阅读说明：本技术 抗bmp10抗体和以该抗体为有效成分的对高血压和高血压性疾病的治疗剂 (anti-BMP 10 antibody and therapeutic agent for hypertension and hypertensive disease comprising the same as active ingredient ) 是由 有山博之 小川进也 北山哲也 山田武直 于 2018-12-12 设计创作，主要内容包括：本发明的目的在于提供抗BMP10抗体和以该抗体为有效成分的对高血压和高血压性疾病的治疗剂。本发明涉及与人BMP10(骨形态发生蛋白-10)结合的抗BMP10单克隆抗体或其抗体片段。另外本发明涉及包含BMP10和BMP9/BMP10异源二聚体中的至少一种的拮抗剂的高血压和高血压性疾病的治疗剂、与人BMP10相关的疾病的诊断药或医药组合物、使用该拮抗剂的人BMP10的免疫学的检测方法或测定方法、以及该拮抗剂的用于制造高血压和高血压性疾病的治疗用医药组合物的用途。(The present invention aims to provide an anti-BMP 10 antibody and a therapeutic agent for hypertension and hypertensive diseases, which comprises the antibody as an active ingredient. The present invention relates to an anti-BMP 10 monoclonal antibody or an antibody fragment thereof that binds to human BMP10 (bone morphogenetic protein-10). The present invention also relates to a therapeutic agent for hypertension and hypertensive diseases, which comprises an antagonist against at least one of BMP10 and BMP9/BMP10 heterodimers, a diagnostic agent or pharmaceutical composition for diseases related to human BMP10, an immunological detection method or assay method for human BMP10 using the antagonist, and use of the antagonist for producing a pharmaceutical composition for treating hypertension and hypertensive diseases.)

抗BMP10抗体和以该抗体为有效成分的对高血压和高血压性 疾病的治疗剂

技术领域

本发明涉及与人BMP10(骨形态发生蛋白-10，Bone morphogenetic protein-10)结合的抗BMP10单克隆抗体或其抗体片段、编码该抗体或该抗体片段的DNA、含有该DNA的重组载体、将该重组载体导入宿主细胞得到的转化株、和使用该转化株的抗体或该抗体片段的制造方法。

另外，本发明涉及包含BMP10和BMP9/BMP10异源二聚体的至少一种的拮抗剂的高血压和高血压性疾病的治疗剂、与人BMP10相关的疾病的诊断药或医药组合物、使用该拮抗剂的人BMP10的免疫学的检测方法或测定方法、以及该拮抗剂用于制造高血压和高血压性疾病的治疗用医药组合物中的用途。

背景技术

BMP10是骨形态发生蛋白10的缩写。BMP10属于包含约20种的BMP(骨形成蛋白质)家族分子，人BMP10是由424个氨基酸构成的分泌蛋白质(非专利文献1、2)。BMP10通过与I型和II型的2种受体结合，受体被活化，Smad1/5/8被磷酸化，进而通过磷酸化被活化的Smad1/5/8与Smad4形成复合体后，转移到核内，发挥作为转录因子的功能。

已知BMP10主要在心脏中表达(非专利文献2、3、4)，人BMP10是在血液中以约10ng/mL的浓度存在的血液循环因子(非专利文献5)。

关于生物体内BMP10的作用，目前为止从BMP10缺损小鼠的解析，报道了其是胎儿期中对于心脏的发育、血管新生重要的因素(非专利文献6、7)。然而，由于BMP10缺损小鼠会导致胎儿死亡，所以没有成年期的BMP10的作用的报道，另外也没有基于在成年期对动物投予抗BMP10抗体的报告。

另外，报道了在伴有高血压的扩张型心肌病HT-DCM的患者中存在BMP10的基因突变、由于该基因突变，BMP10被过剩分泌(非专利文献12)。非专利文献12中表明如果对高血压大鼠喂食高盐而引起心脏肥大，则BMP10 mRNA的表达上升。然而，非专利文献12没有关于BMP10的中和和缺损的记载，预测因BMP10的中和带来的降压作用非常困难。

因此，预测抗BMP10抗体在生物体内具有降压作用、肾保护作用、心脏保护作用极其困难。

作为特异性中和BMP10的抗BMP10单克隆抗体，已知R&D Systems公司销售的MAB2926(克隆No.462732)和论文中报告的1种抗体(克隆No.13C11)。另外，表明MAB2926比13C11具有更强力的BMP10中和活性(非专利文献8)。并不知晓其他对BMP10的特异性的中和抗体。

高血压是患者人数最多的生活习惯病。存在Ca拮抗药、利尿药、ACE抑制剂、ARB等大量的药剂，但在美国报道了仅35％适当控制了血压(非专利文献9)。作为无法控制高血压的原因之一，可以列举因长时间的服用期间造成的依从性的降低。因此，希望能够持续且稳定地控制血压的新型的降压药。

作为用现有降压药难以控制的高血压之一，可以列举盐敏感性高血压。健康人根据食盐的摄取量从肾脏排泄钠以保持动态平衡，但盐敏感性高血压患者的肾脏的钠排泄机构产生异常。在发生了食盐感受性增强的病态下，为了排泄与健康人等量的钠，需要更高的血压，因此根据食盐摄取量而呈现高血压。作为对症方法进行了减盐疗法，但由于低盐饮食引起QOL的降低，所以能够通过减盐疗法实现降压的患者不多(非专利文献10)。因此，要求以能够治疗盐敏感性高血压的新型分子为靶标的新的机理的降压药。

控制不良的高血压与中风、心脏病发作、心力衰竭、肾脏疾病等的循环器官疾病的发病风险相关。如果肾功能衰竭进展，则会引起血钠的潴留、体液潴留、血压调节因子的活化、尿毒症物质的积累等，进而使血压上升。另外，因体液潴留造成的心力衰竭的心输出量降低的结果，会引起交感神经或体液调节因子的异常，使血压控制困难。这样肾功能衰竭、心力衰竭会使高血压等血流动力学衰竭加剧，血流动力学衰竭会使肾功能衰竭、心力衰竭病情恶化，产生心肾综合征的恶性循环(非专利文献11)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第8287868号说明书

专利文献2：美国专利申请公开第2017/0137503号说明书

非专利文献

非专利文献1：FEBS Letters 586 1846-1859(2012)

非专利文献2：J Biol Chem.2011 Jul 1；286(26):22785-94

非专利文献3：Mech Dev.1999 Feb；80(2):181-4.

非专利文献4：Dev Genes Evol.2004 Feb；214(2):96-8.

非专利文献5：Blood.2012 Jun 21；119(25):6162-6171.

非专利文献6：Proc Natl Acad Sci U S A.2013 Jul 16；110(29):11887-92

非专利文献7：Development.2004 May；131(9):2219-2231.

非专利文献8：Proc Natl Acad Sci U S A.2015 Jun 23；112(25):E3207-15

非专利文献9：Expert Opin Biol Ther.2010 Jul；10(7):1077-87

非专利文献10：实验医学33(7):1078-1084,2015.

非专利文献11：Eur Rev Med Pharmacol Sci.2014 Oct；18(19):2918-26.

非专利文献12：Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007 Dec；293(6):H3396-403.

