阅读说明：本技术 豌豆蛋白水解产物 (Pea protein hydrolysate ) 是由 索尼亚·韩 帕姆·伊斯梅尔 佩奇·苔丝 拉谢尔·米塔克 于 2018-11-02 设计创作，主要内容包括：一种制备豌豆蛋白水解产物的组合物和方法,所述方法包括获得豌豆蛋白组合物,向所述豌豆蛋白组合物加入真菌蛋白酶,并将所述豌豆蛋白组合物水解至约4％或更高的水解度以获得豌豆蛋白水解产物。在一个实例中,在约5至约7.5的pH和约30℃至约60℃的温度下,所述水解度可在约4％至约25％的范围内。所得的豌豆蛋白水解产物在pH 3.4时的溶解度为至少30％,在pH 3.4时的粘度为至少65cPs,在约中性pH时的分散度为至少115秒,以及在pH 3.4时的悬浮性为至少1.5TSI Global。(A composition and method of making a pea protein hydrolysate, the method comprising obtaining a pea protein composition, adding a fungal protease to the pea protein composition, and hydrolyzing the pea protein composition to a degree of hydrolysis of about 4% or more to obtain a pea protein hydrolysate. In one example, the degree of hydrolysis may be in the range of about 4% to about 25% at a pH of about 5 to about 7.5 and a temperature of about 30 ℃ to about 60 ℃. The resulting pea protein hydrolysate has a solubility of at least 30% at pH 3.4, a viscosity of at least 65cPs at pH 3.4, a dispersity of at least 115 seconds at about neutral pH, and a suspensibility of at least 1.5TSI Global at pH 3.4.)

豌豆蛋白水解产物

技术领域

本专利申请涉及用于食品中的豌豆蛋白领域。更具体地，本申请涉及具有高溶解度的豌豆蛋白水解产物、其制备方法以及含有其的饮料。

背景技术

豌豆是富含淀粉、蛋白质和粗纤维的优质营养食品。豌豆蛋白是一种富含赖氨酸的营养均衡的植物蛋白，还包含人体所需的多种必需氨基酸。豌豆蛋白适用于保健产品，也可用作食品或饮料的添加剂。对于一些消费者而言，豌豆蛋白可能是有吸引力的蛋白质来源，尤其是对于素食主义者，包括绝对素食者。

尽管人们对用于保健产品、食品和饮料的豌豆蛋白的兴趣日益浓厚，但是豌豆蛋白产品在豌豆蛋白的溶解度和风味方面仍面临挑战。因此，豌豆蛋白的市场接受度(尤其是在食品和饮料中)仍然相对较低。

发明内容

本发明的发明人尤其认识到了对于在多种饮料应用中的使用，豌豆蛋白水解产物有改善溶解度以及具有良好的口味和质地的机会。

根据本申请的实例可包括一种制备豌豆蛋白水解产物的方法。所述方法可包括获得豌豆蛋白组合物(即原料)，以按重量比真菌酶与豌豆蛋白约0.5:100至约1.5:100的比率向豌豆蛋白组合物中加入酶，优选为真菌酶，更优选为源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的真菌酶，并在约5至约7.5的pH和约30℃至约60℃的温度下将豌豆蛋白组合物水解至约4％至约25％的水解度，以获得豌豆蛋白水解产物。所得的豌豆蛋白水解产物可在约pH 3.4或7时具有至少50％的溶解度。所述豌豆蛋白组合物(经过水解的原料)可以是豌豆蛋白浓缩物或分离物。

在一个实例中，所得的豌豆蛋白水解产物的溶解度在pH约3.4或约7时可为至少55％。在一个实例中，所得的溶解度在pH约3.4或约7时可为至少60％。在一个实例中，所得的溶解度在pH约3.4或约7时可为至少65％。在一个实例中，所得的溶解度在pH约3.4或7时可在约50％至约70％的范围内。

在一个实例中，所述豌豆蛋白水解产物的水解度可在约4％至约25％的范围内。在一个实例中，所述豌豆蛋白水解产物的水解度可在约6％至约20％的范围内。在一个实例中，所述水解度可在约8％至约18％的范围内。在一个实例中，所述水解度可在约4％至约10％的范围内。在一个实例中，所述水解度可在约16％至约25％的范围内。在一个实例中，所述水解度可为约8％。在一个实例中，所述水解度可为约18％。

在一个实例中，水解所述豌豆蛋白组合物可在约40摄氏度至约50摄氏度之间的温度下进行。在一个实例中，水解所述豌豆蛋白组合物可在约5.5至约6.5之间的pH下进行。在一个实例中，水解所述豌豆蛋白组合物的时间在约30分钟与约70分钟之间。

在一个实例中，所述酶与豌豆蛋白的比率为约1:100。在一个实例中，所述酶是蛋白酶，并且所选的真菌菌株是米曲霉。

在一个实例中，所述原料/豌豆蛋白组合物可包括天然豌豆蛋白和修饰的豌豆蛋白中的至少一种。已认识到，所述原料/豌豆蛋白组合物可以不是100％豌豆蛋白。在一个实例中，豌豆蛋白组合物可包含至少80重量％的豌豆蛋白。

根据本申请的实例可包括一种豌豆蛋白水解产物，其在pH约3.4或约7时的溶解度为至少30％。在一个实例中，溶解度在pH约3.4或约7时可为至少40％。在一个实例中，溶解度在pH约3.4或约7时可为至少50％。在一个实例中，溶解度在pH约3.4或约7时可为至少60％。在一个实例中，溶解度在pH约3.4或约7时可在约50％至约70％的范围内。在一个实例中，所述豌豆蛋白水解产物可以是至少80重量％的蛋白。

