阅读说明：本技术 Pcv2/pcv3二价重组病毒样颗粒及其应用 (PCV2/PCV3 bivalent recombinant virus-like particle and application thereof ) 是由 金宁一 李昌 姜宇航 许汪 李乐天 田明尧 鲁会军 李霄 郝鹏飞 时小双 郝嘉翼 于 2020-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,特别涉及PCV2/PCV3二价重组病毒样颗粒及其应用。本发明使用杆状病毒昆虫表达系统的双表达核载体对PCV2 Cap及PCV3 Cap进行同时表达,做到一支疫苗同时针对于两种病毒进行免疫,在经济方面做到了降低疫苗价格的好处,使用Bac-to-Bac表达系统分别制备PCV2-PCV3 VLPs,分别将PCV2 Cap与PCV3 Cap插入双表达核的在体中。并成功获得用于包装所用的重组杆状病毒VLPs。经Western Blot、IFA、透射电镜等方法检测,结果显示成功包装出与天然病毒基本一致的PCV2-PCV3 VLPs。(The invention relates to the technical field of biology, in particular to PCV2/PCV3 bivalent recombinant virus-like particles and application thereof. The invention uses the dual-expression nuclear vector of a baculovirus insect expression system to simultaneously express PCV2Cap and PCV3Cap, achieves that one vaccine simultaneously immunizes against two viruses, and economically reduces the price of the vaccine, uses a Bac-to-Bac expression system to respectively prepare PCV2-PCV3 VLPs, and respectively inserts PCV2Cap and PCV3Cap into the in vivo of the dual-expression nucleus. And successfully obtained recombinant baculovirus VLPs for use in packaging. The results of detection by Western Blot, IFA, transmission electron microscope and other methods show that PCV2-PCV3 VLPs which are basically consistent with natural viruses are successfully packaged.)

PCV2/PCV3二价重组病毒样颗粒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及PCV2/PCV3二价重组病毒样颗粒及其应用。

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)为单链环状无囊膜DNA病毒，属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，是迄今为止发现的最小动物病毒之一。在2016年猪圆环病毒3型(porcine circoviurs 3，PCV3)发现之前，PCV分为猪圆环病毒1型(porcine circoviurs 1，PCV1)和猪圆环病毒2型(porcine circoviurs 2，PCV2)两种血清型。PCV1最早于1974年在PK15细胞中被发现；PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(porcine multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原之一，具有较强的致病性。2016年，Palinski等借助宏基因组测序技术从暴发猪皮炎与肾病综合征(porcinedermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)疫情的美国某商品化猪场的患病猪中发现了一种新病毒，根据该病毒的基因组结构和遗传特性将其归类为新型圆环病毒，并命名为PCV3。PCV3基因组结构与PCV相似，为单股环状DNA，全长2000bp，包含3个主要开放阅读框(ORFs)，其中ORF1全长891bp，编码含有296个氨基酸的复制酶(Rep)；ORF2全长645bp编码含有214个氨基酸的衣壳蛋白(Cap)。另外还有一个开放阅读框ORF3全长693bp，编码230个氨基酸组成的蛋白。

临床上，猪圆环病毒Ⅲ型(porcine circovirus 3，PCV3)感染的猪多会出现腹下黑斑、产死胎或木乃伊肽，但种猪采食量和精神状态良好；保育猪多发生混合感染，精神状态极差、高烧扎堆、腹式呼吸等，发病严重的猪场死亡率超过15％，已给养殖业带来了一定的经济损失。

PCV3是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为2.0kb，病毒离子直径约17-20nm，无囊膜。PCV3与PCV2的Cap蛋白氨基酸同源性同源性仅为30％，而Cap蛋白是PCV诱导动物机体产生特异性免疫应答的主要蛋白，因此PCV2疫苗对于PCV3所能提供的保护非常有限。PCV3作为一种新型病毒，该病毒的病原学研究尚不明确，国内外尚未有分离纯化PCV3的报道，因此制约了利用灭活疫苗进行防控的思路。

