一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用

文档序号：1811124 发布日期：2021-11-09 浏览：12次 >En<

阅读说明：本技术 一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用 (Establishment and application of efficient silk fibroin heavy chain promoter secretion expression system ) 是由王峰夏庆友许胜� 赵萍于 2021-03-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种高效丝素重链分泌型重组表达系统的建立与应用,利用一类增强子hr3、非翻译区序列3’UTR等增强基因表达的功能元件,对家蚕丝素重链启动子(Fib-H promoter)的效率进行优化,在此基础上整合建立高效、稳定的分泌型丝素重链(Fib-H)重组表达系统,实现在转基因家蚕后部丝腺高效分泌重组表达外源蛋白。本发明建立了一种高效的丝素重链分泌表达系统,实现了外源蛋白在蚕丝中以其天然大小的分子量大量分泌且具备活性,与之前的丝素表达系统相比在应用上更有前景。(The invention relates to establishment and application of a high-efficiency silk fibroin heavy chain secretory recombinant expression system, wherein functional elements for enhancing gene expression, such as an enhancer hr3, an untranslated region sequence 3' UTR and the like, are utilized to optimize the efficiency of a silk fibroin heavy chain promoter (Fib-H promoter) of a silkworm, and on the basis, the high-efficiency and stable secretory silk fibroin heavy chain (Fib-H) recombinant expression system is integrated and established to realize the high-efficiency secretory recombinant expression of foreign protein in silk glands at the back of transgenic silkworms. The invention establishes an efficient silk fibroin heavy chain secretion expression system, realizes the secretion of foreign proteins in silk with the natural size and the large molecular weight and has activity, and has more prospect in application compared with the prior silk fibroin expression system.)

技术领域

本发明应用于生物技术以及基因工程技术领域，具体涉及一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用。

背景技术

随着21世纪生物工程以及基因工程的迅速发展，人们对医用、药用、食用、美容、保健等各种用途的功能性蛋白需求量日益增大，依靠天然来源的蛋白质提取和生产已无法满足快速增长的市场需求。建立和完善各种高效的原核和真核表达系统，并利用菌株、细胞和昆虫等作为宿主生物反应器，是实现低成本、规模化生产具有生物学活性的重组外源蛋白的有效和可持续方法，并成为当今世界研究的热点。利用中国仓鼠卵巢细胞作为生物反应器生产外源蛋白是目前最为标准的表达模式，但其运营成本和对环境的要求极为苛刻，严重限制了其大规模推广应用。为了建立低成本、规模化、安全可持续的高效生产外源蛋白的生物工厂，自2000年以来，科研人员开始尝试利用转基因生物，如哺乳动物、鸟类、昆虫以及植物的器官作为生物反应器来生产重组外源蛋白。

家蚕以泌丝著称，是最早被人类所完全驯化利用的经济动物(昆虫)之一。绢丝腺是合成、分泌蚕丝蛋白的唯一器官，为整个蚕丝业的生物学基础。经过数千年的人工驯化，家蚕的绢丝腺具备了超强的蛋白质合成与分泌能力，一头体重5g左右家蚕能合成分泌约0.5g蚕丝蛋白，为目前已知昆虫之最。蚕丝蛋白主要由丝素蛋白(fibroin)和覆被在其外层的丝胶蛋白(sericin)构成：丝素蛋白是蚕丝的主体，约占75％，由蚕的后部丝腺合成，包括fib-H 链、fib-L链和P25三种主要组分，均不溶于水；其余为丝胶蛋白，约占25％，由蚕的中部丝腺合成，包括丝胶1(Sericin1)、丝胶2(Sericin2)和丝胶3(Sericin3)三种主要组分，其中又以丝胶1蛋白含量最高，均可溶于水。随着现代分子生物学和转基因技术的发展，家蚕绢丝腺的高效合成与分泌丝蛋白这一特征，以及所具备的糖基化、甲基化等对外源蛋白保持活性极其重要的蛋白质翻译后修饰加工能力，饲养成本低，可工厂化生产，对人畜安全等特点，使其成为理想的生物反应器模型，备受各国研究人员关注并竞相开发利用。