根据本申请的实例可包括在pH约3.4或7时具有至少65厘泊的粘度的豌豆蛋白水解产物。根据本申请的实例可包括在约中性pH时具有至少115秒的分散度的豌豆蛋白水解产物。根据本发明的实例可包括一种豌豆蛋白水解产物，其悬浮性在pH约3.4或7时为至少1.5TSI global。

根据本申请的实例可包括上述豌豆蛋白水解产物在饮料中的用途。在一个实例中，含有所述豌豆蛋白水解产物的饮料可以是水基饮料，其中饮料的至少45重量％是水。在一个实例中，所述豌豆蛋白水解产物可占饮料的至少5重量％。在一个实例中，当在搅拌约15分钟后在室温或环境条件下测量粘度时，所述含有豌豆蛋白水解产物的饮料可具有约100厘泊至约165厘泊的粘度。由于含有豌豆蛋白水解产物的饮料可在粘度测量之前储存在冰箱中，因此饮料可进行高温短时处理，这可包括在粘度测量之前加热到约190℉保持约90秒。在一个实例中，当在上述条件下测量时，含有豌豆蛋白水解产物的饮料的粘度可在约100厘泊至约200厘泊的范围内。

当用于饮料配方中时，本文所述的豌豆蛋白水解产物可提供符合素食主义者(包括绝对素食者)饮食的蛋白源，同时仍提供具有良好的风味、质地和总体口味的饮料。所述饮料可具有低粘度，并且在饮料的典型储存期内稳定。

此发明内容部分旨在提供对本专利申请的主题的概述。其并不旨在提供本发明的排他性或详尽的解释。包括

具体实施方式

部分以提供关于本专利申请的更多信息。

附图说明

在未必按比率绘制的附图中，类似的数字可在不同视图中描述相似的部件。具有不同字母后缀的类似的数字可代表相似部件的不同实例。附图总体上以举例的方式而非以限制的方式，说明了在本文中所讨论的各种实施方案。

图1是来自食品小组专家对含有豌豆蛋白和乳清蛋白的饮料配方的两个样品的感官结果的图，并且两个样品的豌豆蛋白不同。

图2是来自食品小组专家对含有豌豆蛋白的饮料配方的三个样品的感官结果的图，并且这三个样品各自的豌豆蛋白都不同。

图3示出了制备豌豆蛋白水解产物的台架试验方法。

图4示出了制备豌豆蛋白水解产物的中试方法。

图5示出了当豌豆蛋白组合物原料变化时水解产物的溶解度。

具体实施方式

本申请提供了制备在约pH 3.4或7时具有至少50％溶解度的豌豆蛋白水解产物的方法。本文所述的豌豆蛋白水解产物的提高的溶解度可有利于豌豆蛋白水解产物在食品和饮料中的使用。与其他可比的蛋白质饮料相比，除了溶解度提高之外，豌豆蛋白水解产物还可改善蛋白质饮料的总体口味，并且对含有其的蛋白质饮料提供美学益处。此外，豌豆蛋白水解产物可具有达到令人满意的质地和口感的粘度，并且在饮料的储存期内可以是稳定的。如下所述，豌豆蛋白水解产物在豌豆蛋白包含水平等于或大于5重量％的情况下，可提供口味良好的饮料。因此，在一些情况下，所述饮料可提供良好或优质的蛋白质来源。

制备豌豆蛋白水解产物的方法可包括获得豌豆蛋白组合物，将真菌酶加入到豌豆蛋白组合物中，并在控制条件下将豌豆蛋白组合物水解，以形成所需水解度的豌豆蛋白水解产物。豌豆蛋白组合物(即水解前豌豆蛋白的起始形式)可以是豌豆蛋白浓缩物或分离物，也可以是豌豆粉。当将水加入到豌豆蛋白组合物/真菌酶的组合中时，真菌酶可裂解豌豆蛋白中的键。真菌酶可以是真菌蛋白酶。应注意，术语“酶”是指具有活性酶产物的组合物。本领域技术人员将理解，这种酶活性和包含水平可在酶产物内变化。

如本文所用，术语“豌豆蛋白组合物”是指包含未经过水解的豌豆蛋白的组合物。豌豆蛋白组合物的蛋白质含量为100％或以下。在一些方面，豌豆蛋白组合物中的豌豆蛋白含量为大于60％、大于70％和大于80％的蛋白含量。豌豆蛋白组合物可以是干粉或浆液形式。浆液形式可由以下制成：(1)先前描述的干粉形式与水混合，使得干粉占浆液的约5-10重量％，其余由水构成，或(2)豌豆蛋白加工中间浆液，其包含悬浮于其中的14-18％的干固体。应注意，如果豌豆蛋白组合物为浆液形式，则在加工过程中可使用额外的高剪切力的均质化。如本文所用，术语“豌豆蛋白水解产物”或“水解产物”是指在控制条件下经过有限水解的豌豆蛋白组合物。本申请描述了执行豌豆蛋白组合物水解的方法。因此，豌豆蛋白组合物在本文中可称为原料。

水解过程中的以下条件会至少部分影响水解度(DH)：时间、温度和pH。在一个实例中，水解过程可进行约30分钟至约70分钟。在一个实例中，水解过程可在约30摄氏度至约60摄氏度的温度下进行。在一个实例中，温度在约40摄氏度与约50摄氏度之间。在一个实例中，水解过程可在约5.0至约7.5的pH下进行。在一个实例中，pH在约5.5与约6.5之间。如下所述，使用实验设计来确定豌豆蛋白组合物的有利水解条件。