病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是一类由病毒的部分或全部结构蛋白自动组装成的具有与天然病毒结构基本一致的空心蛋白颗粒，不具有病毒的遗传物质，不能自主复制，作用于机体后能够引起机体产生类似于天然病毒感染的免疫应答反应。因其具有良好的免疫原性、较高的安全性等特点，目前已经成为研制用于人或动物病毒性感染疾病的潜在的安全高效候选疫苗之一。

目前，PCV2仍然对我国养猪业产生着极大影响的动物疾病，而PCV3在我国也渐渐呈现出流行趋势，两种病毒具有相似的病理特征，并同诸多其他种类病毒共同存在，两种病毒都会导致免疫抑制，给养猪业带来极大的损失。目前PCV2的疫苗已经在养猪业种被广泛应用，但是对于新发现的PCV3来说，目前还没，目前还没有任何临床上的审批报道。

综上所述，提供可同时表达PCV2 Cap与PCV3 Cap的病毒样颗粒具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了可同时表达PCV2 Cap与PCV3 Cap的病毒样颗粒。该病毒样颗粒用杆状病毒表达系统进行制备，可以用作预防性疫苗预防两种病毒的感染，也可以作为抗原进行诊断试剂盒的研制。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了重组质粒，包括PCV2 Cap基因、PCV3 Cap基因和杆状病毒昆虫表达系统的双表达核载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述杆状病毒昆虫表达系统的双表达核载体为Bac-to-Bac表达系统。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的重组质粒的构建方法，获得PCV2Cap基因和PCV3 Cap基因，克隆至pEASY-Blunt载体上，验证正确后将目的基因分别克隆至所述杆状病毒昆虫表达系统上，获得含有PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因的重组质粒。

本发明还提供了重组杆状质粒，其构建方法为：将所述的重组质粒转化宿主感受态细胞，经蓝白斑筛选，获得重组杆状质粒。

在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主为Trans5α大肠杆菌感受态细胞。

本发明还提供了所述的重组质粒或所述的重组杆状质粒在表达PCV2Cap和PCV3Cap蛋白中的应用。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的重组质粒或所述的重组杆状质粒在制备疫苗或检测试剂盒中的应用。

此外，本发明还提供了同时表达PCV2 Cap和PCV3 Cap的方法，包括如下步骤：

步骤1：获得PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因，克隆至pEASY-Blunt载体上，验证正确后将目的基因分别克隆杆状病毒昆虫表达系统上上，获得含有PCV2 Cap基因、PCV3 Cap基因的重组质粒；

步骤2：将所述重组质粒转化宿主感受态细胞，经蓝白斑筛选，获得重组杆状质粒；

步骤3：将所述重组杆状质粒利用脂质体转染至SF9细胞中进行病毒拯救，转染后72h时，收取上清病毒液，盲传三代，收取SF9细胞。

本发明还提供了如所述方法获得的同时表达PCV2 Cap和PCV3 Cap的病毒样颗粒。

更重要的是，本发明还提供了疫苗或检测试剂盒，包括所述的病毒样颗粒。

Cap蛋白作为PCV2与PCV3的重要结构蛋白，对产生免疫原有着不可或缺的作用，由于杆状病毒对外源蛋白的良好承载能力，以及可产生类似于天然病毒的结构的VLPs，所以本发明设计使用杆状病毒昆虫表达系统的双表达核载体对PCV2 Cap及PCV3 Cap进行同时表达，做到一支疫苗同时针对于两种病毒进行免疫，在经济方面做到了降低疫苗价格的好处，本研究中，使用Bac-to-Bac表达系统分别制备PCV2-PCV3 VLPs，分别将PCV2 Cap与PCV3Cap插入双表达核的在体中。并成功获得用于包装所用的重组杆状病毒VLPs。经WesternBlot、IFA、透射电镜等方法检测，结果显示成功包装出与天然病毒基本一致的PCV2-PCV3 VLPs。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示PCV2 Cap PCV3 Cap基因PCR扩增结果；

