果)

图1是示出实施例1～3、比较例1、对照组中计算出的衰老细胞的量的图。

图1的(a)示出了培养7天的细胞中的衰老细胞的量，图1的(b)示出了培养14天的细胞中的衰老细胞的量，图1的(c)示出了是培养21天的细胞中的衰老细胞的量。

此外，在图1中将在对照组中的衰老细胞的量作为100％，示出了实施例1～3以及比较例1的衰老细胞的量相对于对照组中的衰老细胞的量的比例。

在培养7天的比较例1中，与对照组相比，衰老细胞的量为519％(参照图1的(a))。

另一方面，与对照组相比，培养7天的实施例1的衰老细胞的量为85％，实施例2的衰老细胞的量为137％，实施例3的衰老细胞的量为73％(参照图1的(a))。

在培养14天的比较例1中，与对照组相比，衰老细胞的量为102％(参照图1的(b))。

另一方面，与对照组相比，培养14天的实施例1的衰老细胞的量为11％，实施例2的衰老细胞的量为9％，实施例3的衰老细胞的量为7％(参照图1的(b))。

在培养21天的比较例1中，与对照组相比，衰老细胞的量为64％(参照图1的(c))。

另一方面，与对照组相比，培养21天的实施例1的衰老细胞的量为4％，实施例2的衰老细胞的量为3％，实施例3的衰老细胞的量为2％(参照图1的(c))。

根据这些结果，发现白藜芦醇在培养的第7天比对照组细胞中的衰老细胞的量增加了，并促进了细胞的衰老。因此，白藜芦醇短期内可能具有促进衰老的作用。

此外，在培养第21天的细胞中，与对照组相比，衰老细胞的量被抑制至约64％，细胞的衰老受到抑制。

另一方面，本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分在培养7天的细胞中显示出平均与对照组同样程度的衰老细胞的量，但是在培养21天的细胞中与对照组比较，衰老细胞的量被抑制到大约2％～4％，并且远较白藜芦醇更强烈地抑制细胞的衰老。

因此，与白藜芦醇相比，本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分具有更优异的抗衰老作用，同样的，含有本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分的抗衰老健康食品和化妆品也具有优异的抗衰老作用。

<实施例4：线粒体的量和由一定量的线粒体所负担的工作量的测定试验>

上述抗衰老效果确认试验之后，证实了实施例以及比较例对于细胞内线粒体的量以及由一定量的线粒体所负担的工作量的影响。

通常，白藜芦醇被认为通过作用于线粒体的量和由一定量的线粒体所负担的工作量来发挥其抗衰老作用，因此证实了本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分对于线粒体的量和由一定量的线粒体所负担的工作量的影响。

线粒体的量使用能在细胞中选择性地标记线粒体的MitoTracker线粒体选择探针(Invitrogen公司制造，产品编号：M7512)来测定。

使用MTT测试法来测量由一定量的线粒体所负担的工作量。由于MTT测试的对象仅是线粒体的脱氢酶活性，因此MTT测试的结果反映了由一定量的线粒体所负担的工作量。

(试验程序)

除去实施例2中培养的正常人成纤维细胞的培养上清液后，用PBS(由日水制药株式会社制造，产品编号：05913)洗涤正常人成纤维细胞两次。

向洗涤后的细胞添加含有稀释1000倍的Hoechist 33342溶液(由同仁化学研究所公司制造，产品编号：346-07951)以及稀释2000倍的MitoTracker线粒体选择探针(Invitrogen公司制造，产品编号：M7512)的基本培养基，在37℃下培养正常人成纤维细胞30分钟。

培养后，除去培养上清液，用PBS(由日水制药株式会社制造，产品编号：05913)洗涤正常人成纤维细胞两次。

洗涤后，将新的PBS(由日水制药株式会社制造，产品编号：05913)加入到正常人成纤维细胞中，并在荧光显微镜(由基恩士公司制造，产品名称：BZ-X7000)下进行核染色(活细胞)，并拍摄线粒体的染色图像。