水解度(DH)的定义为水解产物中裂解的肽键的比例。在一个实例中，本文所述的豌豆蛋白水解产物可具有约4％至约25％的DH。在一个实例中，DH可在约4％至约10％的范围内。在一个实例中，DH可在约8％至约12％的范围内。在一个实例中，DH可在约16％至约25％的范围内。在一个实例中，豌豆蛋白水解产物的DH可为约8％，这是用于食品和饮料应用的蛋白质来源的常见DH值。在一个实例中，豌豆蛋白水解产物的DH可为约18％。

在一个实例中，豌豆蛋白水解产物可以粉末形式获得。豌豆蛋白水解产物的粉末组合物可含有少于100％的豌豆蛋白。在一个实例中，豌豆蛋白水解产物的粉末组合物可含有约80重量％的豌豆蛋白。

在一个实例中，可以酶与豌豆蛋白约0.05:100至约5:100(按重量计)的比率加入酶。在一个实例中，酶与豌豆蛋白的比率可为约0.5:100至约1.5:100(按重量计)。在一个实例中，酶与豌豆蛋白的比率可为约1:100(按重量计)。酶的量相对于豌豆蛋白增加可减少达到特定水解度所需的时间。

因为豌豆蛋白组合物(即经历水解的原料)可含有少于100％的豌豆蛋白，所以酶与豌豆蛋白组合物的比率更高。在一个实例中，如果在酶与豌豆蛋白1:100的比率下，豌豆蛋白组合物含有按重量计80％的豌豆蛋白，则酶与豌豆蛋白组合物的比率为1:120(按重量计)。换句话说，在酶与豌豆蛋白的比率为1:100的情况下，将1克酶与120克豌豆蛋白组合物(原料)混合。这是基于豌豆蛋白组合物(原料)为80重量％豌豆蛋白的假设。在一个实例中，豌豆蛋白组合物(原料)可以是粉末形式。

在优选的方面，酶是真菌酶。真菌酶可以是裂解豌豆蛋白的蛋白酶。在一个实例中，真菌酶可以是来自Amano Enzyme Inc.的蛋白酶M“Amano”SD。在一个实例中，真菌可以是米曲霉。

豌豆蛋白组合物可包括天然豌豆蛋白、修饰的豌豆蛋白或其组合。对于本文的目的，修饰的豌豆蛋白是指已经被处理(化学或物理)以实现目标功能性的蛋白质。通常，处理包括在提取和干燥期间的热处理。

豌豆蛋白水解产物可作为蛋白质来源包括在多种饮料中，包括乳制品或非乳制品应用。此类饮料可包括但不限于果汁、蛋白质饮品、能量饮品等。在一个实例中，饮料中的豌豆蛋白水解产物可以是每8盎司份5克。在一个实例中，豌豆蛋白水解产物可与乳清组合使用，并且组合的蛋白质可以是每8盎司份10克。

在一个实例中，饮料中的豌豆蛋白水解产物可以为约5重量％或更多。如以下实施例中所述，当用于饮料配方时，豌豆蛋白水解产物在DH 8和DH 18表现出良好的感官结果。因此，在饮料中包含水平大于5重量％的豌豆蛋白水解产物是可行的。

如上所述，豌豆蛋白组合物可进行水解以提高溶解度。因此，溶解度可以是所得豌豆蛋白水解产物的水解度(DH)的函数。DH的增加可导致溶解度的增加。

蛋白质溶解度可定义为液相中存在的蛋白质相对于平衡时液固相中存在的蛋白质量的浓度。蛋白质溶解度可用百分比表示，并且通常如下确定：在将离心力施加到以特定蛋白质含量、pH和盐浓度制备的溶液后，相对于离心前溶液中的总蛋白质，测量上清液中的蛋白质含量。

本文所述的豌豆蛋白水解产物在约pH 3.4时可具有至少50％的溶解度。应注意，本文所述的豌豆蛋白水解产物的大多数溶解度分析是在pH等于3.4时进行的，这对于水解产物而言是困难的pH水平。在一个实例中，豌豆蛋白水解产物在pH 3.4时的溶解度在约30％与约70％之间。期望豌豆蛋白水解产物在中性pH(约7)下的溶解度等于或大于所述豌豆蛋白水解产物在pH 3.4下的溶解度。豌豆蛋白水解产物的溶解度提高可有利于豌豆蛋白在各种饮料中的较高包含水平。

根据本申请的实例可包括豌豆蛋白水解产物，其粘度在pH约3.4或7时为至少65厘泊。在一个实例中，粘度在pH约3.4或7时可为至少80厘泊。在一个实例中，粘度在pH约3.4或7时可为至少90厘泊。在一个实例中，粘度在pH约3.4时可为至少100厘泊。在一个实例中，粘度在pH约3.4时可为至少110厘泊。使用快速粘度分析仪(Rapid Visco Analyzer，RVA)通过以200rpm搅拌5克粉末(即水解产物)、20克水溶液10分钟来测量粘度。

根据本申请的实例可包括豌豆蛋白水解产物，其在约中性pH下具有至少115秒的分散度。在一个实例中，分散度在约中性pH值时可为至少125秒。在一个实例中，分散度在约中性pH值时可为至少135秒。分散度是指直到粉末(即水解产物)被完全润湿并且团块被轻易分散所需的时间量。在室温下，将达到5％蛋白质浓度溶液所需的粉末加入到100mL水中。立即启动计时器，并沿一个方向以120rpm的速度搅拌溶液。