发明内容

发明要解决的问题

因此，作为新型的高血压治疗药，希望能够实现肾脏保护作用、心脏保护作用这两种作用的治疗剂。另外，如上所述，在新型的高血压治疗药中，要求有持续且稳定的血压控制、经由新型靶标的降压作用、以及对肾脏和心脏的保护作用这三个特征。

本发明的目的在于提供抗BMP10抗体和以该抗体为有效成分的对高血压和高血压性疾病的治疗剂。

解决问题的技术手段

本发明的发明人为了解明抗BMP10抗体在生物体内的作用，尝试使用大鼠获取抗BMP10抗体，结果成功取得了与现有的抗体相比，对BMP10的中和活性和结合活性显著提高的抗BMP10抗体。而且，对于ALK1高表达细胞而言，现有的抗体不具有中和活性，相对于此，取得的抗BMP10抗体具有强力的中和活性。

此外还发现了，现有的抗体与ALK1发生竞争，相对于此，取得的抗BMP10抗体具有与BMPRII、内皮因子(Endoglin)拮抗的新型的抑制方式。而且得知通过使用所取得的抗BMP10抗体，在血液中存在由BMP9和BMP10构成的异源二聚体。此外得知所取得的抗BMP10抗体在ALK1高表达细胞中对由BMP9和BMP10构成的异源二聚体具有强力的中和活性。

此外，使用所取得的抗体，对抗BMP10抗体在生物体内的作用进行了研究。其结果发现，本发明的抗BMP10抗体具有持续的降压作用，而且显著改善食盐感受性病情中的高血压和钠排泄障碍，对伴有高血压的肾小球障碍、肾小管障碍、心脏舒张功能障碍具有治疗效果。

本发明的发明人基于这些发现，考虑能够提供以抗BMP10抗体为有效成分的对高血压和高血压性疾病的治疗剂，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下的(1)～(18)。

(1)一种单克隆抗体或该抗体片段，其包含：

重链，其含有：互补决定区(complementary determining region；以下简记作CDR)1和3，其分别包含序列编号29和31所示的氨基酸序列，以及CDR2，其包含序列编号30所示的氨基酸序列或序列编号30所示的氨基酸序列的第16位的丝氨酸被取代为天冬酰胺的氨基酸序列；以及

轻链，其含有CDR1～3，CDR1～3分别包含序列编号32～34所示的氨基酸序列。

(2)根据(1)所述的单克隆抗体或该抗体片段，其含有：包含选自序列编号71～87中的任意一个氨基酸序列的重链可变区(以下简记作VH)和/或包含选自序列编号70和88～97中的任意一个氨基酸序列的轻链可变区(以下简记作VL)。

(3)根据(1)或(2)所述的单克隆抗体或该抗体片段，其选自以下的(a)～(w)：

(a)含有包含序列编号94所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号73所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(b)含有包含序列编号95所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号73所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(c)含有包含序列编号91所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号75所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(d)含有包含序列编号98所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号75所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(e)含有包含序列编号89所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号77所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(f)含有包含序列编号97所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号77所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(g)含有包含序列编号97所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号78所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(h)含有包含序列编号98所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号78所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(i)含有包含序列编号91所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号79所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(j)含有包含序列编号95所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号79所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(k)含有包含序列编号98所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号79所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(l)含有包含序列编号89所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号81所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(m)含有包含序列编号91所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号81所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(n)含有包含序列编号95所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号81所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(o)含有包含序列编号97所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号81所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(p)含有包含序列编号98所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号81所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(q)含有包含序列编号94所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号85所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(r)含有包含序列编号95所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号85所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(s)含有包含序列编号97所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号85所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(t)含有包含序列编号98所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号85所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(u)含有包含序列编号94所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号87所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(v)含有包含序列编号97所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号87所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(w)含有包含序列编号98所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号87所示的氨基酸序列的VL的单克隆抗体或该抗体片段。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其具有BMP10的中和活性。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其具有BMP9/BMP10异源二聚体的中和活性。

(6)根据(1)～(5)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其为基因重组抗体。

(7)根据(1)～(6)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其为选自包含Fab、Fab’、F(ab’)₂、单链抗体(scFv)、二聚化V区(diabody，双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和CDR的肽中的抗体片段。

(8)编码(1)～(7)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段的DNA。

(9)含有(8)所述的DNA的重组载体。

(10)将(9)所述的重组载体导入宿主细胞得到的转化株。

(11)(1)～(7)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段的制造方法，其特征在于，在培养基中培养(10)所述的转化株，从培养物收集该抗体或该抗体片段。

(12)一种高血压和/或高血压性疾病的治疗剂，其包含BMP10和BMP9/BMP10异源二聚体中的至少一种的拮抗剂。

(13)根据(12)所述的治疗剂，其特征在于，与BMP9拮抗剂同时或逐次给药。

(14)一种含有BMP9拮抗剂的高血压和/或高血压性疾病的治疗剂，其特征在于，与BMP10和BMP9/BMP10异源二聚体中的至少一种的拮抗剂同时或逐次给药。

(15)一种与人BMP10有关的疾病的诊断药，其含有BMP10和BMP9/BMP10异源二聚体中的至少一种的拮抗剂。

(16)一种人BMP10的免疫学的检测方法或测定方法，其中，使用BMP10和BMP9/BMP10异源二聚体中的至少一种的拮抗剂。

(17)一种医药组合物，其含有BMP10和BMP9/BMP10异源二聚体中的至少一种的拮抗剂和药理学上可接受的载体。

(18)BMP10和BMP9/BMP10异源二聚体中的至少一种的拮抗剂在用于制造高血压和高血压性疾病的治疗用医药组合物中的用途。

发明的效果

本发明的抗体与现有抗体相比，是BMP10的中和活性和结合活性中的至少一种显著提高了的抗BMP10抗体。另外，本发明的抗体在ALK1高表达细胞中具有对BMP10的中和活性。另外，本发明的抗体抑制人BMP10与人BMPRII和人内皮因子的结合。

另外，通过本发明的抗体，表明由人BMP9和人BMP10构成的异源二聚体存在人血液中。此外，本发明的抗体在ALK1高表达细胞中，具有对由人BMP9和人BMP10构成的异源二聚体的中和活性。

另外，本发明的抗体在高血压病理中具有使血压持续下降的作用。此外，本发明的抗体显著改善盐敏感性高血压中的高血压和钠排泄障碍。而且，本发明的抗体具有对伴有高血压的肾脏肾小管间质障碍、肾脏肾小球障碍、心脏舒张功能障碍的改善作用。

本发明的抗体是具有上述的一种以上或全部特征的抗体。能够提供编码具有这样的特征的该抗体的DΝΑ、包含该DΝΑ的载体、将该载体导入得到的转化株、使用该转化株的该抗体或该抗体片段的制造方法，通过以该抗体或该抗体片段为有效成分，能够提供对高血压和高血压性疾病的治疗剂。

附图说明

图1是将使用Id1-Luc/CHO细胞、取得的抗BMP10单克隆抗体的BMP10中和活性与已知抗体比较的曲线图。横轴表示抗体的添加浓度(μg/ml)，纵轴表示中和活性(％)。黑色圆表示对照抗体，黑色方块表示MAB2926，白色圆表示18C1抗体，白色方块表示12H3抗体，白色三角表示11H10抗体。

图2是将使用ALK1/Id1-Luc/CHO细胞、取得的抗BMP10单克隆抗体的BMP10中和活性与已知抗体比较的曲线图。横轴表示抗体的添加浓度(μg/ml)，纵轴表示中和活性(％)。黑色圆表示对照抗体，黑色方块表示MAB2926，白色圆表示18C1抗体，白色方块表示12H3抗体，白色三角表示11H10抗体。