2000年，田村等人利用piggyBac转座子介导显微注射家蚕蚕卵并获得了稳定遗传的转基因家蚕；2003年，夏庆友等人完成了家蚕基因组计划，家蚕丝腺中涉及丝蛋白合成的重要编码基因如丝素重链(FibH chain)基因、丝素轻链(FibL chain)基因、丝胶1(Sericin1)基因、丝胶 2(Sericin2)基因、丝胶3(Sericin3)基因以及P25基因等的启动子调控元件被鉴定和克隆，这些基础研究结果使得利用转基因家蚕组织特异表达系统，在丝腺中大规模生产重组外源蛋白成为可能。近年来，国内外利用piggyBac转座子介导的转基因技术以及家蚕组织特异启动子元件在丝腺中尝试表达了多个外源蛋白，包括：在后部丝腺表达了丝素重链融合的EGFP(Zhao et al.2010)、猫干扰素(Kurihara et al.2007)、增强型绿色荧光蛋白(Kojima et al.2007)、蜘蛛丝牵引蛋白(Zhu et al.2010)，丝素轻链融合的人III型胶原蛋白的部分肽段(Tomita et al.2003)、增强型绿色荧光蛋白(Tomita etal.2003)、羟基脯氨酸胶原部分肽段(Adachi et al.2006)、成纤维细胞生长因子(Hino etal.2006)、部分胶原蛋白肽段(Yanagisawa et al.2007)，以及P25融合的红色荧光蛋白(Royer et al.2005)等；在中部丝腺表达了人血清白蛋白(Ogawa et al.2007)、增强型绿色荧光蛋白(Tomita et al.(2007)、鼠单克隆抗体(Iizuka et al.2009)、人胶原蛋白α链基因(Adachi et al.2010)以及可溶性GM-Csf受体α(Urano et al.2010)等。但总体上，上述研究成果的产业化推进颇为困难，主要原因在于：这类丝素重链表达系统由于调控元件较为单一，并且外源蛋白需要与内源丝蛋白进行融合才能实现分泌表达，对外源蛋白的表达量和生物活性产生不利影响，研究人员尝试过蛋白复性策略，但是流程繁琐且收效甚微，因而极大的限制的丝素重链表达系统的应用。所以，有必要对现有的丝素重链表达系统进行改造，以提高外源蛋白的表达效率与生物活性，推动家蚕丝腺生物反应器技术体系在生物制药和功能性蚕丝遗传改良领域中的应用。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一种高效丝素重链启动子分泌表达系统，解决了现有丝素重链表达系统由于调控元件较为单一，并且外源蛋白需要与内源丝蛋白进行融合才能实现分泌表达，对外源蛋白的表达量和生物活性产生不利影响的问题。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：

一种高效丝素重链pBac载体的构建方法，其特征在于，所述pBac载体包括pBac-FRF 载体、pBac-HFRF载体、pBac-HFRS载体、pBac-HFlRS载体；所述pBac-HFRF载体、pBac-HFRS 载体、pBac-HFlRS载体是由所述pBac-FRF载体形成的插入型载体；所述pBac载体的构建包括以下步骤：

1)采用特异性引物以phSRSV载体为模板进行PCR扩增，得到红色荧光蛋白DsRed1、hr3 CQ增强子和Ser1pA终止子，将得到的片段分别克隆到pMD 19T simple载体中，分别得到pDsRed1载体、phr3载体和pSer1pA载体；

2)采用特异性引物以家蚕基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到F(1967)，将得到的F(1967)片段克隆到pMD19T simple载体中，得到pF1967载体，F(1967)的序列如SEQ IDNo.1 所示；

采用特异性引物以FibHpolyA(FibHpA)终止子为模板进行PCR扩增，将得到的DNA片段克隆到pMD19T simple载体中，得到pFibHpA载体；

3)将pDsRed1载体上用BamH I和Not I酶切得到的DsRed1片段连接到用BamH I和Not I酶切后的pF1967载体上，得到pFR载体；

将p-FibHpA载体上用Not I和Kpn I酶切得到的FibHpA片段连接到用Not I和KpnI酶切后pFR载体上，得到pFRF载体，pFRF的序列如SEQ ID No.2所示；