根据本申请的实例可包括豌豆蛋白水解产物，其悬浮性在pH约3.4或7时为至少1.5TSI Global。在一个实例中，悬浮性在pH约3.4或7时为至少5TSI Global。在一个实例中，悬浮性在pH约3.4时为至少7TSI Global。使用Turbiscan稳定性指数(TurbiscanStability index，TSI)Global测量悬浮性，制备5％蛋白浓度的溶液，并在Turbiscan中测量45分钟，最后的TSI Global读数报告为悬浮性测量值。

确定水解条件的实验设计

使用实验设计来确定使溶解度最大化并为饮料提供适当粘度的水解条件。制备了在pH、温度和时间的各种值下的水解产物样品。pH范围为3至8，温度范围为35至55℃，并且时间范围为20至100分钟。

测试水解产物样品的DH、溶解度(在pH 3.4下测量)、热稳定性和粘度。将测试结果输入一个模型，所述模型用于做出两项预测。对于一项预测，使用了8％的目标DH，并计算了在所述DH值下达到最大溶解度的条件。在第二项预测中，目标DH值设置为18％。每组的预测条件示于下表1中。

表1：豌豆蛋白水解产物的样品

*这是豌豆蛋白组合物(原料)中豌豆蛋白的量(按重量计)。豌豆蛋白组合物为80％的豌豆蛋白(按重量计)。

样品1的DH受到限制；换句话说，将DH设定为8％，因为这是蛋白组合物的常见DH，如上所述。样品2的DH不受限制，并且表1中所示的值是模型选择的DH值。在表1的条件下形成每个样品的水解产物。与模型预测的DH和溶解度相比，以一式三份测试每个样品以确定DH和溶解度。结果示于下表2中。下面的实际值是每个样品的三个值的平均值。这表明所水解成分的重复生产总体上是可再现的。

表2：DH和溶解度的实际值和预测值的比较

使用邻苯二甲醛(O-Phthaldialdehyde，OPA)方法测量每个样品的DH，并通过减去未水解样品的DH值进行校正。为了测量溶解度，制备5％蛋白质溶液并调节至所需pH(3.4)，并使其搅拌1小时。取样均质的等分试样并测试蛋白质含量。取样另一均质的等分试样，并在13,000rpm下离心10分钟。然后对上清液取样并测试蛋白质含量。所有蛋白质含量测试均使用Dumas方法进行。将离心后的蛋白质含量除以离心前的蛋白质含量并乘以100％，计算出可溶性蛋白质的百分比。

如下所述配制和测试了两种含有豌豆蛋白水解产物的饮料配方，并将其与未水解的豌豆蛋白组合物进行比较。

本申请将在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求中所述的本发明范围。

实施例

对于下面的实施例1和2，由豌豆蛋白组合物制备至少一种豌豆蛋白水解产物，并且在饮料中测试所得的水解产物，并将其与含有未水解的豌豆蛋白组合物的饮料进行比较。在下面的两个实施例中，豌豆蛋白的原料(即豌豆蛋白组合物)是来自World FoodProcessing的PURISPea^TM870。为了形成豌豆蛋白水解产物，使用来自Amano Enzyme Inc.的蛋白酶M“Amano”SD，在以上提供的1:100的酶与豌豆蛋白比率下以及实验设计中确定的条件和表1中所示的条件下水解豌豆蛋白组合物。

实施例1–使用豌豆蛋白和乳清蛋白的饮料配方

将DH 8的含有豌豆蛋白水解产物的饮料与含有Puris^TM豌豆蛋白870的相同饮料进行了比较(应注意，水解产物是使用5重量％的Puris^TM豌豆蛋白870和剩余为水的豌豆蛋白组合物原料制备的)。在此实施例中，两个豌豆蛋白样品(DH 8的水解产物和Puris^TM豌豆蛋白870)均与分离乳清蛋白一起使用，以评估豌豆蛋白与乳清蛋白组合时的表现。饮料的配方(称为饮料配方1)示于下表3中。

表3：饮料配方1

值得注意的是，饮料配方1下的样品每8盎司份提供10克蛋白质，在一些情况下，这可有利于标有“优质蛋白质来源”的标签。

在将表3中的成分混合在一起之后，将两个样品均质化。均质化在2500psi下进行。然后，样品通过MicroThermics装置进行处理，所述装置包括高温短时(HTST)步骤(加热至约190℉)，然后经过2500psi下的另一个在线均质器进行处理。饮料配方1的样品评估包括使用26位食品小组专家的感官测试。样品以随机顺序分别提供给小组专家。要求小组专家根据总体喜爱度、风味、质地和后味对样品进行评分。感官小组的结果在图1中示出。豌豆蛋白水解产物样品在所有四个特征方面均获得了小组专家的好评，并且与Puris^TM豌豆蛋白870相比，在所有四个特征上均获得了更高的分数。

饮料配方1下的样品还进行了为期八周的储存期研究。将样品以透明塑料瓶储存在冰箱中。从冰箱中取出样品进行测试/观察。第4周，豌豆蛋白水解产物样品显示出与外界的可见分离。然而摇动后，所有的分离消失，并且饮料具有光滑的质地。

在为期八周的研究中，每周还对每个样品的粘度、颜色和pH进行测量。结果示于下表4至6中。

在进行粘度测量之前，对样品进行高温短时HTST)处理，加热至190℉保持约90秒。使用RVA(快速粘度分析仪)在室温下搅拌约15分钟来测量粘度。一旦测得的粘度稳定下来，就记录粘度值(厘泊)。