图3是评价取得的18C1抗体对各种BMP分子的中和活性的图。纵轴表示中和活性(％)。白色条形图表示18C1抗体，黑色条形图表示对照抗体。

图4的A～图4的C是表示通过所取得的抗BMP10抗体的单次给药带来的对正常大鼠全身血压的作用的图。图4的A的曲线图表示通过18C1抗体的单次给药的收缩期血压的变化。图4的B的曲线图表示通过12H3抗体的单次给药的收缩期血压的变化。图4的C的曲线图表示通过11H10抗体的单次给药的收缩期血压的变化。曲线图的横轴表示将投予抗体的时间作为0小时时的经过时间，纵轴表示收缩期血压(mmHg)。

图5是表示通过作为所取得的抗BMP10抗体的18C1抗体的单次给药带来的对自然发病型高血压大鼠的血压的作用的图。图5的曲线图表示收缩期血压的变化。曲线图的横轴表示将投予抗体的时间作为0小时时的经过时间，纵轴表示收缩期血压(mmHg)。

图6是表示作为所取得的抗BMP10抗体的18C1抗体对Dahl盐敏感性高血压大鼠的收缩期血压的作用的图。图6的曲线图表示收缩期血压的变化。曲线图的横轴表示大鼠的周龄(w)，纵轴表示收缩期血压(mmHg)。黑色圆表示正常饮食组(n＝6)，黑色方块表示高盐组(n＝12)，白色圆表示高食盐食+18C1抗体组(n＝12)。图中的误差线表示标准误差(SE)。

图7的A和图7的B是表示作为所取得的抗BMP10抗体的18C1抗体对Dahl盐敏感性高血压大鼠的钠排泄的作用的图。图7的A表示血钠浓度的变化。曲线图的横轴表示大鼠的周龄(w)，纵轴表示血清钠浓度(mEq)。图7的B表示每1天的尿钠排泄量的变化。曲线图的横轴表示大鼠的周龄(w)，纵轴表示每1天的尿钠排泄量(mEq/day)。黑色圆表示正常饮食组(n＝6)，黑色方块表示高盐组(n＝12)，白色圆表示高食盐食+18C1抗体组(n＝12)。图中的误差线表示标准误差(SE)。

图8表示通过作为所取得的抗BMP10抗体的18C1抗体的在Dahl盐敏感性高血压大鼠中的每1天的尿量的变化。曲线图的横轴表示大鼠的周龄(w)，纵轴表示每1天的单位体重尿量(mL/Kg/day)。黑色圆表示正常饮食组(n＝6)，黑色方块表示高盐组(n＝12)，白色圆表示高盐饮食+18C1抗体组(n＝12)。图中的误差线表示标准误差(SE)。

图9是表示作为所取得的抗BMP10抗体的18C1抗体对Dahl盐敏感性高血压大鼠的肾功能的作用的图。图9表示每1天的尿蛋白排泄量的变化。曲线图的横轴表示大鼠的周龄(w)，纵轴表示每1天的尿蛋白排泄量(mg/day)。黑色圆表示正常饮食组(n＝6)，黑色方块表示高盐组(n＝12)，白色圆表示高盐饮食+18C1抗体组(n＝12)。图中的误差线表示标准误差(SE)。

图10的A～图10的F是表示作为所取得的抗BMP10抗体的18C1抗体对Dahl盐敏感性高血压大鼠的肾功能的作用的图。图10的A是表示Dahl盐敏感性高血压大鼠的通常饮食组的肾脏肾小球病理的图。图10的B是表示Dahl盐敏感性高血压大鼠中高盐饮食组的肾脏肾小球病理的图。图10的C是表示对Dahl盐敏感性高血压大鼠投喂高盐饮食并投予18C1抗体的组(高盐饮食+18C1)的肾脏肾小球病理的图。图10的D是Dahl盐敏感性高血压大鼠的通常饮食组的肾脏肾小管间质病理的照片。图10的E是Dahl盐敏感性高血压大鼠中高盐饮食组的肾脏肾小管间质病理的照片。图10的F是对Dahl盐敏感性高血压大鼠投喂高盐饮食且投予18C1抗体的组(高盐饮食+18C1)的肾脏肾小管间质病理的照片。

图11的A和图11的B是表示作为所取得的抗BMP10抗体的18C1抗体对Dahl盐敏感性高血压大鼠的肾功能的作用的图。图11的A是表示Dahl盐敏感性高血压大鼠的肾小球病理评分的图表。纵轴表示病理评分。图11的B是表示Dahl盐敏感性高血压大鼠的肾小管间质病理评分的图表。纵轴表示病理评分。

图12的A和图12的B是表示作为所取得的抗BMP10抗体的18C1抗体对Dahl盐敏感性高血压大鼠的心功能的作用的图。图12的A表示16周龄时的由超声心动图测定得到的左心室后壁厚度。图表的横轴表示饲料的种类和投予的药剂，纵轴表示左心室后壁厚度。图12的B表示16周龄时的由超声心动图测定得到的二尖瓣环速度e’。图表的横轴表示饲料的种类和投予的药剂，纵轴表示e’。为正常饮食组(n＝6)、高盐组(n＝12)、高盐饮食+18C1抗体组(n＝12)。图中的误差线表示标准误差(SE)。

图13是表示作为所取得的抗BMP10抗体的18C1抗体对Dahl盐敏感性高血压大鼠的心功能的作用的图。图13表示将在16周龄时解剖摘取的肺的重量用体重校正后的值。图表的纵轴表示肺重量体重比率(mg.肺重量/g.体重)。为正常饮食组(n＝6)、高盐组(n＝12)、高盐饮食+18C1抗体组(n＝12)。图中的误差线表示标准误差(SE)。

图14是表示在人血液中存在BMP9/BMP10异源二聚体，作为所取得的抗BMP10抗体的18C1抗体具有对BMP9/BMP10异源二聚体的中和活性的图。图14表示ALK1/Id1-Luc/CHO细胞中的抗BMP9抗体和抗BMP10抗体对血液中BMP的中和活性。横轴表示抗体的添加浓度(μg/ml)，纵轴表示中和活性(％)。白色圆表示对照抗体，黑色圆表示18C1抗体，黑色方块表示12H3抗体，黑色三角表示11H10抗体，黑色菱形表示作为抗BMP9抗体的10D5抗体，白色方块表示12H3抗体和10D5抗体的混合抗体，白色三角表示11H10抗体和10D5抗体的混合抗体。白色方块和白色三角用虚线表示。

图15是表示在血液中存在BMP9/BMP10异源二聚体的图。图15表示将抗BMP10抗体或抗BMP9抗体固相化，使其与人血清反应，用将作为抗BMP10抗体的12H3抗体生物素化后的抗体检测的夹心ELISA的结果。纵轴表示ELISA中的吸光度(OD450/570)，横轴表示人血清的终浓度(％)。黑色圆为作为抗BMP9抗体的10D5抗体，白色方块表示11H10抗体，黑色三角表示将对照抗体固相化后的情况。

图16表示将18C1抗体改变而设计的人源化抗体的重链可变区的氨基酸序列，其是通过基于序列编号70的氨基酸序列的改变而设计的氨基酸序列。序列中的被框包围住的区域表示CDR的氨基酸序列。

图17是表示将18C1抗体改变而设计的人源化抗体的重链可变区的氨基酸序列的图，是表示通过基于序列编号23的氨基酸序列的改变而设计的氨基酸序列。序列中的被框包围住的区域表示CDR的氨基酸序列。

图18的A和图18的B是表示将18C1抗体改变而设计的人源化抗体的轻链可变区的氨基酸序列的图。各序列中的被框包围住的区域表示CDR的氨基酸序列。图18的A表示通过基于序列编号71的氨基酸序列的改变所设计的氨基酸序列。图18的B表示通过基于序列编号26的氨基酸序列的改变所设计的氨基酸序列。