4)将pFRF载体用AscⅠ酶切得到FRF片段，将其插入pBac[3xP3DsRedaf]转基因载体中，得到pBac-FRF载体。

进一步的，一种高效丝素重链pBac-HFRF载体的构建方法，包括以下步骤：将hr3插入 pFRF载体得到pHFRF载体，pHFRF的序列如SEQ ID No.2所示，将pHFRF载体用AscI酶切得到HFRF片段，将其插入pBac[3xP3DsRedaf]转基因载体中生成pBac-HFRF。

进一步的，一种高效丝素重链pBac-HFRS载体的构建方法，包括以下步骤：将pHFRF载体中的FibHpA用Ser1pA替换生成pHFRS；pHFRS的序列如SEQ ID No.2所示，将pHFRS 载体用AscI酶切得到HFRS片段，将其插入pBac[3xP3DsRedaf]转基因载体中生成 pBac-HFRS。

进一步的，一种高效丝素重链pBac-HFIRS载体的构建方法，包括以下步骤：在pHFRS 中，用Exon2(GenBank登录号AF226688，nt.63451-63846)替换Exon2 NTD 2AA以生成载体pHFlRS；将pHFIRS载体用AscI酶切得到HFIRF片段，将其插入pBac[3xP3DsRedaf]转基因载体中生成pBac-HFIRS。

一种上述高效丝素重链pBac载体在制备高效丝素重链启动子分泌表达系统中的应用。

一种高效丝素重链启动子分泌表达系统，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

1)将pBac载体与辅助质粒pHA3PIG以质量比为1:1的比例一起注入G0代卵中，饲养后得到G0蛾子，然后进行交配制种得到G1代；

2)用荧光显微镜对G1代卵的眼睛或神经是否有荧光进行阳性个体筛选获得转基因家蚕，获得的转基因家蚕饲养、传代，保留pBac-FRF载体、pBac-HFRF载体、pBac-HFRS载体单拷贝的阳性转基因个体分别为FRF品系、HFRF品系和HFRS品系。

进一步的，所述pBac载体中pBac-FRF载体、pBac-HFRF载体、pBac-HFRS载体在染色体上的插入位点分别为1号染色体、25号染色体和20号染色体。

一种上述高效丝素重链启动子分泌表达系统在家蚕生物反应器中合成和分泌成熟的重组蛋白中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1)建立了一种高效的丝素重链分泌表达系统，实现了外源蛋白在蚕丝中以其天然大小的分子量大量分泌且具备活性，与之前的丝素表达系统相比在应用上更有前景。

2)高效的丝素重链分泌表达系统可用于生物反应器中表达和分泌成熟的重组蛋白，而且在N-末端没有任何额外的丝素重链氨基酸残基不会影响蛋白的大小。

附图说明

图1为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中丝素重链启动子 pBac表达载体构建示意图。

图2为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中转基因家蚕阳性个体的筛选示意图。

附图2中a、b、g和h为FRF品系,c、d、i和j为HFRF品系,e、f、k和l为HFRS品系。a、c、e、g、i和k分别在白光下观察，b、d、f、h、j和l分别在DsRed激发光下观察。

图3为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中DsRed1基因染色体上的定位图。

图4为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中DsRed1在转基因家蚕中的表达示意图。

附图4中a为WT，b为FRF，c为HFRF，d为HFRS。a、b、c、d和e分别在白光下观察，f在DsRed激发光下观察。

图5为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中DsRed1在后部丝腺与中部丝腺的分布示意图。

图6为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中不同转基因蚕茧的示意图。

图7为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中转基因家蚕茧层率的对比示意图。

图8为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中DsRed1在转基因蚕茧内层和外层的观察示意图。

图9为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中DsRed1在转基因蚕茧中的分布示意图。

图10为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中DsRed1mRNA在后部丝腺的相对表达图。

图11为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中DsRed1mRNA在中部丝腺的相对表达图。

图12为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中FibH mRNA在后部丝腺和中部丝腺的相对表达图。