图2示重组质粒pEASY-PCV2 Cap与pEASY-PCV3 Cap酶切鉴定；

图3示质粒pFBD-PCV-PCV3示意图；

图4示重组质粒pFBD-PCV-PCV3的构建与鉴定；

图5示重组穿梭质粒pFBD-PCV-PCV3的菌液PCR验证；

图6示重组杆状病毒的拯救；其中，A-正常的SF9细胞；B-重组杆状病毒pFBD-PCV3-1-PCV3-2感染SF9细胞48h病变；C-重组杆状病毒pFBD-PCV3-1-PCV3-2感染SF9细胞120h病变；

图7示IFA鉴定Cap蛋白的表达；

图8示重组蛋白rBV-PCV2-PCV3的鉴定；

图9示rBV-PCV2-PCV3病毒滴度；

图10示病毒样颗粒。

具体实施方式

本发明公开了PCV2/PCV3二价重组病毒样颗粒及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的PCV2/PCV3二价重组病毒样颗粒及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

含有目的基因PCV2 Cap的质粒由军事兽医研究所许汪博士提供；含有目的基因PCV3 Cap的质粒由本实验室设计并合成；pEASY-Blunt Simple、Trans5α大肠杆菌感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1引物设计与合成

设计特异性扩增引物(表1)。参考实验室保存的PCV2 Cap基因，设计引物，上游引物PCV2-F添加NotⅠ酶切位点并在启动子后加入流感病毒血凝素HA标签：下游引物PCV2-R添加HindⅠⅠⅠ酶切位点：引物由吉林省酷美生物科技有限公司合成。针对实验室保存的PCV3Cap基因设计引物并进行扩增，上游引物PCV3-F添加XhoⅠ酶切位点并在启动子后加入His标签：下游引物PCV3-R添加KpnⅠ酶切位点(见表1)。

表1本研究所用引物

斜体加下划线为限制性核酸内切酶识别位点。

实施例2 PCR扩增目的基因

以含有目的基因PCV2 Cap、PCV3 Cap的质粒为模板，分别用扩增PCV2Cap、PCV3Cap基因的两对引物(表1)进行目的基因扩增，反应条件如表2所示。经1％琼脂糖凝胶电泳分离回收目的片段，克隆至pEASY-Blunt载体上，并转化至Trans5α感受态细胞，涂布于固体LB平板上，37℃，倒置培养12h后，挑取单克隆菌株至液体LB中震荡培养12h，提取质粒命名为pEPC1、pEPC2，分别用EcoRI和NotI、XhoI和KpnI进行双酶酶切鉴定，Sanger测序进一步确认。

表2 PCR反应条件

效果例

目的基因的扩增

使用特异性引物进行PCV2 Cap与PCV3 Cap基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳结果可见约750bp左右与680bp左右的条带(如图1)。

克隆质粒pEASY-PCV2、pEASY-PCV3的鉴定

分别回收后克隆至pEASY-Blunt载体上，构建重组质粒pEASY-PCV2Cap、pEASY-PCV3 Cap，用限制性内切酶NotI和HindIII、KpnI和XhoI双酶切，可见750bp与680bp左右的条带。进一步DNA序列测定结果显示，与原序列完全一致，表明成功获得目的基因(见图2)。

表达PCV Cap基因的质粒构建与鉴定

将测序正确的PCV2 Cap与PCV3 Cap基因的质粒及表达载体pFBD分别用相应的酶进行酶切，并依次连接到pFBD上，构建含有PCV2 Cap基因与PCV3 Cap基因的穿梭质粒pFBD-PCV2-PCV3(如图3)。酶切鉴定结果如图所示，质粒pFBD-PCV2-PCV3能够分别切出单个基因片段及含有两个基因的片段，表明质粒构建成功(4)。

重组杆粒的鉴定

将质粒pFBD-PCV2-PCV3转化到DH10Bac TM感受态细胞中，并涂布于含有四环素(10μg/mL)、硫酸卡纳霉素(50μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)、IPTG/X-Gal的蓝白斑筛选平板上，37℃倒置培养48h。挑取白色菌落加入SOC培养基中，振荡培养3h，按照表1所示通用引物对Bacmid-PCV2-PCV3菌液进行PCR验证，结果如图所示，应用引物Puc/M13-R、PHF进行扩增得到1500bp左右的条带，应用引物Puc/M13-F、P10R进行扩增得到2400bp左右条带，与预期结果一致，表明重组杆粒Bacmid-PCV2-PCV3构建成功(如图5)。

