阅读说明：本技术 一种长效稳定表达的杆状病毒载体及其构建方法 (Long-acting stably expressed baculovirus vector and construction method thereof ) 是由 王志昇 杨萌萌 李梦婷 姬勇敢 杨文� 陈健茂 于 2019-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种重组杆状病毒载体及其构建方法,所述重组杆状病毒载体包含SB转座子和编码衰减加速因子(DAF)的基因,所述构建方法包含将SB转座子和编码衰减加速因子(DAF)的基因克隆至杆状病毒载体的步骤。本发明构建的重组杆状病毒表达系统,能够实现外源蛋白的长效、稳定表达。利用本发明构建的重组杆状病毒表达系统在小鼠体内表达hEA(内皮抑素和血管抑素的融合蛋白),显著提高了荷瘤小鼠的寿命和存活率。本发明的重组杆状病毒表达系统还能有效抵抗血清补体系统的攻击,还能同时借助SB转座系统表达EGFP等荧光蛋白,便于在哺乳动物细胞中持续观察荧光的表现。(The present invention relates to a recombinant baculovirus vector comprising an SB transposon and a gene encoding a Decay Accelerating Factor (DAF), and a method for constructing the same, comprising the step of cloning the SB transposon and the gene encoding the Decay Accelerating Factor (DAF) into the baculovirus vector. The recombinant baculovirus expression system constructed by the invention can realize long-acting and stable expression of the foreign protein. The recombinant baculovirus expression system constructed by the invention expresses hEA (fusion protein of endostatin and angiostatin) in a mouse body, and the service life and the survival rate of the tumor-bearing mouse are obviously improved. The recombinant baculovirus expression system can effectively resist the attack of a serum complement system, and can express fluorescent proteins such as EGFP and the like by virtue of an SB transposition system, thereby facilitating the continuous observation of the fluorescent expression in mammalian cells.)

一种长效稳定表达的杆状病毒载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程学技术领域，尤其涉及一种能够长效、稳定表达外源基因的杆状病毒载体的构建方法。

背景技术

近年来，杆状病毒作为基因传递载体用于基因治疗成为了研究的热点。杆状病毒较其他病毒如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等具有独特的优点，如对人类和哺乳动物不引起致病，能在I级生物安全实验室进行操作；在哺乳动物细胞中复制缺陷，没有预先存在的抗体；低的细胞毒性；能容纳大片段外源基因***；重组病毒的构建及纯化操作简单。此外，杆状病毒除了能实现有效的基因传递，还被证明可以刺激哺乳动物细胞产生抗病毒免疫反应，抵抗病毒的攻击以及抵抗肿瘤的生长转移。然而杆状病毒一些固有的缺陷限制了其进一步的应用。例如，杆状病毒表达外源基因水平低，导致重组蛋白的生产成本高，限制了其市场化应用；杆状病毒不能在哺乳动物细胞中复制，随着时间的增加，基因组逐渐降解，导致无法长期有效的表达目的基因，限制了其作为基因治疗载体的进一步应用；哺乳动物体内存在补体，补体是先天免疫反应的组成部分，可导致杆状病毒被清除，转导效率急剧下降；杆状病毒表达蛋白具有特异性，不同类型蛋白的表达水平差异很大，尤其是跨膜蛋白和糖蛋白的稳定高水平表达更是困难。上述缺陷导致杆状病毒在实际应用中难以长效、稳定的表达外源蛋白，限制了杆状病毒系统的实际应用。

为了提高杆状病毒的表达时间或表达稳定性，研究人员已经在多个方向做出尝试。例如，选择脑、眼睛和睾丸等不能产生天然免疫反应的免疫赦免位点作为基因运输的转导位点；体外转导避免杆状病毒与血清补体的接触；使用补体的药理抑制剂灭活补体；转入衰减加速因子(DAF)、膜辅助因子蛋白(MCP)、CD59等补体调节蛋白基因以抑制补体；利用化学方式对杆状病毒进行表面加工；引入长效表达转座子；选择低感染复数(MOI)的杆状病毒进行感染以减少缺损干扰(DI)的产生；删除p94基因中的non-hr DNA复制原点以提高基因组稳定性；删除不需要的病毒基因以容纳更多外源基因并增加其产量。然而，在上述策略中，免疫赦免位点转导和体外转导的方法限制了其临床应用的范围，药理抑制剂的潜在副作用仍然有待于进一步的评估，DAF等补体调节蛋白作为跨膜蛋白在杆状病毒中的表达水平和表达时间都十分有限，化学修饰加工需要在批次稳定性和病毒感染力方面做许多优化工作。因此，仍然存在开发新的能够实现外源蛋白长效、稳定表达的杆状病毒载体系统的需求。

发明内容

针对现有杆状病毒载体的缺陷，本发明提供一种能够长效、稳定表达外源蛋白的新的杆状病毒载体，本发明基于发明人意想不到的发现，即在尝试了各种提高杆状病毒载体表达时间和表达稳定性的手段后，发现在将SB转座子(“睡美人”转座系统)转入杆状病毒载体，并使所述病毒能够表达DAF蛋白后，其对外源蛋白的表达时间和稳定性都有显著提高。

为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面提供一种重组杆状病毒载体，所述重组杆状病毒载体包含SB转座子和编码衰减加速因子(DAF)的基因。

本发明另一方面提供重组杆状病毒载体的构建方法，所述方法包含将SB转座子和编码衰减加速因子(DAF)的基因克隆至杆状病毒载体的步骤。

为了便于对表达情况进行观察，还可以在重组杆状病毒载体中引入编码标签蛋白的基因。优选地，所述标签蛋白选自荧光蛋白、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、6×His标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Flag标签蛋白(DYKDDDDK)、SUMO标签蛋白和C-Myc标签蛋白；更优选地，所述标签蛋白选自绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、蓝绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。