拍摄后，在荧光酶标仪(由赛默飞世尔科技公司制造，产品名：VARIOSKAN FLASH)测量每种荧光强度(Hoechis：激发波长356nm，荧光波长465nm，MitoTracker：激发波长579nm，荧光波长599nm)。

测量荧光强度后，除去培养上清液，用PBS(由日水制药株式会社制造，产品编号：05913)洗涤正常人成纤维细胞一次。

在洗涤正常人成纤维细胞后，用含有0.5mg/ml的MTT(溴化噻唑蓝四氮唑(SIGMA公司制造，产品编号：M5655-1G))的PBS替换(100μl/孔)，并在37℃下反应5小时。

反应后，向每个孔中加入100μl的0.01M的HCl(SIGMA公司制，产品编号：13-1690)10％SDS(和光纯药工业公司制，产品编号：191-07145)，在室温下反应24小时。

反应后，MTT的福尔马肼被溶解。

福尔马肼被溶解后，用酶标仪(由赛默飞世尔科技公司制造，产品名：VARIOSKANFLASH)测量吸光度(测量波长：550nm，参照波长660nm)。

(结果)

图2是示出实施例1～3、比较例1、对照组中测定的线粒体的量的图。

图2的(a)示出了培养7天的细胞中的线粒体的量，图2的(b)示出了培养14天的细胞中的线粒体的量，图2的(c)示出了培养21天的细胞中的线粒体的量。

此外，在图2中，将在对照组中的线粒体的量作为100％，实施例1～3以及比较例中的线粒体的量表示为相对于对照组中的线粒体的量的比率。

在培养7天的比较例1中，与对照组相比，线粒体的量为191％(参照图2的(a))。

另一方面，与对照组相比，培养7天的实施例1的线粒体的量为116％，实施例2的线粒体的量为126％，实施例3的线粒体的量为143％(参照图2的(a))。

在培养14天的比较例1中，与对照组相比，线粒体的量为228％(参照图2的(b))。

另一方面，与对照组相比，培养14天的实施例1的线粒体的量为123％，实施例2的线粒体的量为128％，实施例3的线粒体的量为172％(参照图2的(b))。

在培养21天的比较例1中，与对照组相比，线粒体的量为246％(参照图2的(c))。

另一方面，与对照组相比，培养21天的实施例1的线粒体的量为115％，实施例2的线粒体的量为124％，实施例3的线粒体的量为178％(参照图2的(c))。

根据这些结果发现，白藜芦醇具有增加线粒体的量的作用。

另外还发现，本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分也具有增加线粒体的量的作用。

图3是表示实施例1～3、比较例1、对照组中测定的由一定量的线粒体所负担的工作量的图。

图3的(a)示出了培养7天的细胞中的由一定量的线粒体所负担的工作量，图3的(b)示出了培养14天的细胞中的由一定量的线粒体所负担的工作量，图3的(c)示出了培养21天的细胞中的由一定量的线粒体所负担的工作量。

此外，在图3中，将在对照组中的由一定量的线粒体所负担的工作量作为100％，实施例1～3以及比较例1的由一定量的线粒体所负担的工作量表示为相对于对照组中的由一定量的线粒体所负担的工作量的比率。

在培养7天的比较例1中，与对照组相比，由一定量的线粒体所负担的工作量为22％(参照图3的(a))。

另一方面，与对照组相比，培养7天的实施例1的由一定量的线粒体所负担的工作量为74％，实施例2的由一定量的线粒体所负担的工作量为58％，实施例3的由一定量的线粒体所负担的工作量为38％(参照图3的(a))。

在培养14天的比较例1中，与对照组相比，由一定量的线粒体所负担的工作量为20％(参照图3的(b))。

另一方面，与对照组相比，培养14天的实施例1的由一定量的线粒体所负担的工作量为77％，实施例2的由一定量的线粒体所负担的工作量为63％，实施例3的由一定量的线粒体所负担的工作量为34％(参照图3的(b))。