图13为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中DsRed1的蛋白电泳分析图。

图14为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中DsRed1的免疫印迹分析图。

附图14中，dsRed-6xHis样品为标准对照样。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

实施例1：一种高效丝素重链pBac载体的构建

本发明从家蚕基因组DNA中用特异性引物通过PCR扩增出一个长度为1967bp的DNA片段，称为F(1967)载体，F(1967)载体上的丝素重链启动子基础元件序列与GenBank上登录的家蚕FibH基因Accession No.AF226688(nt.61490–63456)一致，包括5’UTR(628bp)，promoter region(320bp)，Exon1(42bp)，Intron1(971bp)，Exon2-NTD 2AA(6bp)。hr3 CQ增强子、Ser1pA终止子和FibHpA终止子序列为已知序列(Wang et al.2013)。

pBac载体包括pBac-FRF载体、pBac-HFRF载体、pBac-HFRS载体、pBac-HFlRS载体；pBac-HFRF载体、pBac-HFRS载体、pBac-HFlRS载体是由pBac-FRF载体形成的插入型载体；pBac载体的构建包括以下步骤：

1)采用特异性引物以phSRSV载体为模板进行PCR扩增，得到红色荧光蛋白DsRed1、hr3 CQ增强子和Ser1polyA(Ser1pA)终止子，将得到的片段分别克隆到pMD 19T simple载体(Takara)中，分别得到pDsRed1载体、phr3载体和pSer1pA载体；

2)采用特异性引物以家蚕基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到F(1967)(序列如SEQ ID No.1所示)，将得到的F(1967)片段(GenBank登录号AF226688，nt.61490-63456)克隆到pMD19T simple载体(Takara)中，得到pF1967载体；

采用特异性引物以FibHpolyA(FibHpA)终止子为模板进行PCR扩增，将得到的DNA片段克隆到pMD19T simple载体(Takara)中，得到pFibHpA载体；

3)将pDsRed1载体上用BamH I和Not I酶切得到的DsRed1片段连接到用BamH I和Not I酶切后的pF1967载体上，得到pFR载体；

将p-FibHpA载体上用Not I和Kpn I酶切得到的FibHpA片段连接到用Not I和KpnI酶切后pFR载体上，得到pFRF载体(序列如SEQ ID No.2所示)；

4)将pFRF载体用AscⅠ酶切得到FRF片段，将其插入pBac[3xP3DsRedaf]转基因载体中，得到pBac-FRF载体。

将hr3插入pFRF载体得到pHFRF载体(序列如SEQ ID No.3所示)，将pHFRF载体用AscI酶切得到HFRF片段，将其插入pBac[3xP3DsRedaf]转基因载体中生成pBac-HFRF载体；

将pHFRF载体中的FibHpA用Ser1pA替换生成pHFRS(序列如SEQ ID No.4所示)；将pHFRS载体用AscI酶切得到HFRS片段，将其插入pBac[3xP3DsRedaf]转基因载体中生成pBac-HFRS载体。

在pHFRS中，用Exon2(GenBank登录号AF226688，nt.63451-63846)替换Exon2 NTD2AA以生成载体pHFlRS；将pHFIRS载体用AscI酶切得到HFIRF片段，将其插入 pBac[3xP3DsRedaf]转基因载体中生成pBac-HFIRS载体。

pBac载体构建中进行PCR扩增需要的特异性引物的核苷酸序列见表1。

表1核苷酸序列表

注：下划线表示相应限制性内切酶酶切位点的序列。

实施例2：一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的制备

一种高效丝素重链启动子分泌表达系统，制备方法包括以下步骤：

1)将pBac载体与辅助质粒pHA3PIG以质量比为1:1的比例一起注入G0代卵中，饲养后得到G0蛾子，然后进行交配制种得到G1代；

实施例3：利用反向PCR法对pBac载体在染色体上的插入位点检测

将基因组DNA在37℃下用酶切HaeIII过夜，酶切产物回收后用T4DNA连接酶在16℃下连接过夜使DNA片段环化。将连接产物用转座子特异性引物pBacL-F/pBacL-R(用于piggyBac左臂)和pBacR-F/pBacR-R(用于piggyBac右臂)进行PCR扩增。克隆PCR片段并测序。使用SilkDB 3.0(https://silkdb.bioinfotoolkits.net)确定pBac表达载体在家蚕基因组上的插入位点。