本发明的重组杆状病毒载体可包含外源基因，通过将外源基因克隆至杆状病毒载体，实现该外源基因的长效、稳定表达。所述外源基因是想要利用重组杆状病毒表达系统生产的目标外源基因，例如编码重组多肽、重组蛋白的基因。

在可选的实施方式中，所述外源基因为内皮抑素(Endostatin)基因和/或血管抑素(angiostatin)基因；优选地，所述外源基因为包含人内皮抑素(Endostatin)和血管抑素(angiostatin)的融合基因(hEA)。

本发明还提供含有本发明的重组杆状病毒载体的细胞。所述细胞可通过使用本发明的重组杆状病毒载体转染细胞获得。

本发明还提供所述重组杆状病毒载体制备的病毒。所述病毒可通过使用本发明的重组杆状病毒载体转染细胞制备获得。

本发明还提供所述重组杆状病毒载体或者所述细胞在制备重组蛋白或重组多肽中的应用；优选地，所述重组蛋白或重组多肽为药物蛋白或药物多肽。

本发明的重组杆状病毒载体可应用于基因治疗；本发明的重组杆状病毒载体还可用于制备基因治疗的药物。

本发明的重组杆状病毒载体是一种表面展示系统，可在病毒粒子表面和/或细胞表面展示DAF蛋白和/或目标外源蛋白。

在一个具体的可选实施方式中，本发明的重组杆状病毒载体的构建方法可包含如下步骤：

①pBacSC-CE质粒的构建

以杆状病毒穿梭质粒(例如pFastBacTMDUAL(Invitrogen,USA))为骨架，在p10启动子下游***融合读码框GP64 SP-His6-MCS-GP64 TM-GP64 CTD(简称SC片段)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1；同时在pPh启动子下游***CMV-EGFP-SV40 PA表达元件，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2，经PCR和测序鉴定正确的质粒命名为pBacSC-CE。

②pBacSC-SB-T2CE质粒的构建

从质粒pCMV(CAT)T7-SB100(Addgene,Cambridge,MA,USA)中扩增pCMV-SB100X-SV40 PA表达元件，其核苷酸序列为SEQ ID NO.4，然后将其***pBacSC-CE质粒相应位点中，经PCR鉴定正确的质粒命名为pBacSC-SB100X；以质粒pBacSC-CE为模板，扩增pCMV-EGFP-SV40 PA表达元件，然后将其***pT2/HB质粒(Addgene,Cambridge,MA,USA)相应的位点中，经PCR鉴定正确的质粒命名为pT2/HB-CE；以质粒pT2/HB-CE为模板，扩增IR/DR-pCMV-EGFP-SV40 PA-IR/DR表达元件，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5，然后将其***pBacSC-SB100X质粒相应的位点中，经PCR和测序鉴定正确的重组质粒命名为pBacSC-SB-T2CE。

③pBacSC-DAF-SB-T2CE质粒的构建

将DAF基因(优选地，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3)***质粒pBacSC-SB-T2CE相应位点中，经PCR和测序鉴定正确的重组质粒命名为pBacSC-DAF-SB-T2CE。优选地，所述DAF基因可从质粒pMD-CD55(北京义翘神州)中扩增获得。

以上质粒的构建模式图如图1所示。

在一个具体的可选实施方式中，含有目标外源基因的重组杆状病毒载体的构建方法可包含将目标外源基因***质粒pBacSC-DAF-SB-T2CE相应位点中的步骤。

本发明的重组杆状病毒可通过如下方法获得：

按照Bac-to-Bac(Invitrogen)表达系统说明书，将鉴定正确的重组质粒(例如pBacSC-CE、pBacSC-SB-T2CE和pBacSC-DAF-SB-T2CE、***了目标外源基因的pBacSC-DAF-SB-T2CE)转化大肠杆菌感受态细胞(优选DH10Bac)，经过“三抗”LB平板筛选，获得阳性克隆，提取病毒Bacmid，利用脂质体转染试剂(优选脂质体2000试剂)转染昆虫细胞(优选Sf-9细胞)，获得重组杆状病毒，通过感染昆虫细胞(优选Sf-9细胞)完成病毒量的扩增。获得的病毒可分别命名为BacSC-CE、BacSC-SB-T2CE和BacSC-DAF-SB-T2CE。

在一个具体的可选实施方式中，DAF蛋白的表达及在Sf-9细胞表面的展示可通过如下方式：

收集病毒感染的细胞，经碱裂解处理后，通过Western blot检测DAF蛋白是否在Sf-9细胞中得到表达；然后通过激光共聚焦显微镜进一步检测表达的DAF蛋白是否展示在Sf-9细胞表面。

在一个具体的可选实施方式中，DAF蛋白在重组杆状病毒中的表达可通过如下方式：

收集病毒感染的细胞上清，经超速离心纯化后，通过Western blot检测DAF蛋白在杆状病毒中的表达情况。

在一个具体的可选实施方式中，重组病毒对血清补体系统敏感性研究可通过如下方式：

制备小鼠和人血清，将10MOI重组病毒分别与0、20％、40％、60％、80％、100％的小鼠和人血清在37℃共孵育1h，然后转导人血管内皮细胞HUVECs，24h后通过流式细胞术检测EGFP+％的表达情况。

在一个具体的可选实施方式中，重组病毒在哺乳动物体外表达效率研究可通过如下方式：

将重组病毒转导人血管内皮细胞HUVECs和人肝癌细胞HepG2，连续传代，通过倒置荧光显微镜观察不同时间点EGFP的表达情况，并收集转导后不同时间点的细胞，通过流式细胞术测定EGFP+％的表达率以及EGFP总荧光强度(TFI)。

