阅读说明：本技术 一种鲤疱疹病毒ⅱ型orf72蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法 (A kind of carp herpesvirusⅡtype ORF72 Protein reconstitution rhabdovirus expression vector and preparation method thereof ) 是由 *** 栾林林 于 2019-07-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法,其是以提取的CyHV-2 cDNA为模板,扩增出ORF72基因,将扩增的ORF72基因连接至杆状病毒载体pFastBac HTA中,构建重组杆状病毒载体pFastBac HTA-CyHV-ORF72,转化至大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中,获得重组穿梭杆粒rBacmid-CyHV-ORF72,鉴定正确后将其转染至Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,并将重组杆状病毒进行传代扩增,将高滴度的含有CyHV ORF72基因的杆状病毒接到sf9昆虫细胞中进行CyHV ORF72蛋白的真核表达。选用本发明方法构建鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白重组杆状病毒表达载体,并利用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白,为鲤疱疹病毒血清学ELISA检测方法的建立奠定了基础。(The present invention provides a kind of carp herpesvirusⅡtype ORF72 Protein reconstitution rhabdovirus expression vectors and preparation method thereof, it is using the CyHV-2 cDNA of extraction as template, amplify ORF72 gene, the ORF72 gene of amplification is connected in baculovirus vector pFastBac HTA, construct recombination bacillary viral vector pFastBac HTA-CyHV-ORF72, conversion is into competent escherichia coli cell DH10Bac, obtain recombination shuttle rod granule rBacmid-CyHV-ORF72, it is transfected after identification is correct to Sf9 insect cell, obtain recombinant baculovirus, and recombinant baculovirus is subjected to passage amplification, the baculoviral containing CyHV ORF72 gene of high titre is connected to s The eukaryotic expression of CyHV ORF72 albumen is carried out in f9 insect cell.The method of the present invention is selected to construct carp herpesvirusⅡtype ORF72 Protein reconstitution rhabdovirus expression vector, and carp herpesvirusⅡtype ORF72 albumen is expressed in insect cell using recombinant baculovirus expression system, it lays a good foundation for the foundation of carp herpesviral serology ELISA detection method.)

一种鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白重组杆状病毒表达载体及其 制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术中基因重组表达领域，特别涉及一种鲤疱疹病毒Ⅱ型 ORF72蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法。

背景技术

鲫鱼是我国淡水养殖的常见鱼种，属于鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，鲫属(Carassius)。鲫鱼(Crucian carp)饲养成本低,养殖地域广, 在中国淡水养鱼上占有重要地位，其中主要养殖品种为异育银鲫(Carassius auratus gibelio)。异育银鲫具有生长快速、抗逆性强、肉质好的优点，深受人们的喜爱。然而，随着养殖规模的逐渐扩大、集约化程度的不断提高，异育银鲫的病害问题日益突出。2012年，江苏省盐城地区养殖的异育银鲫爆发了一种以“鳃出血”为主要症状的疾病，称为鲫造血器官坏死病(俗称“鳃出血病”)。该病具有发病急、传播快、死亡率高的特点，严重威胁我国异育银鲫养殖业发展。

研究发现，鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)是造成鲫造血器官坏死病的病原。该病毒隶属于疱疹病毒目(Herpesvirales)、鱼疱疹病毒科(Alloherpesviridae)、鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)，CyHV-2与分离自鲤科鱼类的另外两种病毒鲤疱疹毒1(Cyprinid herpesvirus 1,CyHV-1)和鲤疱疹病毒 3(Cyprinidherpesvirus 3,CyHV-3)亲缘关系较近，与沟鲇疱疹病毒(Ictalurid herpes-virus 1,IcHV-1)关系相对较远。CyHV-2具有鱼类疱疹病毒的一般特征。现已确认，鱼类疱疹病毒基因组含有12个核心ORF，这些编码蛋白在CyHV-1和 CyHV-3中均有分布，主要参与病毒复制、装配以及衣壳的形成等过程。其中 ORF72主要编码衣壳三聚体亚单位2，与衣壳蛋白的形成有关。

杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体，该真核表达系统的受体是昆虫细胞或活体昆虫。杆状病毒表达系统具有的相对于其他表达系统更为特殊的优势是作为表达载体的杆状病毒基因组可以容纳更多外源基因；在昆虫细胞中进行蛋白的表达，能够很好地加工修饰外源蛋白；杆状病毒一般只感染节肢动物，对人和牲畜没有迫害。杆状病毒表达系统，是一种公认的、高效率的真核表达系统，它能够对重组蛋白进行特定的翻译后修饰作用，表达产物的生物学活性十分接近于天然蛋白。