在培养21天的比较例1中，与对照组相比，由一定量的线粒体所负担的工作量为49％(参照图3的(c))。

另一方面，与对照组相比，培养21天的实施例1的由一定量的线粒体所负担的工作量为88％，实施例2的由一定量的线粒体所负担的工作量为76％，实施例3的由一定量的线粒体所负担的工作量为62％(参照图3的(c))。

根据这些结果发现，白藜芦醇具有减少由一定量的线粒体所负担的工作量的作用。

另外还发现，本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分也具有减少由一定量的线粒体所负担的工作量的作用。

根据实施例4的结果发现，本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分具有增加线粒体的量，并减少由一定量的线粒体所负担的工作量的作用。

通过增加线粒体的量，一定量的线粒体中应当产生的ATP的量(即工作量)减少。实施例4中证实的由一定量的线粒体所负担的工作量的减少，被认为是由于线粒体的量增加，从而每一定量的线粒体产生的ATP的量减少。

由此，增加了线粒体的处理能力，减少了由线粒体产生的活性氧的量，并且也增加了作为去除活性氧的酶即超氧化物歧化酶(SOD)的生成量，因此可以降低与线粒体以及细胞的破坏相关的活性氧的量。

由于约90％的活性氧是由线粒体产生的，因此本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分通过减少由线粒体产生的活性氧的量，从而防止对细胞以及由细胞构成的器官的损害，起到抗衰老的作用。

<实施例5：细胞凋亡和细胞坏死测定试验>

接下来，确认实施例和比较例对凋亡细胞的量以及坏死细胞的量的影响。

通常，白藜芦醇被认为是通过诱导细胞凋亡来发挥其抗衰老作用，因此证实了本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分对于凋亡细胞量的影响。

此外，还证实了本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分对于与凋亡细胞等同的坏死细胞的量的影响。

凋亡细胞的量使用通常作为细胞凋亡标记物的膜联蛋白V来测量。更具体地，通过利用荧光标记的膜联蛋白V结合经常出现在凋亡细胞的表面上的磷脂酰丝氨酸的性质，通过对凋亡细胞选择性地荧光染色从而测量凋亡细胞的量。

坏死细胞的量使用通常作为细胞坏死标记物的乙锭同型二聚体III(EthD-III)来测量。更具体地，EthD-III是膜不可渗透的核酸探针，活细胞和凋亡细胞不会被染色，但是坏死细胞会被染成鲜红色，据此来测量坏死细胞的量。

(实验程序)

除去实施例2中培养的正常人成纤维细胞的培养上清液后，用PBS(由日水制药株式会社制造，产品编号：05913)洗涤正常人成纤维细胞两次。

向洗涤后的正常人成纤维细胞添加含有稀释1000倍的Hoechist 33342溶液(由同仁化学研究所公司制造，产品编号：346-07951)、稀释20倍的FITC-膜联蛋白V、以及稀释20倍的EthD-III的1×结合缓冲液，并在37℃下培养正常人成纤维细胞30分钟。

培养后，除去培养上清液，将正常人成纤维细胞用1×结合缓冲液洗涤两次。

洗涤后，向正常人成纤维细胞中加入新的1×结合缓冲液，并在荧光显微镜下拍摄核染色细胞(活细胞)，膜联蛋白V染色细胞(凋亡细胞)和EthD-III染色细胞(坏死细胞)的图像。

从各拍摄的荧光观察图像计算出凋亡细胞的量以及坏死细胞的量。

此外，本实施例中使用的FITC-膜联蛋白V，EthD-III和1×结合缓冲液来源于凋亡/坏死/健康细胞检测试剂盒(宝生物公司制造，产品编号：D25517)。

(结果)