表4：饮料配方1的粘度

表5：饮料配方1的pH

表6：饮料配方1的颜色(a*值)

在为期八周的研究中，水解产物样品的粘度总体上保持稳定，并且明显低于Puris^TM Pea 870样品。用豌豆蛋白水解产物配制的饮料的较高pH可归因于饮料配方中乳清蛋白的存在。

使用比色计，具体是Hunter Lab Labscan XE(序列号LX17983)获得样品的颜色测量值。表6中，此处仅示出绿红色的a*值，因为这是与饮料最相关的维度。结果表明，随着时间推移的自然分解从消费者的角度来看是可接受的。

实施例2–使用豌豆蛋白的饮料配方

在此实施例中，称为饮料配方2，从配方中去除了分离乳清蛋白，以评估豌豆蛋白水解产物(应注意，水解产物是使用5重量％的Puris^TM豌豆蛋白870和剩余为水的豌豆蛋白组合物原料制备的)单独作为蛋白质来源时的表现。饮料配方2示于下表7中。

表7：饮料配方2

饮料配方2中的成分中不含乳清蛋白，但其他成分与饮料配方1中的相似。对饮料配方2的三个豌豆蛋白样品进行了评估-DH 8的豌豆蛋白水解产物、pH 18的豌豆蛋白水解产物和Puris^TM Pea 870。饮料配方2在每8盎司份提供5克蛋白质，在一些情况下，这可有利于标有“良好蛋白质来源”的标签。

使用与以上在实施例1中所提供的相同条件和步骤加工饮料。

22位食品小组专家对这三个样品进行了感官测试。样品以随机顺序分别提供给小组专家。小组专家根据总体喜爱度、风味、质地和后味对每个样品进行评估和评分。感官小组的结果示于图2中。两个豌豆蛋白水解产物样品(DH 8和DH 18)相对于Puris^TM Pea 870样品表现良好。更具体地说，在每个类别中，DH 8的豌豆蛋白水解产物得分均高于或大约等于Puris^TM豌豆蛋白870的得分。在所有类别中，DH 18的豌豆蛋白水解产物得分均高于Puris^TM豌豆蛋白870的得分。

基于图2所示的感官结果，DH 18水解产物的表现优于DH 8水解产物。尽管水解度较高，但DH18水解产物似乎不会导致饮料总体更苦的风味。相反，DH 18水解产物提供了可溶的豌豆蛋白粉，其提供了具有良好口感的口味良好的饮料。

饮料配方2下的样品进行了为期八周的储存期研究。将样品以透明塑料瓶储存在冰箱中，然后取出进行测试/观察。第4周，所有样品均显示出明显的分离。Puris^TM豌豆蛋白870样品具有相似的分离，其中包括漂浮在水相中的颗粒物；打开瓶子时，这种分离不太明显。豌豆蛋白水解产物样品具有“粘性的”质地，当打开瓶盖时其看起来是泡沫状。对于所有样品，摇动都会使分离消失，并且饮料具有光滑的质地。

在为期八周的研究中，测量了每个样品的粘度、颜色和pH。使用上述饮料配方1中所述的方法测量粘度(厘泊)。结果示于下表8至10中。

表8：饮料配方2的粘度

表9：饮料配方2的pH

表10：饮料配方2的颜色(a*值)

在为期八周的研究中，两种水解产物样品的粘度总体上保持稳定，并且明显低于Puris^TM Pea 870样品。在为期八周的研究中，两个水解产物样品的pH值都保持相对恒定，尽管最低高于Puris^TM Pea 870样品。

使用实施例1中使用的相同比色计获得此处三个样品的颜色测量值。在表10中，仅示出了绿红色的a*值。在为期八周的研究中，所有三个样品均显示出相似的颜色下降，这种变化是可接受的。

豌豆蛋白水解产物样品表现出良好溶解度和低粘度，尤其是相对于Puris^TM Pea870样品而言。与Puris^TM Pea 870样品相比，豌豆蛋白水解产物样品还显示出优异的风味和质地，特别是DH等于18的样品。发明人认为，本文所述的水解过程中使用的真菌酶靶向蛋白质上的特定位点，导致释放不被感知为更苦的亲水性肽，并且实际上可以使饮料配方中的豌豆蛋白异味(off-flavor)最小化。储存期研究表明，水解产物随时间相对稳定并保持低粘度。考虑到良好的口味结果、粘度和稳定性，本文所述的豌豆蛋白水解产物可用于多种饮料应用中，包括被描述为蛋白质饮品的那些饮料。

上面的具体实施方式包括对附图的引用，这些附图构成具体实施方式的一部分。附图以图示的方式示出了可以实践本发明的特定实施方案。这些实施方案在本文中也称为“实例”。此类实例可包括所示出或描述以外的元素。然而，本发明人还设想了仅提供所示出或描述的那些元素的实例。此外，本发明人还考虑使用所示出或描述的那些元素的任何组合或排列的实例(或其一个或多个方面)，所述组合或排列是相对于特定实例(或其一个或多个方面)，或相对于本文示出或描述的其他实例(或其一个或多个方面)。