图19是表示将18C1抗体改变而设计的人源化抗体的重链可变区的氨基酸序列的图，其实通过基于序列编号70的氨基酸序列的改变所设计的氨基酸序列。序列中的被框包围住的区域表示CDR的氨基酸序列。

图20是使用ALK1/Id1-Luc/CHO细胞，将抗BMP10人源化抗体的BMP10中和活性与18C1嵌合抗体进行比较的曲线图。横轴表示抗体的添加浓度(ng/ml)，纵轴表示中和活性(％)。白色方块表示VLres02HVmut07，白色三角表示VLres02HVmut08，黑色三角表示VLres04HVmut04抗体，黑色圆表示VLres04VHres16抗体，白色圆表示ch18C1抗体。黑色圆和黑色三角用虚线表示。

图21是使用ALK1/Id1-Luc/CHO细胞，将抗BMP10人源化抗体的BMP10中和活性与18C1嵌合抗体进行比较的曲线图。横轴表示抗体的添加浓度(ng/ml)，纵轴表示中和活性(％)。白色方块表示VLres06HVmut02，白色三角表示VLres06HVmut10，黑色三角表示VLres07HVmut10抗体，黑色圆表示VLres07VHres16抗体，白色圆表示ch18C1抗体。黑色圆和黑色三角用虚线表示。

图22是使用ALK1/Id1-Luc/CHO细胞，将抗BMP10人源化抗体的BMP10中和活性与18C1嵌合抗体进行比较的曲线图。横轴表示抗体的添加浓度(ng/ml)，纵轴表示中和活性(％)。白色方块表示VLres08HVmut04，白色三角表示VLres08HVmut08，黑色三角表示VLres08VHres16抗体，黑色圆表示VLres10HVmut02抗体，白色圆表示ch18C1抗体。黑色圆和黑色三角用虚线表示。

图23是使用ALK1/Id1-Luc/CHO细胞，将抗BMP10人源化抗体的BMP10中和活性与18C1嵌合抗体进行比较的曲线图。横轴表示抗体的添加浓度(ng/ml)，纵轴表示中和活性(％)。白色方块表示VLres10HVmut04，白色三角表示VLres10HVmut08，黑色三角表示VLres10HVmut10抗体，黑色圆表示VLres10VHres16抗体，白色圆表示ch18C1抗体。黑色圆和黑色三角用虚线表示。

图24是使用ALK1/Id1-Luc/CHO细胞，将抗BMP10人源化抗体的BMP10中和活性与18C1嵌合抗体进行比较的曲线图。横轴表示抗体的添加浓度(ng/ml)，纵轴表示中和活性(％)。白色方块表示VLres14HVmut07，白色三角表示VLres14HVmut08，黑色三角表示VLres14HVmut10抗体，黑色圆表示VLres14VHres16抗体，白色圆表示ch18C1抗体。黑色圆和黑色三角用虚线表示。

图25是使用ALK1/Id1-Luc/CHO细胞，将抗BMP10人源化抗体的BMP10中和活性与18C1嵌合抗体进行比较的曲线图。横轴表示抗体的添加浓度(ng/ml)，纵轴表示中和活性(％)。白色方块表示VLres16HVmut07，白色三角表示VLres16HVmut10，黑色三角表示VLres16VHres16，黑色圆表示ch18C1抗体。黑色圆和黑色三角用虚线表示。

图26是使用ALK1/Id1-Luc/CHO细胞，将抗BMP10人源化抗体对人血液中BMP9/BMP10异源二聚体的中和活性与18C1嵌合抗体进行比较的图表。纵轴表示荧光素酶(Luciferase)活性。

图27的A和图27的B是表示通过抗BMP9抗体、或者抗BMP9抗体与抗BMP10抗体混合液的单次给药带来的对正常大鼠全身血压的作用的图。图27的A表示通过10D5抗体的单次给药的收缩期血压的变化。图27的B表示通过10D5抗体与11H10抗体的混合液的单次给药的收缩期血压的变化。白色圆表示介质(PBS)投予当日的变化，白色三角表示抗体投予当日的变化，黑色方块表示抗体投予1天后的变化，黑色三角表示抗体投予2天后的变化。黑色方块和黑色三角用虚线表示。曲线图的横轴表示以投予药液的时间作为0小时时的经过时间，纵轴表示收缩期血压(mmHg)。

图28是表示通过人BMP10重组蛋白质的单次给药带来的对正常大鼠全身血压的作用的图。白色圆表示介质(PBS)投予当日的变化，白色三角表示人BMP10重组蛋白质投予当日的变化，曲线图的横轴表示将投予药液的时间作为0小时时的经过时间，纵轴表示收缩期血压(mmHg)。

发明的

具体实施方式

本发明涉及与人BMP10结合的单克隆抗体。另外，本发明涉及与BMP9/BMP10异源二聚体结合的单克隆抗体。

在本发明中，与本发明的单克隆抗体竞争地与人BMP10结合的抗体是指在所希望的结合测定体系中，抑制本发明的单克隆抗体与人BMP10的结合的抗体。

与本发明的单克隆抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体是指识别与本发明的单克隆抗体所识别的人BMP10的氨基酸序列相同的序列并与其结合的抗体。

人BMP10作为具有序列编号47所示的氨基酸序列的单链的前体蛋白质(Pre-Pro体)合成。该单链的Pre-Pro体是序列编号2所示的氨基酸序列中，第1位至第21位的信号肽区域被切断成为全长体后，通过存在于第388位的半胱氨酸残基间的二硫键，形成二聚体(Pro二聚体或全长体二聚体)。

然后，通过弗林(furin)样蛋白酶，在序列编号47所示的氨基酸序列的第316位和第317位的氨基酸残基间发生切断，被分割为N末侧片段的前肽区域(序列编号47所示的氨基酸序列中，包含第22位的氨基酸至第316位的氨基酸的肽。也称为N末前肽体)和由序列编号48所示的氨基酸序列构成的C末侧片段(成熟(mature)区或成熟体)。

上述成熟区在前肽区域的切断后，也经由序列编号48所示的氨基酸序列的第72位残留的半胱氨酸残基间的二硫键，形成二聚体(以下，记作成熟二聚体)。所切断的N末侧的前肽区域的2个分子与该成熟二聚体的1个分子经由非共价键形成复合体，以该复合体的形式从细胞分泌。在成熟二聚体和成熟二聚体上结合N末前肽区域而成的复合体均具有BMP10的功能。

因此，作为本发明中的人BMP10，是指序列编号47或GenBank登陆号NP＿055297所示的氨基酸序列中，包含相当于成熟区的第317位至第424位的氨基酸序列(序列编号48)且具有人BMP10的功能的多肽。

另外，作为本发明中的人BMP10，是指包含在序列编号48所示的氨基酸序列中，缺失、取代或添加1个以上的氨基酸后的氨基酸序列，且具有人BMP10的功能的多肽。进而，作为本发明中的人BMP10，是指包含与序列编号48所示的氨基酸序列具有60％以上、优选80％以上、更加优选90％以上、最优选95％以上的相同性的氨基酸序列且具有人BMP10的功能的多肽。进而，作为本发明中的人BMP10，还包括在上述的成熟二聚体和成熟二聚体上结合了N末前肽区域的复合体。

人BMP9是作为具有序列编号66所示的氨基酸序列的单链的前体蛋白质(Pre-Pro体)合成的。该单链的Pre-Pro体通过将序列编号66所示的氨基酸序列中1至22位的信号肽区域切断后，经由在392位的半胱氨酸残基间的二硫键，形成二聚体(Pro二聚体)。

