阅读说明：本技术 一种解除高滴度抑制的杆状病毒表达载体 (Baculovirus expression vector for removing high titer inhibition ) 是由 不公告发明人 于 2019-01-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种解除高滴度抑制的杆状病毒表达载体。杆状病毒表达系统不具有显著的剂量效应,即高病毒滴度并不能提高外源基因的产量。其原因是高滴度诱导了晚期表达因子LEF-10的聚集,进而抑制了晚期基因的表达。该载体通过突变LEF-10第21位亮氨酸位点,使LEF-10聚集倾向性降低。用高滴度突变型杆状病毒感染昆虫细胞,可以显著提高晚期启动子控制的外源基因的表达量。表达产量的提高能显著降低企业的生产成本。该杆状病毒表达载体可用于生物制品工业领域,特别是亚单位疫苗工业领域。(The invention discloses a baculovirus expression vector for removing high titer inhibition, wherein a baculovirus expression system has no obvious dose effect, namely the high virus titer can not improve the yield of exogenous genes, the reason is that the high titer induces the aggregation of a late expression factor L EF-10, so as to inhibit the expression of the late genes, the vector reduces the aggregation tendency of L EF-10 by mutating a 21 st leucine site of L EF-10, insect cells are infected by high titer mutant baculovirus, the expression quantity of the exogenous genes controlled by a late promoter can be obviously improved, the improvement of the expression yield can obviously reduce the production cost of enterprises, and the baculovirus expression vector can be used in the field of biological product industry, particularly in the field of subunit vaccine industry.)

一种解除高滴度抑制的杆状病毒表达载体

技术领域

本发明属于重组蛋白质表达技术领域，尤其涉及一种解除高滴度抑制的杆状病毒表达载体。

背景技术

杆状病毒是特异感染节肢动物的双链DNA病毒，苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus, AcMNPV）是杆状病毒的模式种。自从1983年Smith GE等首次用杆状病毒在昆虫细胞中表达人β-干扰素基因以来（Mol CellBiol. 1983; 3:2156-65），由于具有低成本、高产量，而且具备各种翻译后修饰系统等优点，杆状病毒表达载体系统在科研和生产中被广泛应用。

在蛋白质表达领域，人们公认基因表达具有剂量效应的，即基因的拷贝数和蛋白的表达量有一定的正相关性，但是杆状病毒表达系统是个特例。在很久以前研究人员就发现，感染昆虫细胞时，随着病毒滴度的提高，外源蛋白的表达量并没有明显提高；在更高的滴度下蛋白的产量反而下降了（Biotechnol Bioeng. 1994; 44:710-719）。

杆状病毒表达系统是个瞬时表达系统，在工业使用上，人们希望在一个生产批次上获得更多的蛋白，但由于高滴度病毒对产量并无益处，所以生产上通常使用MOI 3-5感染细胞，而无法通过增加MOI提高蛋白产量。

LEF-10是杆状病毒必需的晚期表达因子（Virus Res. 2013; 175:45-51, PLoSOne. 2016; 11:e0154835），其具体的生理功能目前尚不清楚。先前的研究发现，LEF-10具有强烈的聚集倾向（Virus Genes. 2004; 29:191-197）。在杆状病毒感染的昆虫细胞中发现，高滴度病毒可以诱导LEF-10形成聚集体，而聚集体一旦形成，晚期启动子控制的外源基因几乎不表达（PLoS One. 2016; 11:e0154835）。这一发现暗示了这样一种可能：即杆状病毒表达系统不具有基因剂量效应的原因，是因为高病毒滴度诱导了LEF-10聚集，进而阻断了晚期启动子的表达。

如果能解除LEF-10聚集导致的抑制作用，工业生产上就可以通过高滴度病毒感染，提高外源蛋白的产量，但到目前为止，还没有降低LEF-10聚集倾向性的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种解除高滴度抑制的杆状病毒载体，旨在解决背景技术提及的杆状病毒表达系统不具有基因剂量效应的问题。

本发明通过突变LEF-10第21位亮氨酸残基，获得了LEF-10聚集倾向性下降的杆状病毒表达载体。用该表达载体，可以实现通过高MOI提高外源蛋白产量的目的。

本发明中LEF-10第21位亮氨酸残基可以被替换为丙氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、赖氨酸、酪氨酸等氨基酸残基。用这些氨基酸替换亮氨酸后，都能不同程度降低LEF-10聚集倾向。