如果本文件与通过引用方式并入的任何文件之间的用法不一致，则以本文件中的用法为准。在本文件中，使用如专利文件中常见的术语“一个”或“一种”来包括一个或超过一个，而与“至少一个”或“一个或多个”的任何其他实例或用法无关。在本文件中，除非另外指示，否则术语“或”用于指代非排他性的或，以使得“A或B”包括“A而无B”、“B而无A”、以及“A和B”。在本文件中，术语“包括(including)”和“其中(in which)”被用作相应术语“包括(comprising)”和“其中(wherein)”的通俗英语等同物。同样，在以下权利要求中，术语“包括(including和comprising)”是开放式的，也就是说，包括除了在一项权利要求中列在这种术语之后的元素之外的多个元素的系统、装置、物品、组合物、配方或方法仍被认为落在那项权利要求的范围内。此外，在以下权利要求中，术语“第一”、“第二”和“第三”等仅用作标签，且并不对其标的物强加数字要求。

本文描述的方法实例可以至少部分地是机器或计算机实现的。一些实例可以包括编码有指令的计算机可读介质或机器可读介质，所述指令可操作以配置电子设备来执行如以上实例中所述的方法。此类方法的实现可以包括代码，诸如微代码、汇编语言代码、高级语言代码等。此类代码可以包括用于执行各种方法的计算机可读指令。代码可以构成计算机程序产品的一部分。此外，在实例中，代码可以有形地存储在一个或多个易失性、非暂时性或非易失性有形计算机可读介质上，诸如在执行期间或在其他时间。这些有形计算机可读介质的实例可以包括但不限于硬盘、可移动磁盘、可移动光盘(例如压缩光盘和数字视频光盘)、盒式磁带、存储卡或存储棒、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)等。

以上描述旨在是说明性的而非限制性的。例如，上述实例(或其一个或多个方面)可以彼此组合使用。在回顾以上描述之后，诸如可以由本领域的普通技术人员使用其他实施方案。说明书摘要的提供符合37C.F.R.§1.72(b)，以允许读者快速确定本技术公开的本质。应当理解，摘要将不用于解释或限制权利要求的范围或含义。另外，在以上具体实施方式中，各种特征可以被分组在一起以简化本公开。这不应被解释为旨在表明未请求保护的公开特征对于任何权利要求都是必不可少的。而是，发明主题可以在于少于特定公开实施方案的所有特征。因此，以下权利要求由此作为实例或实施方案被并入到具体实施方式中，其中每个权利要求独立地作为单独的实施方案，并且可以预期的是，此类实施方案可以以各种组合或排列彼此组合。本发明的范围应参考随附权利要求以及此类权利要求享有的全部等效范围来确定。

实施例3–豌豆蛋白水解产物的性质

在此实施例中，豌豆蛋白的原料(即豌豆蛋白组合物)是来自World FoodProcessing生产的PURISPea^TM870的浆液形式的喷雾干燥前的变体，而另一种原料是未经巴氏杀菌的天然豌豆蛋白浆液(使用碱溶法和酸沉淀法从豌豆粉(PURISWhole^TM)中提取)。为了形成豌豆蛋白水解产物，使用来自Amano Enzyme Inc.的蛋白酶M“Amano”SD，以1:100的酶与豌豆蛋白比率在图3和图4所示的条件下将三种豌豆蛋白组合物水解至DH 8。表11、12、13和14分别提供了所得豌豆蛋白水解产物的溶解度、粘度、分散度和悬浮性数据。

表11：豌豆蛋白水解产物在5％蛋白质溶液中以百分比溶解度为单位的溶解度数据(在85℃热处理30分钟)

表12：豌豆蛋白水解产物在20％重量/体积溶液中以厘泊为单位的粘度数据

表13：豌豆蛋白水解产物在5％蛋白质溶液中以秒为单位的分散度时间

表14：豌豆蛋白水解产物在5％蛋白质溶液中以TSI Global为单位的悬浮性数据

实施例4–酶谱分析

在此实施例中，评估酶谱以确定其对修饰结果的影响。商业蛋白酶通常是源自多特异性单个酶的催化能力的混合物和具有不同特异性的酶的混合物。功能性的存在与否都会影响酶修饰的结果。要了解蛋白质的酶修饰的作用，对酶产物中特定水解活性的混合和强度有所了解是有益的。表征酶产物的方法可能有很多，因此，有限的一组活性可提供实用的描述，而不会花费太多时间来执行。本发明中使用以下方法来评估活性。如在此实施例中使用的，对“酶”的任何引用是对包括额外的非酶成分的“酶产物”的引用。

在pH 7时偶氮酪蛋白的一般水解

将偶氮酪蛋白(Sigma A2765)用作底物来检测非特异性蛋白酶活性。在50mMKH₂PO₄-NaOH中制备了2重量％的偶氮酪蛋白溶液。通过向2mL离心管中加入0.5mL相同缓冲液来构成反应混合物。将管设置为0、10、20和30分钟的时间点。在加入50μL 100重量％的水中三氯乙酸后，立即将零时管置于冰上。将50μL经稀释酶的等分试样加入到每个管中，并将管在50℃水浴中温热。以经定时的时间间隔，加入0.4mL的偶氮酪蛋白溶液，并开启计时器。制备了空白，但用50μL的缓冲液代替了酶。在指定的时间点，加入50μL的100重量％的TCA以终止反应，并将终止的反应立即转移至冰浴中。

将酶稀释(或溶解并稀释)到上述的反应缓冲液中。测试了一系列稀释液以证明与酶浓度的测定线性度。在随后的分析中，仅包括颜料释放速率呈线性的稀释液。

停止所有样品后，将样品以16,000xg离心7.5分钟，以沉降未反应的蛋白质。

将上清液的100μL等分试样置于96位酶标仪的孔中。向每个孔中加入100μL缓冲液和100μL的1M NaOH。使用带有Gen 5.1.11软件的BioTek Synergy HT在440nm下进行板读取。使用无酶的空白来创建平均空白值，然后从所有“活性”细胞中减去所述值；对于时间点0，将任何负值设置为零。计算吸光度的变化斜率。