然后，通过弗林样蛋白酶，在序列编号66所示的氨基酸序列的第319位和第320位的氨基酸残基间发生切断，分割为N末侧片段的前肽区域(是包含序列编号66所示的氨基酸序列中第23位的氨基酸至第319位的氨基酸的肽)和由序列编号65所示的氨基酸序列构成的C末侧片段(成熟区)。

上述成熟区在前肽区域的切断后，也经由在序列编号65所示的氨基酸序列的第73位残留的半胱氨酸残基间的二硫键，形成二聚体(以下，记作成熟二聚体)。所切断的N末侧的前肽区域的2个分子与该成熟二聚体1个分子仅有非共价键形成复合体，以该复合体的形式从细胞分泌[J.Biol.Chem.，280，26，25111(2005)]。在成熟二聚体和成熟二聚体上结合了N末前肽区域的复合体均具有BMP9的功能。

因此，作为本发明中的人BMP9，是指包含序列编号66或GenBank登陆号NP＿057288所示的氨基酸序列中，相当于成熟区的第320位至第429位的氨基酸序列(序列编号65)，且具有人BMP9的功能的多肽。

另外，作为本发明中的人BMP9，是指包含在序列编号65所示的氨基酸序列中，缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列，且具有人BMP9的功能的多肽。

此外，作为本发明中的人BMP9，是指包含与序列编号65所示的氨基酸序列具有60％以上、优选80％以上、更加优选90％以上、最优选95％以上的相同性的氨基酸序列，且具有人BMP9的功能的多肽。此外，作为本发明中的人BMP9，还包括在上述的成熟二聚体、和成熟二聚体上结合了N末前肽区域的复合体。

上述的BMP不仅形成相同蛋白质的二聚体(以下，记作同源二聚体)，而且与属于BMP家族的其他蛋白质形成二聚体(以下，记作异源二聚体)。本发明中的由BMP9和BMP10构成的异源二聚体(也记作BMP9/BMP10异源二聚体)包含序列编号48所示的相当于BMP10成熟区的氨基酸序列和序列编号65所示的相当于BMP9成熟区的氨基酸序列这两者。

另外，本发明中的BMP9/BMP10异源二聚体中，还包括包含在序列编号48所示的氨基酸序列和序列编号65所示的氨基酸序列的至少一种中，缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列，且具有人BMP9/BMP10异源二聚体的功能的多肽。此外，在本发明中的BMP9/BMP10异源二聚体还包括包含与序列编号48所示的氨基酸序列和序列编号65所示的氨基酸序列中的至少一种具有60％以上、优选80％以上、更加优选90％以上、最优选95％以上的相同性的氨基酸序列且具有人BMP9/10异源二聚体的功能的多肽。此外，本发明中的BMP9/BMP10异源二聚体还包括在人BMP9/10异源二聚体上结合了N末前肽区域的复合体。

作为上述的BMP10的功能，是指BMP10参与细胞内的信号转导。在细胞内的信号转导中，通过BMP10与属于TGFβ超家族的I型和II型的2种受体结合，该受体被活化，Smad1/5/8被磷酸化，进而通过磷酸化而被活化的Smad1/5/8与Smad4形成复合体后，转移到核内，发挥作为转录因子的功能。

作为上述的BMP9的功能，是指BMP9参与细胞内的信号转导。在细胞内的信号转导中，通过BMP9与属于TGFβ超家族的I型和II型的2种受体结合，该受体被活化，Smad1/5/8被磷酸化，进而通过磷酸化而被活化的Smad1/5/8与Smad4形成复合体后，转移到核内，发挥作为转录因子的功能。

作为I型受体，可以列举ALK1和ALK2、ALK3、ALK6。另外，作为II型受体，可以列举BMPII型受体(BMPRII)、激活素(activin)II型a受体(ActRIIa)、和激活素II型b受体(ActRIIb)。另外作为I型和II型以外的受体，可以列举内皮因子。

作为得到具有在序列编号48所示的氨基酸序列和序列编号65所示的氨基酸序列的至少一种中缺失、取代或添加1个以上的氨基酸的氨基酸序列的多肽的方法，可以列举使用部位特异性变异导入法[Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols inmolecularBiology、John Wiley&Sons(1987-1997)、Nucleic Acids Research、10、6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、79、6409、(1982)、Gene、34、315(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82、488(1985)]等，例如可以列举在编码具有序列编号48或序列编号65所示的氨基酸序列的多肽的基因导入部位特异性变异的方法。

所缺失、取代或添加的氨基酸的数量没有特别限定，优选为1个～数十个，例如为1～20个、更优选为1个～数个、例如为1～5个氨基酸。

作为编码人BMP10的基因，可以列举序列编号49或GenBank登陆号NM＿014482所示的碱基序列。其中，由在相当于成熟区的序列编号50所示的碱基序列中，缺失、取代或添加1个以上的碱基的碱基序列构成且包含编码具有人BMP10的功能的多肽的DNA的基因也包括在编码本发明的人BMP10的基因中。另外，由与序列编号50所示的碱基序列具有至少60％以上、优选80％以上、更加优选95％以上的相同性的碱基序列构成且包含编码具有人BMP10的功能的多肽的DNA的基因也包括在编码本发明的人BMP10的基因中。进而，由与具有序列编号50所示的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA构成且包含编码具有人BMP10的功能的多肽的DNA的基因等也包括在编码本发明的人BMP10的基因中。

作为在严格条件下杂交的DNA，是指使用具有序列编号50所示的碱基序列的DNA作为探针的通过菌落杂交法、噬菌斑杂交法、印记杂交法或DNA微阵列法等得到的能够杂交的DNA。

具体而言，可以列举如下的DNA：使用将源自杂交的菌落或噬菌斑的DNA、或具有该序列的PCR产物或寡DNA固定化了的滤膜或载玻片，在0.7～1.0mol/L的氯化钠存在下，在65℃进行杂交[Molecular Cloning、ALaboratory Manual、Second Edition、Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols inmolecular Biology、JohnWiley&Sons(1987-1997)、DNA Cloning 1：Coretechniques、A Practical Approach、Second Edition、Oxford University、(1995)]后，使用0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成包含150mmol/L氯化钠、15mmol/L柠檬酸钠)，在65℃条件下通过将滤膜或载玻片清洗而能够鉴定的DNA。

作为上述能够杂交的DNA，能够列举与序列编号50所示的碱基序列具有至少60％以上的相同性的DNA、优选具有80％以上的相同性的DNA、更加优选具有95％以上的相同性的DNA。

在编码真核生物的蛋白质的基因的碱基序列中经常确认到基因多态性。在本发明中使用的基因，通过这样的多态性而碱基序列产生了小规模变异的基因也包括在编码本发明的BMP10的基因中。

本发明中的相同性的数值除了特别规定的情况，可以是使用本领域技术人员当业者公知的同源性检索程序算出的数值，关于碱基序列，可以列举使用BLAST[J.Mol.Biol.、215、403(1990)]中默认的参数算出的数值等，关于氨基酸序列，可以列举使用BLAST2[Nucleic Acids Res.、25、3389(1997)、Genome Res.、7、649(1997)、http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]中默认的参数算出的数值等。

作为默认的参数，G(Cost to open gap)在碱基序列的情况下为5，在氨基酸序列的情况下为11，-E(Cost to extend gap)在碱基序列的情况下为2，在氨基酸序列的情况下为1，-q(Penalty for nucleotide mismatch)为-3、，r(reward for nucleotide match)为1，-e(expect value)为10，-W(wordsize)在碱基序列的情况下为11个残基，在氨基酸序列的情况下为3个残基，-y[Dropoff(X)forblast extensions inbits]在blastn的情况下为20，在blastn以外的程序时为7，-X(X dropoff value forgapped alignment in bits)为15且Z(final X dropoff value forgapped alignment in bits)在blastn的情况下为50，在blastn以外的程序时为25(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。