本发明通过构建含CyHV ORF72的重组杆状病毒载体，并利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白，为建立安全、可靠、适合推广的鲤疱疹病毒血清学检测方法奠定了基础。

发明内容

针对现有问题的不足，本发明的目的是提供一种鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法。利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白，为建立安全、可靠、适合推广的鲤疱疹病毒血清学检测方法奠定了基础，对防止鲤疱疹病毒的传入和控制具有重要现实意义。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

一种鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白重组杆状病毒表达载体，该重组杆状病毒表达载体的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

进一步地，其所述鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白重组杆状病毒表达载体特征包括重组修饰的昆虫杆状病毒，所述昆虫杆状病毒表面展示有鲤疱疹病毒Ⅱ型 ORF72蛋白。

所述鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。

一种鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白重组杆状病毒表达载体的制备方法，其具体制备步骤包括：(1)构建重组杆状病毒载体pFastBac HTA-CyHV-ORF72和重组穿梭杆粒rBacmid-CyHV-ORF72；和(2)在昆虫细胞中表达鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72 蛋白。

进一步地，所述步骤(1)中，构建重组杆状病毒载体pFastBac HTA-CyHV-ORF72和重组穿梭杆粒rBacmid-CyHV-ORF72的步骤为：

a、参照GenBank上公布的CyHV-2SY-C1株(Access No.KM200722.1)中ORF72 基因独立自主设计特异性引物对；

b、采用PCR技术，以提取的CyHV-2cDNA为模板扩增ORF72基因，将扩增的 PCR产物进行胶回收经EcoR I和Hind III双酶切后，通过DNA连接酶***到经同样双酶切的pFastBac HTA表达载体中，转化至E.coli DH5α感受态细胞，37℃培养，挑取菌落于氨苄抗性的培养基中培养，提取质粒，进行EcoR I和Hind III 双酶切鉴定，筛选出阳性克隆，测序鉴定正确，获得重组杆状病毒载体pFastBac HTA-CyHV-ORF72；

其中，所述特异性引物对序列为：

CyHV-ORF72-Fwd:SEQ ID NO：3；

CyHV-ORF72-Rev:SEQ ID NO：4。

其中，在上游引物CyHV-ORF72-Fwd的5’端引入EcoR 1限制性内切酶位点，在下游引物CyHV-ORF72-Rev的5’端引入Hind III限制性内切酶位点。

进一步地，所述步骤(2)中，在昆虫细胞中表达鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白的步骤为：

a、将状态较好的Sf9细胞铺于六孔板中，细胞密度约为2×10⁶/ml，将重组穿梭杆粒rBacmid-CyHV-ORF72转染至Sf9昆虫细胞，27℃培养，3～5d后离心收集上清，标记为P1代重组杆状病毒，同时设未转染的空细胞对照，将P1代重组杆状病毒液按1％的体积分数进行传代，得到P2、P3代重组杆状病毒；

b、将上述P3代重组杆状病毒上清以1％-5％体积分数接种至Sf9昆虫细胞，同时设置未接毒的空白对照，27℃培养3～4d，将细胞裂解后离心收集CyHV ORF72 重组蛋白；

c、将细胞裂解后离心收集的CyHV ORF72重组蛋白进行Western Blotting分析。

进一步地，所述步骤b中，是将P3代重组杆状病毒上清以2％的体积分数接种sf9昆虫细胞单层，进行鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白的真核表达。

有益效果

本发明利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72 蛋白，为建立安全、可靠、适合推广的鲤疱疹病毒血清学检测方法奠定了基础，对防止鲤疱疹病毒的传入和控制具有重要现实意义。

附图说明

图1为设计的特异性引物，以提取的CyHV-2cDNA为模板，扩增出ORF72 基因的PCR产物结果；

图2为重组供体质粒pFastBac HTA-CyHV-ORF72的EcoR I和Hind III双酶切鉴定图谱，其中M为DL10,000DNA Marker，1为重组阳性质粒pFastBac HTA-CyHV-ORF72的EcoR 1和Hind III双酶切鉴定结果；

图3为转染实验结果，其中A为转染了重组杆状病毒的Sf9昆虫细胞，B为正常的Sf9昆虫细胞；

图4为Western Blotting检测的鉴定结果，其中M为蛋白Marker，1为未转染重组杆状病毒的昆虫细胞裂解物，2为转染重组杆状病毒的昆虫细胞裂解物。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。