图4是示出在实施例1～3、比较例1、对照组中测量的凋亡细胞的量的图。

图4的(a)示出了培养7天的细胞中的凋亡细胞的量，图4的(b)示出了培养14天的细胞中的凋亡细胞的量，图4的(c)示出了培养21天的细胞中的凋亡细胞的量。

此外，在图4中，将在对照组中凋亡细胞的量作为100％，实施例1～3以及比较例的凋亡细胞的量表示为相对于对照组中的凋亡细胞的量的比率。

在培养7天的比较例1中，与对照组相比，凋亡细胞的量为2184％(参照图4的(a))。

另一方面，与对照组相比，培养7天的实施例1的凋亡细胞的量为164％，实施例2的凋亡细胞的量为102％，实施例3的凋亡细胞的量为483％(参照图4的(a))。

在培养14天的比较例1中，与对照组相比，凋亡细胞的量为1400％(参照图4的(b))。

另一方面，与对照组相比，培养14天的实施例1的凋亡细胞的量为107％，实施例2的凋亡细胞的量为313％，实施例3的凋亡细胞的量为226％(参照图4的(b))。

在培养21天的比较例1中，与对照组相比，凋亡细胞的量为4525％(参照图4的(c))。

另一方面，与对照组相比，培养21天的实施例1的凋亡细胞的量为59％，实施例2的凋亡细胞的量为558％，实施例3的凋亡细胞的量为668％(参照图4的(c))。

根据这些结果发现，白藜芦醇具有增加凋亡细胞量的作用。

另外还发现，本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分也具有增加凋亡细胞量的作用。

图5是示出实施例1～3、比较例1、对照组中测量的坏死细胞的量的图。

图5的(a)示出了培养7天的细胞中的坏死细胞的量，图5的(b)示出了培养14天的细胞中的坏死细胞的量，图5的(c)示出了培养21天的细胞中的坏死细胞的量。

此外，在图5中，将在对照组中的坏死细胞的量作为100％，实施例1～3以及比较例的坏死细胞的量表示为相对于对照组中的坏死细胞的量的比率。

在培养7天的比较例1中，与对照组相比，坏死细胞的量为125％(参照图5的(a))。

另一方面，与对照组相比，培养7天的实施例1的坏死细胞的量为47％，实施例2的坏死细胞的量为47％，实施例3的坏死细胞的量为100％(参照图5的(a))。

在培养14天的比较例1中，与对照组相比，坏死细胞的量为801％(参照图5的(b))。

另一方面，与对照组相比，培养14天的实施例1的坏死细胞的量为109％，实施例2的坏死细胞的量为108％，实施例3的坏死细胞的量为95％(参照图5的(b))。

在培养21天的比较例1中，与对照组相比，坏死细胞的量为608％(参照图5的(c))。

另一方面，与对照组相比，培养21天的实施例1的坏死细胞的量为55％，实施例2的坏死细胞的量为28％，实施例3的坏死细胞的量为24％(参照图5的(c))。

根据这些结果发现，的白藜芦醇具有在所有时期增加坏死细胞量的作用。

另一方面，发现本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分具有减少坏死细胞的量的作用。

根据实施例5的结果发现，本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分具有增加凋亡细胞的量，并减少坏死细胞的量的作用。

细胞凋亡是一种机制，它诱导生物体不需要的细胞或有害细胞死亡，并将它们消除，通过迅速消除因衰老而失去功能的细胞，从而产生新的细胞。凋亡以健康的方式起作用以消除衰老细胞，保持细胞处于健康的生长水平。由健康细胞组成的器官成为年轻的器官。此外，细胞凋亡还能去除攻击自身的免疫细胞，这是自身免疫疾病的机制，通过细胞凋亡的健康运作，也可以预期减少自身免疫疾病。