由序列编号47或GenBank登陆号NP＿055297所示的氨基酸序列的部分序列构成的多肽能够通过本领域技术人员公知的方法制作，例如能够通过使编码序列编号47所示的氨基酸序列的DNA的一部分缺失，培养导入了包含该DNA的表达载体的转化株来制作。

另外，基于由上述的方法制作的多肽或DNA，通过与上述同样的方法，能够得到具有在序列编号47或GenBank登陆号NP＿055297所示的氨基酸序列的部分序列中，缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列的多肽。

此外，由序列编号47或GenBank登陆号NP＿055297所示的氨基酸序列的部分序列构成的多肽、或具有在序列编号47或GenBank登陆号NP＿055297所示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列的多肽也能够通过芴基甲氧羰基(Fmoc)法、叔丁基氧羰基(tBoc)法等化学合成法制造。

关于BMP9，也能够通过上述的方法或日本特开2017-25011号公报中记载的方法等公知的方法，制作具有缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列的多肽。

本发明的拮抗剂是指通过抑制配体与其受体蛋白质的结合来抑制受体的活化的物质。

本发明的BMP10拮抗剂是指通过抑制BMP10和BMP9/BMP10异源二聚体中的至少一种与它们的受体蛋白质的结合，抑制受体的活化的物质。另外，本发明的BMP10拮抗剂是指具有BMP10和BMP9/BMP10异源二聚体中的至少一种的中和活性的物质。本发明的BMP10拮抗剂包含本发明的抗BMP10单克隆抗体或该抗体片段。

本发明的BMP9拮抗剂是指通过BMP9与其受体蛋白质的结合来抑制受体的活化的物质。另外，本发明的BMP9拮抗剂是指具有BMP9的中和活性的物质。作为本发明的BMP9拮抗剂，例如可以列举抗BMP9抗体。

本发明的抗BMP10单克隆抗体(以下，也称为本发明的抗体或本发明的单克隆抗体)或其抗体片段的一个方式是识别人BMP10的氨基酸序列、或其立体结构，且与其结合的抗体或其抗体片段。本发明的抗体或其抗体片段的一个方式是与人BMP10的氨基酸序列或其立体结构结合，抑制BMP10与BMPRII的结合，抑制BMP10与内皮因子的结合，不抑制BMP10与ALK1的结合的抗体或其抗体片段。另外，本发明的抗体或其抗体片段的一个方式是识别人BMP9/BMP10异源二聚体的氨基酸序列或其立体结构并与其结合的抗体或其抗体片段。本发明的抗体或其抗体片段的一个方式为具有BMP10的中和活性的抗体或其抗体片段。本发明的抗体或其抗体片段的一个方式为具有BMP9/BMP10异源二聚体的中和活性的抗体或其抗体片段。

作为本发明的抗体或其抗体片段，只要具有1个或多个上述任意特征则可以为任何抗体或片段，最优选具有如下的全部特征：与BMP10结合、抑制BMP10与BMPRII的结合以及BMP10与内皮因子的结合、不抑制BMP10与ALK1的结合、具有BMP10的中和活性、与BMP9/BMP10异源二聚体结合、具有BMP9/BMP10异源二聚体的中和活性。

另外，作为本发明的单克隆抗体或其抗体片段的一个方式，还包括与本发明的单克隆抗体竞争地与人BMP10结合的抗体或其抗体片段。优选还包括与本发明的单克隆抗体或其抗体片段竞争地与人BMP10结合、且具有BMP10和BMP9/BMP10异源二聚体中的至少一种的中和活性的抗体或其抗体片段。

此外，作为本发明的单克隆抗体或其抗体片段的一个方式，还包括结合于与本发明的单克隆抗体或其抗体片段所结合的表位相同的表位的抗体或其抗体片段。优选还包括结合于与本发明的单克隆抗体或其抗体片段所结合的表位相同的表位，且具有BMP10和BMP9/BMP10异源二聚体中的至少一种的中和活性的抗体或其抗体片段。

作为本发明中的人BMP10的氨基酸序列，例如可以列举包含2条序列编号48所示的人BMP10成熟区的氨基酸序列，且第72位的半胱氨酸残基间形成了二硫键的氨基酸序列。

作为本发明中的人BMP10的立体结构，只要是具有与包含序列编号47、GenBank登陆号NP＿055297或序列编号48所示的氨基酸序列的人BMP10在天然状态下能够采取的结构同等的结构，则可以为任何结构。人BMP10在天然状态下能够采取的立体结构是指人BMP10的天然型的立体结构。

作为本发明中的人BMP9的氨基酸序列，例如可以列举包含2条序列编号65所示的人BMP9成熟区的氨基酸序列且在第73位的半胱氨酸残基间形成了二硫键的氨基酸序列。

作为本发明中的人BMP9的立体结构，只要是具有与包含序列编号66、GenBank登陆号NP＿057288或序列编号65所示的氨基酸序列的人BMP9在天然状态下能够采取的结构同等的结构，则可以为任何结构。人BMP9在天然状态下能够采取的立体结构是指人BMP9的天然型的立体结构。

作为本发明中的人BMP9/BMP10异源二聚体的氨基酸序列，例如可以列举各含有1条序列编号48所示的人BMP10成熟区的氨基酸序列和序列编号65所示的人BMP9成熟区的氨基酸序列，在半胱氨酸残基间形成了二硫键的氨基酸序列。

作为本发明中的人BMP9/10异源二聚体的立体结构，只要是具有与包含2条序列编号47、GenBank登陆号NP＿055297或序列编号48所示的氨基酸序列和序列编号66、GenBank登陆号NP＿057288或序列编号65所示的氨基酸序列的人BMP9/10异源二聚体在天然状态下能够采取的结构同等的结构，则可以为任何结构。人BMP9/10异源二聚体在天然状态下能够采取的立体结构是指人BMP9/10异源二聚体的天然型的立体结构。

作为本发明中的BMPRII，可以列举包含在序列编号51或GenBank登陆号NP＿001195所示的氨基酸序列中，相当于细胞外区域的第27位至第150位的氨基酸序列的多肽。

作为本发明中的ALK1，可以列举包含在序列编号52或GenBank登陆号NP＿000011所示的氨基酸序列中，相当于细胞外区域的第22位至第118位的氨基酸序列的多肽。

作为本发明中的内皮因子，可以列举包含在序列编号69或GenBank登陆号NP＿001108225所示的氨基酸序列中，相当于细胞外区域的第27位至第586位的氨基酸序列的多肽。

本发明中的ALK1高表达细胞是指比通常表达更多ALK1的细胞。ALK1高表达细胞中还包含后述实施例3的3-1)中记载的人ALK1表达报告细胞和ALK1/Id1-Luc/CHO细胞。

作为本发明中的抗体，具体可以列举以下的(A)或(B)所示的单克隆抗体及其抗体片段。

(A)一种单克隆抗体及其抗体片段，其包含：重链，该重链含有分别包含序列编号29～31所示的氨基酸序列的互补决定区(complementary determining region；以下缩写为CDR)1～3；以及轻链，该轻链含有分别包含序列编号32～34所示的氨基酸序列的CDR1～3。

(B)一种单克隆抗体及其抗体片段，其包含：重链，该重链含有分别包含序列编号29和31所示的氨基酸序列的互补决定区(complementary determining region；以下缩写为CDR)1和3、以及包含序列编号30所示的氨基酸序列的第16位的丝氨酸被取代为天冬酰胺的た氨基酸序列(序列编号99)；轻链，该轻链含有分别包含序列编号32～34所示的氨基酸序列的CDR1～3。