实施例1：构建含CyHV ORF72基因的重组杆状病毒载体及重组穿梭杆粒 rBacmid-CyHV-ORF72的获得。

1.1根据GenBank上CyHV-2SY-C1株(Access No.KM200722.1)中ORF72基因设计引物，以提取的CyHV-2cDNA为模板扩增出ORF72基因，其中上游引物ORF72加入EcoR 1限制性内切酶位点后序列为： 下游引物加入HindIII酶切位点后序列为：划线部分为酶切位点，以提取的CyHV-2cDNA为模板，扩增出ORF72的全长基因，约1113bp，与预期大小相符。PCR结果如图1所示。

1.2构建重组杆状病毒载体pFastBac HTA-CyHV-ORF72。

扩增的PCR产物进行胶回收经EcoR I和Hind III双酶切后，通过DNA连接酶***到经同样双酶切的pFastBac HTA表达载体中，转化至E.coli DH5α感受态细胞，37℃培养，挑取菌落于氨苄抗性的培养基中培养，提取质粒，进行EcoR I和Hind III双酶切鉴定，筛选出阳性克隆，进行测序鉴定，获得重组杆状病毒载体pFastBac HTA-CyHV-ORF72。双酶切鉴定结果如图2所示。

1.3重组供体质粒pFastBac HTA-CyHV-ORF72转化至含有穿梭载体Bacmid 的E.coliDH10Bac中，37℃条件下震荡培养4h，涂布于含X-gal、IPTG、及四环素、卡那霉素、庆大霉素的LB琼脂平板上，37℃培养48h，经2次蓝白斑筛选并挑取单个白色菌落于含四环素、卡那霉素、庆大霉素的LB培养液中进行扩大培养，提取重组穿梭杆粒rBacmid-CyHV-ORF72并以之为模板，进行PCR鉴定。

实施例2：在昆虫细胞中表达鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白。

2.1转染昆虫细胞

(1)将生长良好的Sf9昆虫细胞，取2mL计数约为2×10⁶个细胞加到六孔板中，细胞贴壁3小时；

(2)准备两个1.5mL灭菌离心管，做好标记，一个离心管中加入 5μL Bacmid-CyHV-ORF72和100μL的不含抗生素和FBS的Grace培养基，轻轻混匀；另一个离心管中6μL的Cellfectin Reagent和100μL的不含抗生素和FBS 的Grace培养基，将其混匀；CellfectinReagent是脂溶性的，长时间放置会出现沉淀，用之前最好要振摇均匀；

(3)将两个管中的溶液混合，置于室温下抚育45min；

(4)加入800μL的Grace培养基；然后将六孔板中Grace培养基去掉，并用 Grace培养基(不含抗生素和FBS)轻轻地清洗一次，弃去；向六孔板中加入混合好的溶液。设置一个空白对照；置于28℃培养5h；

(5)去掉六孔板中的溶液，加入Grace完全培养基(含抗生素和FBS)，置于28℃细胞培养箱中培养3-5d；3～5d后收集上清为P1，标记为P1代重组病毒，同时设空细胞对照；将P1代重组病毒液按1％的体积分数进行传代，得到P2、P3代重组病毒。

2.2将上述P3代重组杆状病毒上清以1％-5％体积分数接种sf9昆虫细胞单层，27℃培养72～96h，同时设置未接毒的空白对照，细胞裂解后离心收集鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72重组蛋白。

2.3进行Western Blotting检测，将上述细胞裂解产物进行SDS-PAGE，电泳产物转印至硝酸纤维素膜，用ORF72阳性血清作为一抗，以AP标记的羊抗鼠 IgG作为二抗，经DNppNa显色，观察特异性条带。鉴定结果如图4所示。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

序列表

<110> 盐城工学院

<120> 一种鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaattcatgt acggcttaaa caacgcgcaa ggattcatcg ataccgaatg gatcgacagg 60