本发明是这样实现的，以丙氨酸替换为例，用带有LEF-10第21位氨基酸编码区上下游50bp同源臂的引物（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2）扩增rpsL-AMP抗性基因片段，将获得的PCR产物电转化到含有Bacmid的大肠杆菌中，通过诱导表达RedET重组酶，在大肠杆菌中实现同源重组，经氨苄青霉素抗性筛选，获得LEF-10 L21敲除的Bacmid。将人工合成的带有21位丙氨酸突变序列的LEF-10片段（SEQ ID NO:3）电转化到含有LEF-10 L21敲除Bacmid的大肠杆菌中，再次诱导表达RedET重组酶，在大肠杆菌中实现同源重组，经链霉素抗性反向筛选，获得带有丙氨酸替换的LEF-10的Bacmid。

本发明在替换LEF-10第21位亮氨酸后，在高感染滴度下蛋白表达水平显著高于LEF-10改造前的表达载体，说明本发明确实能提供一个具有优良生产性状、解除高滴度抑制的杆状病毒表达载体。

附图说明

图1 本发明提供的杆状病毒载体的解除抑制机制示意图。

图2 丙氨酸替换后LEF-10聚集倾向性下降。昆虫细胞感染后第三天观察到的LEF-10-GFP，LEF-10 L21A在细胞内呈弥散状分布，而野生型出现点状聚集。

图3 使用本发明提供的杆状病毒载体表达的绿色荧光蛋白GFP。病毒感染后2天的细胞经流式细胞仪分析，计算几何平均值得到总荧光强度。结果显示本发明提供的杆状病毒载体表达的GFP产量，在低滴度时与野生型无明显差异，但在MOI 8时提高55%。

图4 替换成其他氨基酸时的表达量。病毒感染后2天的细胞经流式细胞仪分析，计算几何平均值得到GFP总荧光强度。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述（以丙氨酸替换为例）。

1、Bacmid上LEF-10第21位亮氨酸敲除

用带有LEF-10第21位点上下游50bp同源臂的引物（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2），以prpsL-AMP质粒为模板，扩增rpsL-AMP（氨苄青霉素抗性基因）片段，获得了1023bp的PCR产物。

将获得的PCR产物用电转化的方法转入带有RedET质粒和Bacmid的大肠杆菌菌株HS996中，经阿拉伯糖诱导产生重组酶，重组后的大肠杆菌经氨苄青霉素抗性平板筛选，获得阳性克隆。此时LEF-10第21位亮氨酸编码序列已经被rpsL-AMP片段替换。

2、在LEF-10第21位插入目的氨基酸

用将人工合成的带有丙氨酸突变序列的LEF-10片段（SEQ ID NO:3）电转化至上一步骤的阳性大肠杆菌中，再次用阿拉伯糖诱导产生重组酶，重组后的大肠杆菌经链霉素抗性平板反向筛选，获得阳性克隆。此时LEF-10第21位亮氨酸已经被目的氨基酸替换，此例中的目的氨基酸为丙氨酸。

从大肠杆菌中提取Bacmid，测序鉴定后命名为L21A。L21A经质粒小提、Bsu36I限制性内切酶酶切线性化之后，供后续实验使用。

3、表达绿色荧光蛋白GFP

线性化的L21A与pTriEx-GFP质粒（GFP基因片段克隆在pTriEx1.1 NcoI/XhoI位点之间，GFP基因由杆状病毒晚期启动子p10控制）共转染Sf9昆虫细胞，转染后5天收集P0代重组病毒。P0代病毒扩增至P1代病毒，以0.25-8 MOI感染Sf9细胞，感染后两天收集细胞。用流式细胞仪检测细胞的绿色荧光强度，并计算几何平均数（附图3）。比较后发现绿色荧光蛋白GFP产量在低滴度时与野生型无明显差异，但在MOI 8时提高55%。这说明本发明提供的杆状病毒表达载体确实能在高滴度下提高外源基因的产量。

以上所述的LEF-10第21位丙氨酸替换仅为本发明的实施例而已，其他几种氨基酸替换的效果见附图4。本实施例并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 陕西杆粒生物科技有限公司

<120> 一种解除高滴度抑制的杆状病毒表达载体

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 70

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

aacgtatggt tcgcgacgga cgtcaacctg atcaattgtg tactgaaaga taatgatggc 60

ctggtgatgg 70

<210> 2

<211> 70

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

atcggtttct tggtcgaaca catttaaaat aatgtaatta ttatctatca aaaattacca 60

atgcttaatc 70

<210> 3

<211> 103

<212> DNA

<213> Autographa californica nucleopolyhedrovirus

<400> 3

tatggttcgc gacggacgtc aacctgatca attgtgtact gaaagataat gcatttttga 60

tagataataa ttacattatt ttaaatgtgt tcgaccaaga aac 103