在一个具体的可选实施方式中，重组病毒在哺乳动物体内表达效率研究可通过如下方式：

建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型，当肿瘤体积达到100mm³时，将重组病毒注射入瘤内，分别于注射后的1，3，5和15天脱颈处死动物，采集肿瘤样本，制作石蜡切片，通过免疫组织荧光试验观察EGFP在瘤内的表达情况。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明构建的重组杆状病毒表达系统，能够实现外源蛋白的长效、稳定表达，使得原本在第9天就无法表达的外源蛋白，能够持续、稳定地表达至少50天以上，表达时间和表达水平得到了出乎意料的提高。利用本发明构建的重组杆状病毒表达系统在小鼠体内表达hEA(内皮抑素和血管抑素的融合蛋白)，显著抑制了荷瘤小鼠肿瘤的发展并提高了小鼠的存活率，在试验结束时，小鼠的肿瘤体积远远小于对照组，存活率达到了100％，而对照组分别为0％和33.3％。本发明的重组杆状病毒表达系统还能有效抵抗血清补体系统的攻击，还能同时借助SB转座系统表达EGFP等荧光蛋白，便于在哺乳动物细胞中持续观察荧光的表现。传统杆状病毒滴度测定要用噬斑实验，操作繁琐，鉴别较困难，而本发明的杆状病毒构建中采用终点稀释法，可以非常方便的测定病毒的滴度。本发明的成果将建立杆状病毒作为基因传递载体的新技术平台，同时也为进一步利用该载体进行肿瘤基因治疗提供了技术平台。

附图说明

为了更清楚地说明本发明

具体实施方式

或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为质粒构建模式图；

图2-1为pBacSC-CE重组质粒PCR鉴定结果；

图2-2为pBacSC-DAF-CE重组质粒PCR鉴定结果；

图2-3为pBacSC-SB-T2CE重组质粒PCR鉴定结果；

图2-4为pBacSC-DAF-SB-T2CE重组质粒PCR鉴定结果；

图3-1为BacSC-DAF-CE重组病毒Bacmid DNA PCR鉴定结果；

图3-2为BacSC-SB-T2CE重组病毒Bacmid DNA PCR鉴定结果；

图3-3为BacSC-DAF-SB-T2CE重组病毒Bacmid DNA PCR鉴定结果；

图4为Western blot检测DAF蛋白的表达；

图5为激光共聚焦显微镜观察DAF蛋白在Sf-9细胞膜上的表现；

图6为不同浓度小鼠血清对重组病毒感染HUVECs细胞效率的影响；

图7为不同浓度人血清对重组病毒感染HUVECs细胞效率的影响；

图8为倒置荧光显微镜观察重组病毒在不同哺乳动物细胞中的表达(400×)；

图9为重组病毒转导HUVECs细胞EGFP阳性率(eGFP+％)和总荧光强度(TFI)的表达随时间变化；

图10为免疫组织荧光检测不同重组病毒在体内动物肿瘤模型中EGFP的表达效率；

图11为重组杆状病毒质粒的构建及介导的hEA蛋白的表达；

图12为重组杆状病毒介导的hEA蛋白的抗血管生成活性；

图13为重组杆状病毒介导的hEA抗肿瘤效果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1能够长效、稳定表达的杆状病毒载体的构建方法及其功能验证

(一)重组质粒的构建

1.pBacSC-CE质粒的构建

设计引物SC-F/SC-R，从质粒PUC57-SC(本实验室保存，即在PUC57质粒中转入SEQID NO.1所示的SC片段)中扩增SC片段，即GP64 SP-His6-MCS-GP64 TM-GP64 CTD表达元件，然后将该元件***质粒pFastBac^TMDUAL(Invitrogen)p10启动子下游相应位点中，同时在该质粒pPh启动子下游***CMV-EGFP片段，该片段从质粒pEGFP-C1(Clontech)中双酶切获得。经PCR和测序鉴定正确的质粒命名为pBacSC-CE。

相关的引物序列、酶切位点及扩增片段和大小如表1所示，重组质粒pBacSC-CEPCR鉴定结果如图2-1所示，SC片段的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，CMV-EGFP-SV40 PA表达元件的核苷酸序列见SEQ ID NO.2。

表1杆状病毒载体构建相关引物序列及扩增片段信息

2.pBacSC-DAF-CE质粒的构建

以含有人CD55/DAF全长基因的pMD-CD55质粒(北京义翘神州)为模板，设计引物DAF-F/DAF-R(序列见表1)，用于扩增全长DAF基因，然后将DAF基因***pBacSC-CE质粒SC片段中的相应MCS位点，经PCR和测序鉴定正确的质粒命名为pBacSC-DAF-CE。重组质粒pBacSC-DAF-CE PCR鉴定结果如图2-2所示，DAF的核苷酸序列见SEQ ID NO.3。

3.pBacSC-SB100X质粒的构建

设计引物CMV-SB-SV-F/CMV-SB-SV-R(引物序列见表1)，从质粒pCMV(CAT)T7-SB100(Addgene,Cambridge,MA,USA)中扩增pCMV-SB100X-SV40 PA表达元件，其核苷酸序列见SEQ ID NO.4，然后按照

Ultra One Step Cloning Kit说明书方法将pCMV-SB100X-SV40PA与pBacSC-CE进行同源重组，经PCR鉴定正确的重组质粒命名为pBacSC-SB100X。

4.pT2/HB-CE质粒的构建

以质粒pBacSC-CE为模板，设计引物CE-SV-F/R(序列见表1)，用于扩增pCMV-EGFP-SV40 PA表达元件，然后将PCR产物与经Eco RV和Bgl II双酶切后的pT2/HB质粒(Addgene,Cambridge,MA,USA)按照