通过检测，pBac载体中pBac-FRF载体、pBac-HFRF载体、pBac-HFRS载体在染色体上的插入位点分别为1号染色体、25号染色体和20号染色体。

实施例4：DsRed1重组蛋白在上簇期丝腺组织中的分布

在自然光照下对FRF品系、HFRF品系和HFRS品系三种品系家蚕观察上簇期转基因，并用数码相机拍摄。然后对家蚕进行解剖取出丝腺，用装有RFP滤光器的体式荧光显微镜进行红色荧光蛋白的观察。最后，将丝腺中部和后部(MSG和PSG)分别用包埋剂Tissue-TekO.C.T.compound(SAKURAFinetechnical)进行包埋，用液氮冷冻。用恒冷箱切片机(一般-22℃) 切片，切片机厚度为10μm，将切片粘贴在预处理的载玻片上。用DAPI染色，然后滴加抗荧光淬灭剂完成封片，最后将切片置于荧光显微镜观察与拍摄。

通过附图4、附图5发现，对上簇期的转基因家蚕观察发现HFRS(图4d)和HFRF(图4c)转基因品系全身呈橘红色，对其进行解剖发现HFRS和HFRF丝腺的中部与后部都呈粉红色，FRF与WT组基本一致(如图4e所示)；在荧光显微镜下观察发现，FRF、HFRF和HFRS 的中部和后部丝腺呈红色荧光，而且荧光以次增强(如图4f所示)。解剖刚上簇的蚕，取出丝腺分别对后部和中部丝腺进行冷冻切片观察(如图5所示)，FRF、HFRF和HFRS后部丝腺细胞内均有DsRed1的表达，后部丝腺腔内也有DsRed1的分布，丝胶层也略呈红色荧光，而且红色荧光以此增强；在中部丝腺腔内分布着大量的球状的红色荧光点，且HFRS品系最强。

实施例5：DsRed1重组蛋白在蚕茧中的分布

在自然光照下对FRF品系、HFRF品系和HFRS品系三种品系家蚕观察上簇期转基因，并用数码相机拍摄。各选取30个转基因蚕茧进行茧层率的统计，将转基因茧用打孔器打孔获得直径5mm的圆片，进一步荧光观察茧的外层和内层，对蚕茧进行冷冻切片观察，并用装有RFP滤光片的荧光显微镜进行了拍摄。

见附图6-9，收取阳性个体的蚕茧发现HFRS的蚕茧呈橘红色，而且内层要红于外层， HFRF组和FRF组以次减弱，WT组无红色荧光，而且HFRS组茧最小。进行茧层率的统计分析，FRF组茧层率与WT组无明显差异，HFRF和HFRS组均显著低于WT组。将蚕丝进行冷冻切片观察发现，阳性个体的丝素和丝胶层均有红色荧光蛋白的分布，HFRS组分布的最多。

实施例6：丝腺中DsRed1的mRNA的相对表达

提取转基因家蚕5龄第3天到上簇期的MSG和PSG中总RNA。然后通过反转录获得cDNA,以cDNA为模板进行qPCR检测，以家蚕核糖体蛋白49(rp49)为内参。采用ABI 7500 快速实时系统(Applied Biosystems)在以下条件下进行qPCR反应：95℃30s，在95℃，3s 和60℃，30s的条件下进行40个循环。表1描述了用于qPCR的FibH、DsRed1和rp49引物。

见附图10-14，对家蚕幼虫L5D3、L5D4、L5D5、L5D6、L5D7和上簇期的丝腺分别进行RNA提取，分别对中部丝腺和后部丝腺进行DsRed1基因和FibH基因进行荧光定量PCR 检测，上簇期HFRF和HFRS品系后部丝腺DsRed1的相对表达量分别是FRF的5.7倍和6.9 倍，显著高于FRF组，而且HFRF和HFRS品系DsRed1在中部丝腺也有少量的表达。而且 HFRS和HFRF品系会影响FibH相对表达。

实施例7：蚕茧中DsRed1含量的分析

在40℃，旋涡振荡10min条件下，将80mg剪碎的转基因蚕茧用1ml 9.3ml LiBr进行溶解，然后加入1ml 8M尿素，用混合旋涡混合器(Eppendorf)混合。混合液用9倍PBS稀释。最后在4-20％梯度丙烯酰胺凝胶(Genscript)上进行蛋白电泳，考马斯亮蓝R-250染色和Western blotting分析。利用Image J软件对转基因蚕茧中重组RFP的含量进行了灰度分析。