一单位活性定义为ΔA₄₄₀的一单位变化/分钟。为了得出单位数/g商业酶产物，将每种稀释度的活性相对于测定中酶的质量作图，并计算活性对酶的回归线。斜率代表活性/mg酶产物，其被转化为ΔA₄₄₀/分钟/g酶产物。在纳入分析中之前，对各个酶测定线性度进行检查。

在pH 7时牛血清白蛋白的一般水解

将牛血清白蛋白BSA(Sigma A2153-50G)用作底物来测量非特异性蛋白酶活性。在pH 7时制备10mg/mL BSA在25mM磷酸钠缓冲液中的溶液。通过在pH 7的25mM磷酸钠缓冲液中连续稀释来制备酶。用酶浓度和时间点(0、10、20和30分钟)对微量离心管进行标记和排列。使用自动移液器向每个管中加入950μL的BSA溶液。将零时管立即置于冰浴中，并将所有其他管置于设定为50℃的水浴中以达到平衡。为了抑制酶活性并使蛋白质沉淀，将50μL100重量％的水中三氯乙酸(TCA)加入到零时管中。将50μL合适的酶溶液加入到每个零时管中。在10、20和30分钟的时间点管达到平衡后，以经定时的时间间隔将50μL合适的酶溶液加入到相应的管中。在第一次加入酶时开启计时器。用50μL缓冲液代替酶溶液制备空白。在适当的时间点，加入50μL 100重量％的TCA以终止反应，将管从水浴中取出，摇动，并放置在冰浴中至少30分钟。然后将样品以9100xg离心10分钟。

为了在280nm处获得准确的读数，将上清液的pH调节到大约9.0。将氢氧化钠(120μL 0.5M)加入到透紫外线的96孔微孔板的每个孔中。向各孔中加入190μL上清液，并轻轻搅动板进行混合。使用带有Gen5软件的酶标仪在280nm下进行板读取。

还使用TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)分析上清液中的游离氨基酸。在分析之前，制备TNBS在超纯水中的0.5％溶液，并储存在冰箱中直至使用。用微量移液器将50μL的每种标准溶液(0.01N HCl中的0-6mM亮氨酸)一式两份地移入96深孔板中。将每个样品(上清液)的40μL等分试样与10μL pH 9.5的2.5％硼酸盐试剂一起转移到深孔板中。使用多通道移液器，将1mL的2.5％硼酸盐试剂加入到每个标准品和样品孔中。开始反应时，向每个孔中加入20μL的0.5％TNBS，并将硅胶盖放在板上以密封各个孔。摇动板以混合，并在室温下置于黑暗中以显影。30分钟后取下盖子，将500μL新鲜制备的1M磷酸二氢钠加入到每个孔中以终止反应。再次带着硅胶盖摇动板，并且将每种标准品和样品溶液的300μL等分试样转移到96孔微孔板上。测量420nm处的吸光度，并使用平均标准曲线计算亮氨酸当量浓度。一单位活性定义为1μmol亮氨酸当量/分钟的释放。为了得出单位数/g商业酶产物，将每种稀释度的活性相对于测定中酶的质量作图，并计算活性对酶的回归线。斜率代表活性/g酶产物。

甘氨酸特异性水解

使用合成发色底物测试了对甘氨酸裂解特异的酶活性。通过将5mg溶于0.25mL的DMSO中并然后用25mM Na-HEPES-HCl(pH 6.75)稀释至25mL，来制备甘氨酸4-硝基苯胺-HCl(Sigma G4254)的1mM溶液。通过在冰冷的25mM HEPES缓冲液中连续稀释来制备酶。将100μL的酶等分试样加入到96位微量滴定板的孔中。通过加入100μL底物溶液来引发反应。将板放入运行Gen 5.1.11软件的50℃(预热)BioTek Synergy HT装置中。摇动后在0、10和20分钟时测量405nm处的吸光度。

一单位活性定义为ΔA₄₀₅的一单位变化/分钟。为了得出单位数/g商业酶产物，将每种稀释度的活性相对于测定中酶的质量作图，并计算活性对酶的回归线。斜率代表活性/mg酶产物，其被转化为ΔA₄₀₅/分钟/g酶产物。在纳入分析中之前，对各个酶测定线性度进行检查。

亮氨酸特异性水解

使用合成发色底物测试了对亮氨酸裂解特异的酶活性。通过将6.3mg溶于0.25mL的DMSO中并然后用25mM Na-HEPES-HCl(pH6.75)稀释至25g，来制备L-亮氨酸-对硝基苯胺(Sigma L2158)的1mM溶液。通过在25mM HEPES缓冲液中连续稀释来制备酶。将100μL的酶等分试样加入到96位微量滴定板的孔中。通过加入100μL底物溶液来引发反应。将板放入运行Gen 5.1.11软件的50℃(预热)BioTekSynergy HT装置中。在摇动后以0至30分钟的间隔测量405nm处的吸光度。

一单位活性定义为ΔA₄₀₅的一单位变化/分钟。为了得出单位数/g商业酶产物，将每种稀释度的活性相对于测定中酶的质量作图，并计算活性对酶的回归线。斜率代表活性/mg酶产物，其被转化为ΔA₄₀₅/分钟/g酶产物。在纳入分析中之前，对各个酶测定线性度进行检查。