cagagtatcg ccatgaccgc ccaggagacc agcagactgt tgaacccgta ccttgccacc 120

aagggacagc gggtcgatcc gtctaacttg tacattcccg acggtatctt tgtgacttac 180

acgcctactg gaccagaccc cggagtggcg cacggtggcg gttactatta cagaccttcg 240

ctgcagggtt tcggctctat gatggacgag gcggatacgt tggacgatct gcaggccaac 300

gttctgtata gcaatcaggg tcagtggacg agactggcgt tgtgcggtct ggccaacacg 360

gccaactacc ccatcgatct gtacgaccag aaggacacca agtacagaat catcaacacc 420

ggggccgagc ctctgcactc tggcgacgcg tttgtggttg aaccgccatc ggtggaggct 480

tcaaaggcgc aggtggacag catgaaaaac aacaccatca gagccgaggg ttccttcaga 540

ccggataaca tggctctggg aggctacccg gccaccaaca gagtaccctc tgaactgacg 600

caccgcatga aacacgttat ggcccgagac attggcatgt gcgtcgacct agtacagtct 660

ggtagcagcg gcatgtctca gggtatctcg cggctgtaca atacacagac cgagctcgga 720

cagagcgtca agaacactgt gatggcaacc accctcgacg ctttggacag catcagcgtc 780

ctcttggtca tgatgaaaag ggtagcctct ctacccaccc cggtcctccg tatctttggg 840

gactattaca atttcaaaca caacaagggc caattggacc catccgtcct gatcgagatc 900

tggaaaaacc cagccgtcgc cgatctcttt atggactcta tggactttgg catgaaatcc 960

atccaccgac tcaaaaacgg tacctacggc tctgccatca aatccacaga agccaacccc 1020

acatcgatga gaggagaagt catgtacaac gcttacggcg gtcaatacct cacaggggac 1080

accttcgagg gcatcataca ttcattcaac ggcctctaaa agctt 1125

<210> 2

<211> 370

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Tyr Gly Leu Asn Asn Ala Gln Gly Phe Ile Asp Thr Glu Trp Ile

1 5 10 15

Asp Arg Gln Ser Ile Ala Met Thr Ala Gln Glu Thr Ser Arg Leu Leu

20 25 30

Asn Pro Tyr Leu Ala Thr Lys Gly Gln Arg Val Asp Pro Ser Asn Leu

35 40 45

Tyr Ile Pro Asp Gly Ile Phe Val Thr Tyr Thr Pro Thr Gly Pro Asp

50 55 60

Pro Gly Val Ala His Gly Gly Gly Tyr Tyr Tyr Arg Pro Ser Leu Gln

65 70 75 80

Gly Phe Gly Ser Met Met Asp Glu Ala Asp Thr Leu Asp Asp Leu Gln

85 90 95

Ala Asn Val Leu Tyr Ser Asn Gln Gly Gln Trp Thr Arg Leu Ala Leu

100 105 110

Cys Gly Leu Ala Asn Thr Ala Asn Tyr Pro Ile Asp Leu Tyr Asp Gln

115 120 125

Lys Asp Thr Lys Tyr Arg Ile Ile Asn Thr Gly Ala Glu Pro Leu His

130 135 140

Ser Gly Asp Ala Phe Val Val Glu Pro Pro Ser Val Glu Ala Ser Lys

145 150 155 160

Ala Gln Val Asp Ser Met Lys Asn Asn Thr Ile Arg Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Phe Arg Pro Asp Asn Met Ala Leu Gly Gly Tyr Pro Ala Thr Asn Arg

180 185 190

Val Pro Ser Glu Leu Thr His Arg Met Lys His Val Met Ala Arg Asp

195 200 205

Ile Gly Met Cys Val Asp Leu Val Gln Ser Gly Ser Ser Gly Met Ser

210 215 220

Gln Gly Ile Ser Arg Leu Tyr Asn Thr Gln Thr Glu Leu Gly Gln Ser

225 230 235 240

Val Lys Asn Thr Val Met Ala Thr Thr Leu Asp Ala Leu Asp Ser Ile

245 250 255

Ser Val Leu Leu Val Met Met Lys Arg Val Ala Ser Leu Pro Thr Pro

260 265 270

Val Leu Arg Ile Phe Gly Asp Tyr Tyr Asn Phe Lys His Asn Lys Gly

275 280 285

Gln Leu Asp Pro Ser Val Leu Ile Glu Ile Trp Lys Asn Pro Ala Val

290 295 300

Ala Asp Leu Phe Met Asp Ser Met Asp Phe Gly Met Lys Ser Ile His

305 310 315 320

Arg Leu Lys Asn Gly Thr Tyr Gly Ser Ala Ile Lys Ser Thr Glu Ala

325 330 335

Asn Pro Thr Ser Met Arg Gly Glu Val Met Tyr Asn Ala Tyr Gly Gly

340 345 350

Gln Tyr Leu Thr Gly Asp Thr Phe Glu Gly Ile Ile His Ser Phe Asn

355 360 365

Gly Leu

370

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgaattcatg tatggcttga ataacgc 27

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caagctttta gagaccgttg aatgaatg 28