实施例3与实施例6中反向PCR/qPCR反应所用引物的核苷酸序列见表2。

表2核苷酸序列表

见附图13、附图14，将FRF、HFRF和HFRS品系的蚕茧进行蛋白提取，对DsRed1的含量进行比较，HFRS和HFRF组蚕茧中DsRed1的含量是FRF组的7.2倍和4.1倍。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1967

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaatgctct agtgttatac ctttccaaaa tcaccattaa ttaggtagtg tttaagcttg 60

ttgtacaaaa ctgccacacg catttttttc tccactgtag gttgtagtta cgcgaaaaca 120

aaatcgttct gtgaaaattc aaacaaaaat attttttcgt aaaaacactt atcaatgagt 180

aaagtaacaa ttcatgaata atttcatgta aaaaaaaaat actagaaaag gaatttttca 240

ttacgagatg cttaaaaatc tgtttcaagg tagagatttt tcgatatttc ggaaaatttt 300

gtaaaactgt aaatccgtaa aattttgcta aacatatatt gtgttgtttt ggtaagtatt 360

gacccaagct atcacctcct gcagtatgtc gtgctaatta ctggacacat tgtataacag 420

ttccactgta ttgacaataa taaaacctct tcattgactt gagaatgtct ggacagattt 480

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tttatttaaa aaatgaacct tagattatgt aacttgtgat ttatttgcgt caaaagtagg 1200

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gaaaatagac gaaagaaatt gcataaaatt ataaccgcat tattaattta ttatgatatc 1380

tattaacaat tgctattgcc tttttttcgc aaattataat cattttcata acctcgaggt 1440

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ttctcgccag atcttctcag tgggtcgcgt taccgatcac gtgatagatt ctatgaagca 1560

ctgctcttgt tagggctagt gttagcaaat tctttcaggt tgagtctgag agctcaccta 1620

cccatcggag cgtagctgga ataggctacc agctaatagg tagggaaaac aaagctcgaa 1680

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ttatgtactt tcccacaaat gtttacataa ttagaatgtt gttcaacttg cctaacgccc 1800

cagctagaac attcaattat tactattacc actactaagg cagtatgtcc taactcgttc 1860

cagatcagcg ctaacttcga ttgaatgtgc gaaatttata gctcaatatt ttagcactta 1920

tcgtattgat ttaagaaaaa attgttaaca ttttgtttca gtatgtc 1967

<210> 2

<211> 9324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

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gttgattaac tggtcgagat taaataattt aatttttggt tcttctttaa atctgtgatg 660