赖氨酸特异性水解

使用合成发色底物测试了对赖氨酸裂解特异的酶活性。通过将11mg溶于0.25mL的DMSO中并然后用25mM Na-HEPES-HCl(pH 6.75)稀释至25g，来制备L-赖氨酸对硝基苯胺二溴化氢(Sigma L7002)的1mM溶液。通过在25mM HEPES缓冲液中连续稀释来制备酶。将100μL的酶等分试样加入到96位微量滴定板的孔中。通过加入100μL底物溶液来引发反应。将板放入运行Gen 5.1.11软件的50℃(预热)BioTek Synergy HT装置中。在摇动后以0至30分钟的间隔测量405nm处的吸光度。

一单位活性定义为ΔA₄₀₅的一单位变化/分钟。为了得出单位数/g商业酶产物，将每种稀释度的活性相对于测定中酶的质量作图，并计算活性对酶的回归线。斜率代表活性/mg酶产物，其被转化为ΔA₄₀₅/分钟/g酶产物。在纳入分析中之前，对各个酶测定线性度进行检查。

蛋氨酸特异性水解

使用合成发色底物测试了对蛋氨酸裂解特异的酶活性。通过将4.8mg溶于1.78mL的丙酮中，来制备L-蛋氨酸对硝基苯胺(Sigma M3529)的10mM溶液。通过在冰冷的25mMMOPS缓冲液(pH 7.5)中连续稀释来制备酶。在室温下，将50μL的酶等分试样与130μL的缓冲液一起加入到96位微量滴定板的孔中。通过加入20μL底物溶液来引发反应。将板放入运行Gen 5.1.11软件的50℃(预热)BioTek Synergy HT装置中。在间歇摇动后以0至45分钟的间隔测量405nm处的吸光度。

一单位活性定义为ΔA₄₀₅的一单位变化/分钟。为了得出单位数/g商业酶产物，将每种稀释度的活性相对于测定中酶的质量作图，并计算活性对酶的回归线。斜率代表活性/mg酶产物，其被转化为ΔA₄₀₅/分钟/g酶产物。在纳入分析中之前，对各个酶测定线性度进行检查。

精氨酸特异性水解

使用合成发色底物测试了对精氨酸裂解特异的酶活性。通过将约10mg底物溶解在0.25mL的DMSO中并然后用25mM Na-HEPES(pH 6.75)稀释至25g，来制备Nα-苯甲酰基-L-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(Sigma B4875)的10mM溶液。通过在冰冷的25mM Na-HEPES(pH6.75)中连续稀释来制备酶。将100μL的酶等分试样加入到96位微量滴定板的孔中。通过加入100μL底物溶液来引发反应。将板放入运行Gen 5.1.11软件的50℃(预热)BioTekSynergy HT装置中。在间歇摇动后以0至15分钟的间隔测量405nm处的吸光度。

一单位活性定义为ΔA₄₀₅的一单位变化/分钟。为了得出单位数/g商业酶产物，将每种稀释度的活性相对于测定中酶的质量作图，并计算活性对酶的回归线。斜率代表活性/mg酶产物，其被转化为ΔA₄₀₅/分钟/g酶产物。在纳入分析中之前，对各个酶测定线性度进行检查。

酪氨酸特异性水解

使用合成发色底物测试了对酪氨酸裂解特异的酶活性。通过将11.6mg底物溶于2.32mL丙酮中，来制备Nα-苯甲酰基-L-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(Sigma B4875)的10mM溶液。通过在冰冷的25mM MOPS-HCl(pH 7.5)中连续稀释来制备酶。将350μL室温缓冲液和100μL经稀释酶的等分试样加入到微量离心管中。通过加入50μL底物来引发反应。将管混合并移至50℃水浴中。通过加入50μL的100％重量/重量TCA使反应在1、3.5和23小时停止，并且将管冷却直至收集所有样品。对于零时点，在加入底物之前先加入TCA。完成后，将样品以16,000g离心7.5分钟，以沉降所沉淀出的蛋白质和未反应的底物。将样品(200μL)加载到96孔微量滴定板上，并在运行Gen5.1.11软件的BioTek Synergy HT装置上读取。记录405nm处的吸光度。此反应非常缓慢，因此用于进一步分析的唯一数据点是在23小时。作为检查，还对胰酶在相同的缓冲液系统中针对底物进行了测试，并在第一小时内显示出大于0.63的ΔA405。

一单位活性定义为ΔA₄₀₅的一单位变化/23小时。为了得出单位数/g商业酶产物，将每种稀释度的活性相对于测定中酶的质量作图，并计算活性对酶的回归线。斜率代表活性/mg酶产物，其被转化为ΔA₄₀₅/23小时/g酶产物。

蛋白酶M在这组测定中的活性示于表15中。

表15：蛋白酶M的活性

在将1g蛋白酶M施加到100g蛋白质底物的实例中，所施加的活性也可描述为大约：200个偶氮酪蛋白降解单位、53个酪蛋白衍生的A280释放单位、17个酪蛋白衍生的α胺释放单位、0.54个甘氨酸硝基苯胺水解单位、10,400个亮氨酸硝基苯胺水解单位、1280个赖氨酸硝基苯胺水解单位、91个蛋氨酸硝基苯胺水解单位、2.3个苯甲酰基精氨酸硝基苯胺水解单位和36个苯甲酰基酪氨酸硝基苯胺水解单位。本领域技术人员将认识到，可使用酶的一般活性和特异性活性的其他量度来进一步确定用于实现本发明结果的酶活性谱。