Ultra One Step Cloning Kit说明书方法进行同源重组，经PCR鉴定正确的重组质粒命名为pT2/HB-CE。

5.pBacSC-SB-T2CE质粒的构建

设计引物IR/DR-CE-F/R(序列见表1)，从质粒pT2/HB-CE中扩增IR/DR-pCMV-EGFP-SV40 PA-IR/DR表达元件，其核苷酸序列见SEQ ID NO.5，然后将其PCR产物与经Not I和AvrII双酶切后的pBacSC-SB100X质粒按照

Ultra One Step Cloning Kit说明书方法进行同源重组，经PCR和测序鉴定正确的重组质粒命名为pBacSC-SB-T2CE。pBacSC-SB-T2CE质粒的PCR鉴定结果如图2-3所示。

6.pBacSC-DAF-SB-T2CE质粒的构建

如前所述，将DAF基因***pBacSC-SB-T2CE质粒SC片段中的相应MCS位点中，经PCR和测序鉴定正确的重组质粒命名为pBacSC-DAF-SB-T2CE，其质粒PCR鉴定结果如图2-4所示，DAF的核苷酸序列见SEQ ID NO.3。

(二)重组杆状病毒的获得

按照Bac-to-Bac(Invitrogen)表达系统说明书完成重组病毒的收获。方法如下：将经PCR和测序鉴定正确的重组质粒pBacSC-CE、pBacSC-DAF-CE、pBacSC-SB-T2CE和pBacSC-DAF-SB-T2CE转化大肠杆菌感受态细胞DH10Bac，经过“三抗”(含有Kan(50μg/mL)、Tet(10μg/mL)和Gm(7μg/mL)三种抗生素以及X-Gal和IPTG)LB平板筛选，挑取白色菌落，经过夜摇菌扩增后，提取病毒Bacmid DNA进行PCR鉴定，结果如图3-1至3-3所示。将鉴定正确的重组Bacmid DNA利用脂质体2000试剂转染Sf-9细胞，4～5d后收获细胞上清，500g离心10min，上清作为P1代毒分装待用。为了提高病毒滴度，用0.1MOI病毒继续感染Sf-9细胞直至收获P3代毒为止。获得的病毒分别命名为BacSC-CE、BacSC-DAF-CE、BacSC-SB-T2CE和BacSC-DAF-SB-T2CE。

病毒的滴度通过终点稀释法进行测定。在本例中，以病毒BacSC-CE为例描述滴度的测定方法，其它病毒滴度的测定方法一致。具体方法为：通过观察接种病毒后细胞发荧光的情况，可以间接的测定病毒的滴度。假设某一稀释倍率的病毒感染的细胞发荧光，则低于此稀释倍率的细胞也会发荧光，相反高于此稀释倍率的病毒，细胞则不会发荧光。基于先前的假设可将较低稀释倍率未发荧光的细胞孔数目迭加至较高稀释倍率未发荧光的细胞孔中，同理将较高稀释倍率发荧光的细胞孔数目迭加到较低稀释倍率发荧光孔数中。BacSC-CE接种后细胞发荧光结果如表2所示，利用Reed-Muench氏法计算TCID₅₀。

表2重组杆状病毒滴度测定

lgTCID_50＝高于50％病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数＝-7+0.2×(-1)＝-7.2

则TCID₅₀＝10^-7.2，即把病毒稀释到10^-7.2梯度后取100μL所含的病毒的量为1个TCID₅₀。那么病毒原液中取100μL所含的病毒的量为10^7.2个TCID₅₀，则每毫升病毒原液中含有1.58×10⁸TCID₅₀/mL。由于TCID₅₀×0.69＝PFU，所以本实验中的病毒滴度也可表示为1.09×10⁸PFU/mL。

采用以上方法，对各病毒的滴度进行了测试，结果如表3所示。

表3重组杆状病毒的滴度(P3代毒)

(三)Western blot检测DAF蛋白的表达

收获P3代病毒BacSC-DAF-CE和BacSC-DAF-SB-T2CE感染72h的昆虫Sf-9细胞，1500rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀用1mL 0.01mol/L PBS洗涤3次，加入RIPA细胞裂解液300μL，1mmol/L PMSF(贮存液为100mmol/L)3μL，轻轻混匀，于室温下作用5min，放置冰上约20min，然后加入5×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，煮沸10min，12000rpm离心10min，取上清，进行Western blot检测，以上过程以阴性杆状病毒BacSC-CE感染的Sf-9细胞和正常Sf-9细胞作为对照，进行相同实验方法处理。为了进一步检测DAF蛋白在重组病毒中的表达，收获病毒感染的细胞培养物，反复冻融3次，4℃、10000×g离心30min，除去细胞及细胞碎片，收集上清液，4℃、36000×g离心4h，弃上清，沉淀用适量PBS重悬，然后按照上述的方法进行Western blot检测。第一抗体为兔抗DAF抗体，第二抗体为HRP标记羊抗兔IgG。结果如图4所示，不管是BacSC-DAF-CE和BacSC-DAF-SB-T2CE感染Sf-9细胞组还是纯化后的BacSC-DAF-CE和BacSC-DAF-SB-T2CE，都可以在分子量大约70kDa处看到一条明显的蛋白条带，这和预测的DAF蛋白大小一致，而BacSC-CE和Sf-9正常细胞对照组没有检测到相应的蛋白条带。说明DAF蛋白在重组病毒BacSC-DAF-CE和BacSC-DAF-SB-T2CE中获得了表达。