另外，作为本发明的单克隆抗体或其抗体片段，能够列举与上述单克隆抗体或其抗体片段竞争地与人BMP10结合的抗体及其抗体片段。

此外，作为本发明的单克隆抗体或其抗体片段，能够列举结合于与存在于上述单克隆抗体或其抗体片段所结合的人BMP10的表位相同的表位的单克隆抗体及其抗体片段。

结合活性是指例如本发明的抗体或其抗体片段具有对人BMP10的氨基酸序列或其立体结构进行结合的活性。

本发明的抗体的结合活性例如能够通过使用了固相抗原的酶联免疫吸附法(ELISA)等对人BMP10或表达了人BMP10的组织的公知的免疫学的检测法、能够调查特定的抗原和抗体对特定抗原的结合性的方法等来确认。此外，也可以列举使用了Biacore系统(GE Healthcare公司制)等的表面等离子体共振、使用了ITC(DKSH公司制)等的等温滴定量热法等的方法。

抗体对抗原的结合解离常数(Kd值)能够由ELISA、表面等离子体共振、等温滴定量热法的任意方法，通过进行斯卡查德作图(Scatchard plot)、或按照各装置的所附的说明书文書的解析而求出。具体而言，Kd值能够通过由使用Biacore系统(GE Healthcare公司制)测定的传感图，利用单循环动力学(Single-Cycle Kinetics)计算法(BIAevaluationSoftware ver.3、GE Healthcare公司制)进行解析来计算。

本发明的对BMP10的中和活性是指例如与人BMP10结合的抗体或该抗体片段抑制人BMP10对受体的结合，抑制受体活化。中和活性例如能够通过使用人BMP10受体表达细胞的方法、能够调查抗体对人BMP10与受体蛋白质的结合的抑制的方法等来测定。

本发明的对人BMP9/BMP10异源二聚体的中和活性例如是与人BMP9/BMP10异源二聚体结合的抗体或该抗体片段抑制人BMP9/BMP10异源二聚体的对受体的结合，抑制受体活化。

作为中和人BMP9/BMP10异源二聚体的方法，例如可以列举将与人BMP9结合的抗体或该抗体片段和与人BMP10结合的抗体或该抗体片段混合，抑制人BMP9/BMP10异源二聚体对受体的结合，抑制受体活化的方法。另外，也可以列举使用与人BMP10结合且抑制人BMP9/BMP10异源二聚体对受体的结合的抗体，抑制受体活化的方法。

作为中和活性的测定方法，例如能够通过使用人BMP9/BMP10异源二聚体的受体表达细胞的方法、能够调查抗体对人BMP9/BMP10异源二聚体与受体蛋白质的结合的抑制的方法等来确认。

作为使用人BMP10受体表达细胞或人BMP9/BMP10异源二聚体受体表达细胞的中和活性的测定方法，例如可以列举用荧光素酶等酶检测转录因子的活化的报告基因分析等的方法。

作为调查抗体对人BMP10与受体蛋白质、或人BMP9/BMP10异源二聚体与受体蛋白质的结合的抑制的方法，例如可以列举使用Biacore系统(GE Healthcare公司制)等的表面等离子体共振、酶联免疫吸附法(ELISA)等的方法。

本发明的抗体或其抗体片段与人BMP10的氨基酸序列或其立体结构结合能够通过使用固相抗原的酶联免疫吸附法(ELISA)等、对表达人BMP10或人BMP10的组织的公知的免疫学检测法、能够调查特定的抗原和抗体对特定抗原的结合性的方法等来确认。

另外，也能够组合公知的免疫学检测法[Monoclonal Antibodies-Principlesand practice、Third edition、Academic Press(1996)、Antibodies-A LaboratoryManual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、单克隆抗体实验手册、KodanshaScientific(1987)]等来确认。

作为表达人BMP10的组织，只要表达该BMP10则可以任意组织，例如可以列举血液、心脏、肝脏等。

作为本发明的单克隆抗体，能够列举由杂交瘤生产的抗体、或由以包含抗体基因的表达载体转化得到的转化株所生产的基因重组抗体。

单克隆抗体为单一克隆的抗体产生细胞所分泌的抗体，其特征在于仅识别一个表位(也称为抗原决定基)，构成单克隆抗体的氨基酸序列(1级结构)均一。

作为表位，例如可以列举单克隆抗体识别、结合的单一的氨基酸序列、由氨基酸序列构成的立体结构、结合有糖链的氨基酸序列和由结合有糖链的氨基酸序列构成的立体结构等。

本发明的单克隆抗体与人BMP10的氨基酸序列结合。

本发明的单克隆抗体所结合的表位包括在序列编号47所示的人BMP10的氨基酸序列中，更优选包括在序列编号48所示的氨基酸序列中。

在本发明中，双特异性抗体是指具有特异性不同的2种抗原结合结构域的抗体。双特异性抗体各自的抗原结合结构域可以与单一抗原的不同的表位结合，也可以与不同的抗原结合。

一分子的双特异性抗体在单一抗原的不同表位或不同抗原各自上结合一个以上的抗原结合结构域、即分别以一价以上结合。例如在本发明中，在一分子的双特异性抗体各具有一个与BMP10结合的抗原结合结构域和与BMP9结合的抗原结合结构域的情况下，该双特异性抗体与BMP10和BMP9分别以一价结合。

本发明的抗体还包括与BMP9和BMP10结合的双特异性抗体。

杂交瘤例如能够通过制备上述人BMP10作为抗原，由经该抗原免疫后的动物诱导具有抗原特异性的抗体生产细胞，进而使该抗体生产细胞与骨髓瘤细胞融合，来制备制备。能够通过培养该杂交瘤、或对该动物投予该杂交瘤细胞使该动物腹水癌化，将该培养液或腹水分离、纯化，来取得抗BMP10单克隆抗体。

作为作为供抗原进行免疫的动物，只要能够制作杂交瘤，则能够使用任何动物，优选使用小鼠、大鼠、仓鼠、鸡或兔等。另外，从这样的动物取得具有抗体产生能力的细胞，对该细胞在体外(in vitro)实施免疫后，与骨髓瘤细胞融合，制作杂交瘤，该杂交瘤所生产的抗体等也包括在本发明的抗体中。

作为本发明中的基因重组抗体，包括人型嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体片段等通过基因重组所制造的抗体。在基因重组抗体中，具有单克隆抗体的特征且抗原性低、血液半衰期延长的抗体优选作为治疗药。基因重组抗体例如可以列举将上述本发明的单克隆抗体使用基因重组技术改型后的抗体。

人型嵌合抗体是指由人以外的动物的抗体的重链可变区(也记作VH)和轻链可变区(也记作VL)与人抗体的重链恒定区(也记作CH)和轻链恒定区(也记作CL)构成的抗体。本发明的人型嵌合抗体能够通过由上述的杂交瘤，取得编码VH和VL的cDNA，将其分别插入具有编码人抗体的CH和CL的基因的动物细胞用表达载体，构建人型嵌合抗体表达载体，将其导入动物细胞，使其表达来制造。

作为人型嵌合抗体的CH，只要属于人免疫球蛋白(以下，记作hIg)则可以为任何CH，优选使用优选hIgG类的CH，进而能够使用属于hIgG类的hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或它们的改型体这样的亚类的任意CH。作为上述改型体，例如能够使用hIgG4的重链恒定区的、EU-index的第228位的Ser残基取代为Pro、将第235位的Leu残基取代为Glu、和第409位的Arg残基取代为Lys的IgG4变异体(以下，记作IgG4PE R409K)的重链恒定区。另外，作为人型嵌合抗体的CL，可以使用属于hIg的任何CL，也可以使用κ类或λ类的CL。