另一方面，细胞死亡(坏死)是细胞内的酶等并未事先处理的情况下使细胞破裂，从而包括酶等在内的细胞内含物被释放到细胞外，对周边组织产生诸如炎症反应等不良影响。这种不良影响会促进细胞的劣化，并成为随着年龄增长而增加的内部炎症的因素。由此，细胞坏死通过对周边组织造成诸如炎症反应等的不良影响而引起细胞的损伤。因此，细胞坏死会促进细胞的衰老。

因此，通过促进细胞凋亡并抑制细胞坏死，对于抑制细胞的衰老非常有效。

因此，可知具有促进细胞凋亡并抑制细胞坏死作用的本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分，具有优异的抗衰老作用。

另一方面，发现白藜芦醇不仅促进细胞凋亡也促进细胞坏死。如上所述，为了抑制细胞的衰老需要抑制细胞坏死。因此，与本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分相比，不仅促进细胞凋亡也促进细胞坏死的白藜芦醇被认为具有较低的抗衰老作用。

<实施例6：毒性试验>

为确认本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分的毒性，实施了使用雌性小鼠的急性口服毒性试验(极限试验)(基于OECD化学品试验指南420(2001))。

(试验方法)

将粉末化的本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分与注射用水混合制备成100mg/mL的试验液。

从日本SLC株式会社购买5周大的ICR雌性小鼠，预饲养约1周，确认其在一般状态没有异常后用于试验。

将用于试验的各五只雌性小鼠圈养在聚碳酸酯制笼中，并在设定为室温(23℃±2℃)和光照时间为12小时/天的饲养室中饲养。

使其自由摄取饲料(日本农业工业株式会社制，产品名称：实验室MR原料(小鼠、大鼠用固体饲料))以及饮用水(自来水)。

设定给予2000mg/kg的源自葡萄籽的抗衰老成分的试验组以及作为溶剂对照的给予注射用水的对照组，每组使用5只雌性小鼠。

用于试验的雌性小鼠在给药前禁食约4小时。

在测量各雌性小鼠的体重之后，以20mL/kg的投药容量对试验组给予试验液，对对照组给予注射用水，并且使用胃探测器强制单次经口给药。

给药后观察雌性小鼠14天。

在给药当天，频繁观察雌性小鼠，从给药后第二天开始每天观察一次。

在给药后第7天和第14天，测量雌性小鼠的体重，并通过t-检验以5％的显著性水平比较各组之间的体重。

在观察期结束后，对所有雌性小鼠进行解剖。

(结果)

任何投药组在观察期内都没有死亡。

任何投药组在观察期内都没有发现异常。

表1显示了试验组和对照组之间的体重变化的结果。

在给药后第7天和给药后第14天的体重测量中，发现试验组与对照组相比体重没有显著差异。

在观察期结束后的解剖中，所有雌性小鼠均没有发现异常。

[表1]

体重表示为平均值±标准偏差(单位：g)。

括号中显示了测量体重的雌性小鼠的数量。

由上述结果可知，在使用雌性小鼠的单次经口给药中，本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分的LD50值在雌性小鼠中超过2000mg/kg。

由实施例3～5的结果可知，本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分通过增加线粒体的量，减少由一定量的线粒体所负担的工作量，增加凋亡细胞的量，减少坏死细胞的量，从而具有优异的抗衰老作用。

此外，与预计具有抗衰老作用的白藜芦醇比较后发现，本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分具有远比单独使用的白藜芦醇优异的抗衰老作用。

此外，实施例6的结果还表明，本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分具有低细胞毒性和优异的安全性。

因此，含有本发明的源自葡萄籽的抗衰老成分的健康食品和化妆品具有优异的抗衰老作用和优异的安全性。

工业实用性

由于本发明的抗衰老健康食品和化妆品含有经粗提纯的源自葡萄籽的抗衰老成分，该成分包含60重量％以上的源自葡萄籽的多酚，因此具有优异的抗衰老作用。因此，本发明适合用于具有抗衰老的健康食品和化妆品。