(四)激光共聚焦显微镜观察DAF蛋白在Sf-9细胞膜上的表现

为了证明带有组氨酸His6标签的融合蛋白DAF是否展示在昆虫细胞的细胞膜上，将P3代毒BacSC-CE、BacSC-DAF-CE和BacSC-DAF-SB-T2CE感染的Sf-9细胞接种于30mm共聚焦专用培养皿内，27℃培养箱内培养2d，然后弃去培养基，用1mL预冷的甲醇:丙酮(1:1,V/V)于-20℃固定5min，用PBS清洗2次，用含20g/L BSA的PBS 37℃下封闭30min，然后分别用鼠抗His6单克隆抗体和兔抗DAF抗体37℃孵育1h，结束后用PBS洗涤3次，再加入罗丹明标记的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG在37℃孵育1h，结束后进行共轭聚焦显微镜分析。结果如图5所示，用His6单抗检测，BacSC-CE、BacSC-DAF-CE和BacSC-DAF-SB-T2CE感染的细胞都可以在细胞膜上看到一圈红色荧光，而用DAF抗体检测，只能在BacSC-DAF-CE和BacSC-DAF-SB-T2CE感染的细胞膜上看到荧光，而在BacSC-CE感染的细胞膜上则看不到任何荧光，证明DAF蛋白展示在了感染的昆虫细胞膜上。

(五)重组杆状病毒对血清补体系统敏感性研究

为了证明表面展示DAF蛋白的杆状病毒是否具有抗血清补体灭活的功效，将10MOI的重组病毒BacSC-DAF-CE、BacSC-DAF-SB-T2CE和BacSC-CE分别于不同浓度的ICR小鼠血清或人血清(0％、20％、40％、60％、80％、100％)在37℃共孵育1h，然后在各混合液中加入Sf-9细胞培养液，使其与DMEM(不含碳酸氢钠)培养液的体积比为1:4，混匀后，将其加入6孔板已铺好的人血管内皮细胞HUVECs中，于27℃摇床孵育6h，随后用DMEM完全培养基取代原有混合液，于37℃继续培养24h，第二天收集细胞通过流式细胞术检测EGFP⁺％的表达情况。结果如图6和7所示，不管是小鼠血清还是人血清，随着血清浓度的增加，重组病毒的转导效率逐渐降低；经统计分析，当小鼠血清浓度达到40％和60％时或人的血清浓度达到20％、40％、60％和80％，表面展示DAF组(BacSC-DAF-SB-T2CE和BacSC-DAF-CE)与对照组(BacSC-CE)相比，eGFP+％的表达效率明显增高(P＜0.05)。由此可见，血液中的补体系统能够降低杆状病毒在哺乳动物细胞中的表达效率，而表面展示DAF蛋白的杆状病毒可以有效地抵抗血清补体系统的灭活作用。

(六)重组杆状病毒在哺乳动物体外表达效率研究

为了验证重组病毒BacSC-DAF-SB-T2CE在哺乳动物细胞内是否能长效表达，将重组病毒BacSC-DAF-SB-T2CE和BacSC-DAF-CE分别转导HUVECs和HepG2细胞(MOI 100)，转导后每隔3d在倒置荧光显微镜下观察细胞的荧光表现，并拍照，结果如图8所示，重组病毒BacSC-DAF-SB-T2CE可明显延长EGFP在HUVECs和HepG2细胞中的表达时间(>90天)，而重组病毒BacSC-DAF-CE在哺乳动物细胞中EGFP的表达随着时间的增加荧光强度越来越弱(<15天)。进一步通过流式细胞仪检测EGFP阳性细胞百分比及总荧光强度(TFI)。结果如图9所示，在重组病毒感染细胞15d后，BacSC-DAF-CE组已检测不到荧光信号，而BacSC-DAF-SB-T2CE组荧光信号能持续检测到(TFI≈10⁹a.u.，EGFP⁺％≈10％)。结果表明，SB转座子可有效延长外源基因在哺乳动物细胞中长久持续稳定的表达。

(七)重组病毒在哺乳动物体内表达效率研究

取4～6周雄性BALB/c裸鼠，给每只小鼠左背部皮下注射0.1ml HepG2细胞悬液(浓度为2.0×10⁶细胞/ml)，每2天测量一次肿瘤的体积，当体积达到100mm³时，将0.2ml，1×10⁸pfu的重组病毒注射入瘤内，分别于注射后的1、3、5和15天脱颈处死动物，采集肿瘤标本，制作石蜡切片，通过EGFP兔多克隆抗体4℃过夜孵育和Cy3标记的羊抗兔IgG室温孵育1h后，再通过DAPI复染，在正置荧光显微镜下观察EGFP在瘤内的表达情况。结果如图10所示，在瘤内注射1d后，BacSC-DAF-CE组比对照BacSC-CE组表现出了更强的转导效率，在第3d的时候，BacSC-CE组基本上看不到绿色荧光蛋白的表达，而BacSC-DAF-CE组仍有大量的绿色荧光可以看到；更值得注意的是，BacSC-DAF-SB-T2CE组比BacSC-DAF-CE组显示出更强的转导效率，在注射后第15d的时候仍有大量绿色荧光蛋白表达，而BacSC-DAF-CE组基本已看不到荧光蛋白的表达。这些结果表明，BacSC-DAF-SB-T2CE在体内能够有效的延长转基因的表达持续时间以及增强补体灭活的抵抗力。

实施例2能够长效、稳定表达的杆状病毒载体在肝癌的抗血管生成基因治疗中的初步应用

考虑到原发肿瘤的发展以及转移关键依靠新生血管的生成来提供氧气和营养。因此，抑制新生血管生成，成为非常吸引人的一种抗癌策略。由人内皮抑素(Endostatin)和血管抑素(angiostatin)组成的融合蛋白(hEA)表现出了更大的抗血管生成活性以及在动物肿瘤模型中表现出更强的抗肿瘤效率。鉴于此，本发明以长效、稳定表达的杆状病毒载体为平台，构建表达hEA蛋白的重组杆状病毒，并对其功能和抗肝癌肿瘤的抑瘤效果进行评价。其特征在于包括如下步骤：