aaatttttta aaataacttt aaattcttca ttggtaaaaa atgccacgtt ttgcaacttg 720

tgagggtcta atatgaggtc aaactcagta ggagttttat ccaaaaaaga aaacatgatt 780

acgtctgtac acgaacgcgt attaacgcag agtgcaaagt ataagagggt taaaaaatat 840

attttacgca ccatatacgc atcgggttga tatcgttaat atggatcaat ttgaacagtt 900

gattaacgtg tctctgctca agtctttgat caaaacgcaa atcgacgaaa atgtgtcgga 960

caatatcaag tcgatgagcg aaaaactaaa aaggctagaa tacgacaatc tcacagacag 1020

cgttgagata tacggtattc acgacagcag gctgaataat aaaaaaatta gaaactatta 1080

tttaacccta gaaagataat catattgtga cgtacgttaa agataatcat gcgtaaaatt 1140

gacgcatgtg ttttatcggt ctgtatatcg aggtttattt attaatttga atagatatta 1200

agttttatta tatttacact tacatactaa taataaattc aacaaacaat ttatttatgt 1260

ttatttattt attaaaaaaa aacaaaaact caaaatttct tctataaagt aacaaaactt 1320

ttaaacattc tctcttttac aaaaataaac ttattttgta ctttaaaaac agtcatgttg 1380

tattataaaa taagtaatta gcttaactta tacataatag aaacaaatta tacttattag 1440

tcagtcagaa acaactttgg cacatatcaa tattatgctc tcgacaaata acttttttgc 1500

attttttgca cgatgcattt gcctttcgcc ttattttaga ggggcagtaa gtacagtaag 1560

tacgtttttt cattactggc tcttcagtac tgtcatctga tgtaccaggc acttcatttg 1620

gcaaaatatt agagatatta tcgcgcaaat atctcttcaa agtaggagct tctaaacgct 1680

tacgcataaa cgatgacgtc aggctcatgt aaaggtttct cataaatttt ttgcgacttt 1740

gaaccttttc tcccttgcta ctgacattat ggctgtatat aataaaagaa tttatgcagg 1800

caatgtttat cattccgtac aataatgcca taggccacct attcgtcttc ctactgcagg 1860

tcatcacaga acacatttgg tctagcgtgt ccactccgcc tttagtttga ttataataca 1920

taaccatttg cggtttaccg gtactttcgt tgatagaagc atcctcatca caagatgata 1980

ataagtatac catcttagct ggcttcggtt tatatgagac gagagtaagg ggtccgtcaa 2040

aacaaaacat cgatgttccc actggcctgg agcgactgtt tttcagtact tccggtatct 2100

cgcgtttgtt tgatcgcacg gttcccacaa tggttaattc gagctcgccc ggggatctaa 2160

ttcaattaga gactaattca attagagcta attcaattag gatccaagct tatcgatttc 2220

gaaccctcga ccgccggagt ataaatagag gcgcttcgtc tacggagcga caattcaatt 2280

caaacaagca aagtgaacac gtcgctaagc gaaagctaag caaataaaca agcgcagctg 2340

aacaagctaa acaatcgggg taccgctaga gtcgacggta ccgcgggccc gggatccacc 2400

ggtcgccacc atggtgcgct cctccaagaa cgtcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt 2460

gcgcatggag ggcaccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg 2520

cccctacgag ggccacaaca ccgtgaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt 2580

cgcctgggac atcctgtccc cccagttcca gtacggctcc aaggtgtacg tgaagcaccc 2640

cgccgacatc cccgactaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt 2700

gatgaacttc gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg 2760

ctgcttcatc tacaaggtga agttcatcgg cgtgaacttc ccctccgacg gccccgtaat 2820

gcagaagaag accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc gcgacggcgt 2880

gctgaagggc gagatccaca aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact acctggtgga 2940

gttcaagtcc atctacatgg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggctact actacgtgga 3000

ctccaagctg gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggagc agtacgagcg 3060