重组杆状病毒的筛选

接种SF9细胞至六孔板中，27℃培养12h后，更换完全培养基为1mL双无Grace’s培养基，使用双无Grace’s培养基稀释阳性重组杆粒Bacmid-PCV2-PCV3(3μg)与PEI(4μL)轻轻混匀，静置20min均匀加入6孔板中，27℃静置培养5h，换液为SF-900Ⅱ完全培养基27℃，静置培养5-7天，每天观察细胞状态，待60％细胞出现病变时，收取上清为第一代重组杆状病毒，命名为rBV-PCV2-PCV3，继续盲传三代。

重组杆粒Bacmid-PCV2-PCV3转染SF9细胞(如图6A)产生P1代毒，转染48h后SF9细胞均出现细胞变圆(如图6B)，体积变大，破裂，细胞数目减少，细胞核明显增大，转染120h后出现典型CPE(如图C)，表明重组杆状病毒rBV-PCV2-PCV3拯救成功(如图6)。

间接免疫荧光

取生长状态良好的SF9细胞均匀铺入六孔板，待细胞长至70％,，接种重组杆状病毒rBV-PCV2-PCV3，每孔10μL。27℃培养48h后弃掉培养基。用4％甲醛固定液固定30min，Trion X-100透化处理10min，10％BSA封闭2h，1:1000稀释Anti-6x His tag一抗孵育2h，1:1000稀释FITC-标记的山羊抗鼠IgG避光孵育1h，1:1000稀释DAPI避光孵育30min，用荧光显微镜观察。每步操作结束均使用PBS清洗三次。

利用His-tag与HA-tag重组杆状病毒进行IFA检测，结果显示，正常SF9细胞未出现特异性荧光，而感染重组病毒rBV-PCV2-PCV3的SF9细胞出现特异性荧光，带有His-tag标签的PCV3表现为绿色荧光，带有HA-tag标签的PCV2表现为红色荧光。表明外源Cap基因在杆状病毒中成功表达(如图7)。

外源蛋白表达的WesternBlot分析

低速离心收集感染rBV-PCV2-PCV3的SF9细胞，使用适量的Western裂解液裂解并进行超声破碎，12000rpm离心2min。收取上清制备蛋白样品。通过蛋白电泳SDS-PAGE，转印至NC膜上，以Anti-6×His tag为一抗，山羊抗鼠IgG为二抗，进行WesternBlot鉴定。

利用脂质体转染法，将重组穿梭质粒pFBD-PCV2-PCV3转染至SF9细胞，于27℃温箱培养5-7天，待细胞出现大约60％病变，收取上清，接入铺入长好60％左右SF9细胞的6孔板，盲传三代，待细胞出现大约60％病变收取细胞沉淀进行裂解破碎，SDS-PAGE电泳后，用Anti-6xHis-tag与Anti-HA作为一抗进行WesternBlot分析，结果如图，可见24kDa与28kDa的目的蛋白条带，与理论值相符，而对照细胞没有条带，表明PCV2-PCV3 Cap成功表达并具有反应原性(如图8)。

重组杆状病毒滴度测定

按照《BacPAKBaculovirus Rapid TiterKit》用户操作指南进行测定重组杆状病毒，rBV-PCV2的病毒滴度为7.8×10⁸Pfu/ml(如图9)。

VLPs的电镜观察

透射电镜分别观察经蔗糖密度梯度离心的样品，结果如图10所示，在透射电镜下可看到约20nm的病毒样颗粒，基本符合PCV的基本形态特征。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 申请人

<120> PCV2/PCV3二价重组病毒样颗粒及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcggccgcat gtacccatac gacgtcccag actacgctac gtatcca 47

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagcttctac ttagggttaa gtggggg 27

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcgagatgc atcaccatca c 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtaccttag agaacggac 19

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccagtcacg acgttgtaaa acg 23

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggaccttta attcaaccc 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttcataccgt cccaccat 18

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcggataac aatttcacac agg 23