(一)表达hEA蛋白的重组杆状病毒的构建

1.pBacSC-DAF-ChEA质粒的构建

根据质粒pUNO1-hEndo18Angio(InvivoGen,USA)提供的序列设计引物hEA-F/R，用于扩增hEA基因，引物序列、酶切位点及扩增片段和大小如表1所示。将PCR产物回收后与经Nhe I和Hind III双酶切后的pBacSC-DAF-CE质粒按照Ultra One StepCloning Kit说明书方法进行同源重组，经PCR鉴定正确的重组质粒命名为pBacSC-DAF-ChEA。hEA的核苷酸序列见SEQ ID NO.6。

2.pBacSC-DAF-SB-T2ChEA质粒的构建

按照上述同样的方法，将hEA PCR回收产物与经Nhe I和Hind III双酶切后的pBacSC-DAF-SB-T2CE质粒按照

Ultra One Step Cloning Kit说明书方法进行同源重组，经PCR鉴定正确的重组质粒命名为pBacSC-DAF-SB-T2ChEA。

以上质粒的构建示意图如图11a所示。

3.重组杆状病毒的获得

按照实施例1中描述的方法，将重组质粒pBacSC-DAF-ChEA和pBacSC-DAF-SB-T2ChEA转化大肠杆菌感受态细胞DH10Bac，经筛选、鉴定和转染后获得的重组病毒分别命名为BacSC-DAF-ChEA和BacSC-DAF-SB-T2ChEA。

(二)重组杆状病毒介导的hEA的表达时效性验证

为了证实重组病毒BacSC-DAF-SB-T2ChEA是否能介导hEA的长效表达，将重组病毒BacSC-DAF-ChEA和BacSC-DAF-SB-T2ChEA分别转导HEK293细胞(MOI 100)，于转导后不同时间点收集细胞，通过人血管抑素ELISA试剂盒(碧云天，南京)测定hEA的浓度。结果如图11b所示，BacSC-DAF-ChEA介导的hEA的表达随着时间的增加表达量急剧下降，到第9d的时候已检测不到hEA的浓度，而BacSC-DAF-SB-T2ChEA介导的hEA的表达尽管在开始也在急速下降，但在第9d之后仍能持续表达，浓度保持在100pg/ml上下。证明重组病毒BacSC-DAF-SB-T2ChEA能够有效地延长和稳定hEA的表达。

(三)重组杆状病毒介导的hEA表达功效验证

为了证实重组病毒BacSC-DAF-SB-T2ChEA介导的hEA持续表达是否伴随着增强的抗血管生成活性，细胞增殖、迁移和脉管形成试验被评价。将滴度为100、200和400MOI的重组病毒BacSC-DAF-SB-T2ChEA和BacSC-DAF-ChEA分别转导HUVECs细胞，3d后通过MTT试验测定细胞活力。MTT结果表明(如图12a所示)，BacSC-DAF-SB-T2ChEA和BacSC-DAF-ChEA抑制细胞的活力呈剂量依赖性，当MOI为400时，与对照组相比，其细胞活力分别达到了43％和60％；不管MOI是200还是400，BacSC-DAF-SB-T2ChEA比BacSC-DAF-ChEA组表现出了更强的抑制细胞活力。脉管形成试验结果证实(如图12b所示，上图)，对照组细胞能看到清晰完整地脉管网络，而BacSC-DAF-SB-T2ChEA和BacSC-DAF-ChEA组抑制了脉管网络的形成；对脉管分支的统计分析结果表明(如图12b所示，下图)，BacSC-DAF-SB-T2ChEA比BacSC-DAF-ChEA和对照组表现出了更强的抑制脉管网络的形成。细胞划痕试验结果表明(如图12c所示)，BacSC-DAF-SB-T2ChEA组与BacSC-DAF-ChEA和对照组相比，表现出了更强的抑制细胞迁移的作用。这些结果共同证实了重组病毒BacSC-DAF-SB-T2ChEA介导的hEA表现出了更强的抑制内皮细胞增殖、迁移和血管生成的功效。

(四)重组杆状病毒介导的hEA抗肿瘤效果评价

为了证实重组病毒BacSC-DAF-SB-T2ChEA的体内抗肿瘤效果，建立裸鼠皮下肝癌模型，当肿瘤体积达到100mm³时，将BacSC-DAF-SB-T2ChEA、BacSC-DAF-ChEA或PBS注射入瘤内，每5d注射1次，共3次，观察动物肿瘤体积的变化以及动物的存活率(当体积达到1000mm³认为动物死亡)。结果如图13a所示，对照组平均肿瘤体积在注射后21d快速地达到了1000mm³，而BacSC-DAF-ChEA组明显地抑制了肿瘤的生长，平均肿瘤体积在27d的时候达到了1000mm³；与BacSC-DAF-ChEA组相比，BacSC-DAF-SB-T2ChEA组表现出了更强的抑制肿瘤生长，直到试验结束时(注射病毒后27d)平均肿瘤体积只达到了664mm³。幸存率结果表明(如图13b)，对照组小鼠在21d时全部死亡(存活只数/总只数，0/6)，而试验组在试验结束时BacSC-DAF-ChEA组的存活率为33.3％(存活只数/总只数，2/6)，BacSC-DAF-SB-T2ChEA组的存活率达到了100％(存活只数/总只数，6/6)。这些数据证明重组病毒BacSC-DAF-SB-T2ChEA能够有效地缓和肝癌肿瘤的生长。