caccgagggc cgccaccacc tgttcctgta gcggccgcga ctctagatca taatcagcca 3120

tgcggccgcg actctagacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac 3180

acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg 3240

cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 3300

tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttaa agcttatcga 3360

tacgcgtacg gcgcgccagt cgtcgacaaa atgctctagt gttatacctt tccaaaatca 3420

ccattaatta ggtagtgttt aagcttgttg tacaaaactg ccacacgcat ttttttctcc 3480

actgtaggtt gtagttacgc gaaaacaaaa tcgttctgtg aaaattcaaa caaaaatatt 3540

ttttcgtaaa aacacttatc aatgagtaaa gtaacaattc atgaataatt tcatgtaaaa 3600

aaaaaatact agaaaaggaa tttttcatta cgagatgctt aaaaatctgt ttcaaggtag 3660

agatttttcg atatttcgga aaattttgta aaactgtaaa tccgtaaaat tttgctaaac 3720

atatattgtg ttgttttggt aagtattgac ccaagctatc acctcctgca gtatgtcgtg 3780

ctaattactg gacacattgt ataacagttc cactgtattg acaataataa aacctcttca 3840

ttgacttgag aatgtctgga cagatttggc tttgtatttt tgatttacaa atgttttttt 3900

ggtgatttac ccatccaagg cattctccag gatggttgtg gcatcacgcc gattggcaaa 3960

caaaaactaa aatgaaacta aaaagaaaca gtttccgctg tcccgttcct ctagtgggag 4020

aaagcatgaa gtaagttctt taaatattac aaaaaaattg aacgatatta taaaattctt 4080

taaaatatta aaagtaagaa caataagatc aattaaatca taattaatca cattgttcat 4140

gatcacaatt taatttactt catacgttgt attgttatgt taaataaaaa gattaatttc 4200

tatgtaattg tatctgtaca atacaatgtg tagatgttta ttctatcgaa agtaaatacg 4260

tcaaaactcg aaaattttca gtataaaaag gttcaacttt ttcaaatcag catcagttcg 4320

gttccaactc tcaagatgag agtcaaaacc tttgtgatct tgtgctgcgc tctgcaggtg 4380

agttaattat tttactatta tttcagaagg tggccagacg atatcacggg ccacctgata 4440

ataagtggtc gccaaaacgc acagatatcg taaattgtgc catttgattt gtcacgcccg 4500

ggggggctac ggaataaact acatttattt atttaaaaaa tgaaccttag attatgtaac 4560

ttgtgattta tttgcgtcaa aagtaggcaa gatgaatcta tgtaaatacc tgggcagact 4620

tgcaatatcc tatttcaccg gtaaatcagc attgcaatat gcaatgcata ttcaacaata 4680

tgtaaaacaa ttcgtaaagc atcattagaa aatagacgaa agaaattgca taaaattata 4740

accgcattat taatttatta tgatatctat taacaattgc tattgccttt ttttcgcaaa 4800

ttataatcat tttcataacc tcgaggtagc attctgttac attttaatac attggtatgt 4860

gattataaca cgagctgccc actgagtttc tcgccagatc ttctcagtgg gtcgcgttac 4920

cgatcacgtg atagattcta tgaagcactg ctcttgttag ggctagtgtt agcaaattct 4980

ttcaggttga gtctgagagc tcacctaccc atcggagcgt agctggaata ggctaccagc 5040

taataggtag ggaaaacaaa gctcgaaaca agctcaagta ataacaacat aatgtgacca 5100

taaaatctcg tggtgtatga gatacaatta tgtactttcc cacaaatgtt tacataatta 5160

gaatgttgtt caacttgcct aacgccccag ctagaacatt caattattac tattaccact 5220

actaaggcag tatgtcctaa ctcgttccag atcagcgcta acttcgattg aatgtgcgaa 5280

atttatagct caatatttta gcacttatcg tattgattta agaaaaaatt gttaacattt 5340

tgtttcagta tgtcggatcc atggtgcgct cctccaagaa cgtcatcaag gagttcatgc 5400

gcttcaaggt gcgcatggag ggcaccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg 5460

gcgagggccg cccctacgag ggccacaaca ccgtgaagct gaaggtgacc aagggcggcc 5520

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gccccgtaat gcagaagaag accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc 5820

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acctggtgga gttcaagtcc atctacatgg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggctact 5940

actacgtgga ctccaagctg gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggagc 6000

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aaataaccct tgtttcttac ttcgtcctgg atacatctat gttttttttt tcgttaataa 6120

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tttgtatgca ttttatttga atgtactagg taccgtcagg cgcgcctagg ccggccgatc 6240

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caacaatgtt tattcttacc tctaatagtc ctctgtggca aggtcaagat tctgttagaa 6360

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tcatcttcac ttacgtgatc tgatatttca ctgtcagaat cctcaccaac aagctcgtca 6540

tcgctttgca gaagagcaga gaggatatgc tcatcgtcta aagaactacc cattttatta 6600

tatattagtc acgatatcta taacaagaaa atatatatat aataagttat cacgtaagta 6660

gaacatgaaa taacaatata attatcgtat gagttaaatc ttaaaagtca cgtaaaagat 6720

aatcatgcgt cattttgact cacgcggtcg ttatagttca aaatcagtga cacttaccgc 6780

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gacggattcg cgctatttag aaagagagag caatatttca agaatgcatg cgtcaatttt 6900

acgcagacta tctttctagg gttaaaaaag atttgcgctt tactcgacct aaactttaaa 6960

cacgtcatag aatcttcgtt tgacaaaaac cacattgtgg ccaagctgtg tgacgcgacg 7020

cgcgctaaag aatggcaaac caagtcgcgc gagcgtcgac tctagaggat ccccgggtac 7080

cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 7140

caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 7200

tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 7260

cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 7320

gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 7380

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 7440

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 7500

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 7560

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 7620

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 7680

gaagcgtggc gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 7740

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 7800

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 7860

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 7920

ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 7980

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 8040

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 8100

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 8160

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 8220

ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 8280

gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 8340

tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 8400

cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 8460

ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 8520

gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 8580

caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 8640

gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 8700

ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 8760

tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 8820

caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 8880

tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 8940

cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 9000

ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 9060

aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 9120

tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 9180

gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 9240

gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 9300

ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 9324

<210> 3

<211> 10277

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3