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁夏医科大学

<120> 一种长效稳定表达的杆状病毒载体及其构建方法

<130> 20191121

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 252

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg aacacacaag caagatggta 60

agcgctattg ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcctt tgcggcgcac 120

caccaccacc accacctcga gtctagactg caggaattct tcatgtttgg tcatgtagtt 180

aactttgtaa ttatattaat tgtgatttta tttttgtact gtatgattag aaaccgtaat 240

agacaatatt aa 252

<210> 2

<211> 1596

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540

acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600

ccggtcgcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg 660

gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc 720

gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg 780

ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc 840

gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag 900

cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 960

ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 1020

atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac 1080

aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 1140

gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 1200

cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc 1260

gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag 1320

ctgtacaagt aaaagcttgt cgagaagtac tagaggatca taatcagcca taccacattt 1380

gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa 1440

atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc 1500

aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg 1560

tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatc 1596

<210> 3

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaccgtcg cgcggccgag cgtgcccgcg gcgctgcccc tcctcgggga gctgccccgg 60

ctgctgctgc tggtgctgtt gtgcctgccg gccgtgtggg gtgactgtgg ccttccccca 120

gatgtaccta atgcccagcc agctttggaa ggccgtacaa gttttcccga ggatactgta 180

ataacgtaca aatgtgaaga aagctttgtg aaaattcctg gcgagaagga ctcagtgatc 240

tgccttaagg gcagtcaatg gtcagatatt gaagagttct gcaatcgtag ctgcgaggtg 300

ccaacaaggc taaattctgc atccctcaaa cagccttata tcactcagaa ttattttcca 360

gtcggtactg ttgtggaata tgagtgccgt ccaggttaca gaagagaacc ttctctatca 420

ccaaaactaa cttgccttca gaatttaaaa tggtccacag cagtcgaatt ttgtaaaaag 480

aaatcatgcc ctaatccggg agaaatacga aatggtcaga ttgatgtacc aggtggcata 540

ttatttggtg caaccatctc cttctcatgt aacacagggt acaaattatt tggctcgact 600

tctagttttt gtcttatttc aggcagctct gtccagtgga gtgacccgtt gccagagtgc 660

agagaaattt attgtccagc accaccacaa attgacaatg gaataattca aggggaacgt 720

gaccattatg gatatagaca gtctgtaacg tatgcatgta ataaaggatt caccatgatt 780

ggagagcact ctatttattg tactgtgaat aatgatgaag gagagtggag tggcccacca 840

cctgaatgca gaggaaaatc tctaacttcc aaggtcccac caacagttca gaaacctacc 900

acagtaaatg ttccaactac agaagtctca ccaacttctc agaaaaccac cacaaaaacc 960

accacaccaa atgctcaagc aacacggagt acacctgttt ccaggacaac caagcatttt 1020

catgaaacaa ccccaaataa aggaagtgga accacttcag gtactacccg tcttctatct 1080

gggcacacgt gtttcacgtt gacaggtttg cttgggacgc tagtaaccat gggcttgctg 1140

act 1143

<210> 4

<211> 2085

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcctgcaggt cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 60

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 120

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 180

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 240

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 300

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 360

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 420

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 480

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg 540

cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc 600

tccggactct agaggatccg gtactcgagg aactgaaaaa ccagaaagtt aactggtaag 660

tttagtcttt ttgtctttta tttcaggtcc cggatccggt ggtggtgcaa atcaaagaac 720

tgctcctcag tggatgttgc ctttacttct aggcctgtac ggaagtgtta cttctgctct 780

aaaagctgcg gaattgtacc cgcggaatta atacgactca ctatagggac tagtaccatg 840

ggaaaatcaa aagaaatcag ccaagacctc agaaaaagaa ttgtagacct ccacaagtct 900

ggttcatcct tgggagcaat ttccaaacgc ctggcggtac cacgttcatc tgtacaaaca 960

atagtacgca agtataaaca ccatgggacc acgcagccgt cataccgctc aggaaggaga 1020

cgcgttctgt ctcctagaga tgaacgtact ttggtgcgaa aagtgcaaat caatcccaga 1080

acaacagcaa aggaccttgt gaagatgctg gaggaaacag gtacaaaagt atctatatcc 1140

acagtaaaac gagtcctata tcgacataac ctgaaaggcc actcagcaag gaagaagcca 1200

ctgctccaaa accgacataa gaaagccaga ctacggtttg caactgcaca tggggacaaa 1260

gatcgtactt tttggagaaa tgtcctctgg tctgatgaaa caaaaataga actgtttggc 1320

cataatgacc atcgttatgt ttggaggaag aagggggagg cttgcaagcc gaagaacacc 1380

atcccaaccg tgaagcacgg gggtggcagc atcatgttgt gggggtgctt tgctgcagga 1440

gggactggtg cacttcacaa aatagatggc atcatggacg cggtgcagta tgtggatata 1500

ttgaagcaac atctcaagac atcagtcagg aagttaaagc ttggtcgcaa atgggtcttc 1560

caacacgaca atgaccccaa gcatacttcc aaagttgtgg caaaatggct taaggacaac 1620

aaagtcaagg tattggagtg gccatcacaa agccctgacc tcaatcctat agaaaatttg 1680

tgggcagaac tgaaaaagcg tgtgcgagca aggaggccta caaacctgac tcagttacac 1740

cagctctgtc aggaggaatg ggccaaaatt cacccaaatt attgtgggaa gcttgtggaa 1800

ggctacccga aacgtttgac ccaagttaaa caatttaaag gcaatgctac caaatactag 1860

gggccctaac cgcggggatc cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac 1920

aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt 1980

tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt 2040

tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt ttcggatcct ctaga 2085

<210> 5

<211> 2330

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgaattgga gctcggatcc ctatacagtt gaagtcggaa gtttacatac acttaagttg 60

gagtcattaa aactcgtttt tcaactactc cacaaatttc ttgttaacaa acaatagttt 120

tggcaagtca gttaggacat ctactttgtg catgacacaa gtcatttttc caacaattgt 180

ttacagacag attatttcac ttataattca ctgtatcaca attccagtgg gtcagaagtt 240

tacatacact aagttgactg tgcctttaaa cagcttggaa aattccagaa aatgatgtca 300

tggctttaga agctttagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 360

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 420

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 480

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 540

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 600

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 660

agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg 720

gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg 780

gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat 840

gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctggtttag tgaaccgtca 900

gatccgctag cgctaccggt cgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 960

gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 1020

ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc 1080

ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc 1140

ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 1200

ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 1260

gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 1320

aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 1380

tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac 1440

atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 1500

ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac 1560

cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact 1620

ctcggcatgg acgagctgta caagtaaaag cttgtcgaga agtactagag gatcataatc 1680

agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg 1740

aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat 1800

ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat 1860

tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat cagcttgtgg 1920

aaggctactc gaaatgtttg acccaagtta aacaatttaa aggcaatgct accaaatact 1980

aattgagtgt atgtaaactt ctgacccact gggaatgtga tgaaagaaat aaaagctgaa 2040

atgaatcatt ctctctacta ttattctgat atttcacatt cttaaaataa agtggtgatc 2100

ctaactgacc taagacaggg aatttttact aggattaaat gtcaggaatt gtgaaaaagt 2160

gagtttaaat gtatttggct aaggtgtatg taaacttccg acttcaactg tatagggatc 2220

ctctagctag agtcgacctc gagggggggc ccggtaccca gcttttgttc cctttagtga 2280

gggttaattg cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 2330

<210> 6

<211> 1734

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60

gcccacagcc accgcgactt ccagccggtg ctccacctgg ttgcgctcaa cagccccctg 120

tcaggcggca tgcggggcat ccgcggggcc gacttccagt gcttccagca ggcgcgggcc 180

gtggggctgg cgggcacctt ccgcgccttc ctgtcctcgc gcctgcagga cctgtacagc 240

atcgtgcgcc gtgccgaccg cgcagccgtg cccatcgtca acctcaagga cgagctgctg 300

tttcccagct gggaggctct gttctcaggc tctgagggtc cgctgaagcc cggggcacgc 360

atcttctcct ttgacggcaa ggacgtcctg aggcacccca cctggcccca gaagagcgtg 420

tggcatggct cggaccccaa cgggcgcagg ctgaccgaga gctactgtga gacgtggcgg 480

acggaggctc cctcggccac gggccaggcc tcctcgctgc tggggggcag gctcctgggg 540

cagagtgccg cgagctgcca tcacgcctac atcgtgctct gcattgagaa cagcttcatg 600

actgcctcca aggtaccagg agtaggtacg aattcggtgt atctctcaga gtgcaagact 660

gggaatggaa agaactacag agggacgatg tccaaaacaa aaaatggcat cacctgtcaa 720

aaatggagtt ccacttctcc ccacagacct agattctcac ctgctacaca cccctcagag 780

ggactggagg agaactactg caggaatcca gacaacgatc cgcaggggcc ctggtgctat 840

actactgatc cagaaaagag atatgactac tgcgacattc ttgagtgtga agaggaatgt 900

atgcattgca gtggagaaaa ctatgacggc aaaatttcca agaccatgtc tggactggaa 960

tgccaggcct gggactctca gagcccacac gctcatggat acattccttc caaatttcca 1020

aacaagaacc tgaagaagaa ttactgtcgt aaccccgata gggagctgcg gccttggtgt 1080

ttcaccaccg accccaacaa gcgctgggaa ctttgtgaca tcccccgctg cacaacacct 1140

ccaccatctt ctggtcccac ctaccagtgt ctgaagggaa caggtgaaaa ctatcgcggg 1200

aatgtggctg ttaccgtgtc cgggcacacc tgtcagcact ggagtgcaca gacccctcac 1260

acacataaca ggacaccgga aaactttccc tgcaaaaatt tggatgaaaa ctactgccgc 1320

aatcctgacg gaaaaagggc cccatggtgc catacaacca acagccaagt gcggtgggag 1380

tactgtaaga taccgtcctg tgactcctcc ccagtatcca cggaacaatt ggctcccaca 1440

gcaccacctg agctaacccc tgtggtccag gactgctacc atggtgatgg acagagctac 1500

cgaggcacat cctccaccac caccacagga aagaagtgtc agtcttggtc atctatgaca 1560

ccacaccggc accagaagac cccagaaaac tacccaaatg ctggcctgac aatgaactac 1620

tgcaggaatc cagatgccga taaaggcccc tggtgtttta ccacagaccc cagcgtcagg 1680

tgggagtact gcaacctgaa aaaatgctca ggaacagaag cgagtgttgt atga 1734

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acgaagactt gatcacccgg gatgctacta gtaaatcagt cacaccaag 49

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cctcccccat ctcccggtac cttaatattg tctattacgg tttctaatca taca 54

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tggctttaga agctttagtt attaatagta atcaattacg gggtc 45

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agccttccac aagctgatcc agacatgata agatacattg atg 43

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gctctcgaga tgaccgtcgc gcgg 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gatgaattca gtcagcaagc ccat 24

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttgaattaaa ggtccgtata cgcctgcagg tcgttacata actt 44

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcgactagtg agctcgtcga ctctagagga tccgaaaaaa cctcc 45

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acgagctcac tagtcgcggc cgcgcgaatt ggagctcgga tc 42

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atctggttcg gatctcctag gcacacagga aacagctatg acca 44

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgaaccgtca gatccgctag ccgccaccat gtacaggatg caactcc 47

<210> 18

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gtacttctcg acaagctttc atacaacact cgcttctgt 39