作为本发明的人型嵌合抗体，具体可以列举含有：包含序列编号23所示的氨基酸序列的抗体的VH、包含序列编号26所示的氨基酸序列的抗体的VL的嵌合抗体。另外，可以列举含有：包含序列编号24所示的氨基酸序列的抗体的VH、包含序列编号27所示的氨基酸序列的抗体的VL的嵌合抗体。另外，可以列举含有：包含序列编号25所示的氨基酸序列的抗体的VH、包含序列编号28所示的氨基酸序列的抗体的VL的嵌合抗体。

作为人源化抗体，可以列举人型CDR移植抗体或通过表面重塑法的人源化抗体。另外，通过将这些制作人源化抗体的方法组合而成的方法制作得到的抗体也包括在本发明的人源化抗体中。此外，具有在以这些方法设计的人源化抗体的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸得到的氨基酸序列且特异性识别人BMP10和/或BMP9/BMP10异源二聚体的抗体也包括在本发明的人源化抗体中。

人型CDR移植抗体是指将人以外的动物的抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的VH和VL的适当的位置后的抗体。本发明的人型CDR移植抗体能够如下来制造。即，构建编码如下的V区的cDNA，将将特异性识别人BMP10和/或BMP9/BMP10异源二聚体，且与人BMP10和/或BMP9/BMP10异源二聚体的氨基酸序列或其立体结构结合的人以外的动物的单克隆抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列，移植到任意的人抗体的VH和VL的框架区(以下记作FR)后得到的V区。然后，分别插入到具有编码人抗体的CH和CL的基因的动物细胞用表达载体中，构建人型CDR移植抗体表达载体，并将其导入动物细胞，由此使其表达。

通过表面重塑法得到的人源化抗体是指，通过表面重塑方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994，91(3)：969-73和Protein Enginerring 1996,10,895-90)，将人以外的动物的抗体的可变区的氨基酸中被认为不对抗体的结合活性产生影响的FR的氨基酸残基取代成被认为使抗原性降低的氨基酸残基后得到的抗体。本发明的通过表面重塑法得到的人源化抗体能够如下进行制造。即，构建编码如下的V区的cDNA，即将特异性识别人BMP10和/或BMP9/BMP10异源二聚体、且与人BMP10和/或BMP9/BMP10异源二聚体的氨基酸序列或其立体结构结合的人以外的动物的单克隆抗体的VH和VL的FR中任意的氨基酸残基取代成其他的氨基酸残基后得到的V区。然后，分别插入到具有编码人抗体的CH和CL的基因的动物细胞用表达载体中，构建通过表面重塑法得到的人源化抗体表达载体，导入动物细胞，由此使其表达。

作为人源化抗体的CH，只要是属于hIg则可以为任意的CH，优选使用hIgG类的CH，进而可以使用属于hIgG类的hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4这样的亚类或它们的改型体的任意CH。作为上述改型体，例如能够使用IgG4PE R409K的CH。另外，作为人源化抗体的CL，只要属于hIg则可以使用任意的CL，能够使用κ类或λ类的CL。

作为本发明的人源化抗体，具体可以列举如下的人源化抗体，其包含：重链，其含有分别包含序列编号29和31所示的氨基酸序列的互补决定区(complementarydetermining region；以下缩写为CDR)1和3、和包含序列编号30所示的氨基酸序列或序列编号30所示的氨基酸序列的第16位的丝氨酸被取代为天冬酰胺的氨基酸序列的CDR2；以及轻链，其含有分别包含序列编号32～34所示的氨基酸序列的CDR1～3。

作为本发明的人源化抗体，具体可以列举包含以下的(a)VH和(b)VL中的至少一种的人源化抗体。

(a)包含序列编号70所示的氨基酸序列、或序列编号70所示的氨基酸序列的选自第14位的Pro、第20位的Leu、第27位的Gly、第29位的Val、第30位的Ser、第37位的Ile、第48位的Ile、第67位的Val、第71位的Val、第76位的Asn、第78位的Phe、第82位的Leu、第85位的Val、第92位的Val、第94位的Tyr和第109位的Thr中的至少1个氨基酸残基被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的抗体的VH

(b)包含序列编号71所示的氨基酸序列、或序列编号71所示的氨基酸序列中的选自第7位的Pro、第10位的Val、第12位的Glu、第14位的Pro、第16位的Lys、第19位的Thr、第20位的Ile、第41位的Pro、第48位的Val、第75位的Ser、第81位的Leu、第82位的Lys、第88位的Asp和第90位的Tyr中的至少1个氨基酸残基被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的抗体的VL

作为本发明的人源化抗体，还包括将VH的CDR的氨基酸序列如以下的(A)所示那样取代后的序列。

(A)VH的CDR1包含序列编号29所示的氨基酸序列或序列编号29所示的氨基酸序列中导入了第4位的Val被取代为Ala的改变的氨基酸序列，VH的CDR2包含序列编号30所示的氨基酸序列或序列编号30所示的氨基酸序列中导入了第16位的Ser被取代为Asp的改变的氨基酸序列，VH的CDR3包含序列编号31所示的氨基酸序列的CDR的氨基酸序列。

此外，作为本发明的人源化抗体所含的VH，优选以下的(1)～(14)。

(1)包含序列编号70所示的氨基酸序列中的第14位的Pro、第20位的Leu、第27位的Gly、第29位的Val、第30位的Ser、第37位的Ile、第48位的Ile、第67位的Val、第71位的Val、第76位的Asn、第78位的Phe、第82位的Leu、第85位的Val、第92位的Val、第94位的Tyr和第109位的Thr被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的VH

(2)包含序列编号70所示的氨基酸序列中的第20位的Leu、第27位的Gly、第29位的Val、第30位的Ser、第37位的Ile、第48位的Ile、第67位的Val、第71位的Val、第78位的Phe、第82位的Leu、第85位的Val、第94位的Tyr和第109位的Thr被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的VH

(3)包含序列编号70所示的氨基酸序列中的第20位的Leu、第27位的Gly、第30位的Ser、第48位的Ile、第67位的Val、第71位的Val、第78位的Phe、第82位的Leu、第92位的Val和第94位的Tyr被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的VH

(4)包含序列编号70所示的氨基酸序列中的第27位的Gly、第29位的Val、第30位的Ser、第48位的Ile、第67位的Val、第71位的Val、第92位的Val和第94位的Tyr被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的VH

(5)包含序列编号70所示的氨基酸序列中的第20位的Leu、第27位的Gly、第48位的Ile、第71位的Val、第78位的Phe、第82位的Leu和第92位的Val被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的VH

(6)包含序列编号70所示的氨基酸序列中的第27位的Gly、第30位的Ser、第48位的Ile、第67位的Val、第71位的Val和第92位的Val被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的VH

(7)包含序列编号70所示的氨基酸序列中的第48位的Ile、第67位的Val、第71位的Val、第78位的Phe和第92位的Val被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的VH

(8)包含序列编号70所示的氨基酸序列中的第27位的Gly、第71位的Val、第78位的Phe和第92位的Val被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的VH

(9)包含序列编号70所示的氨基酸序列中的第27位的Gly、第48位的Ile、第67位的Val和第92位的Val被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的VH

(10)包含序列编号70所示的氨基酸序列中的第27位的Gly、第71位的Val、第92位的Val和第94位的Tyr被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的VH

(11)包含序列编号70所示的氨基酸序列中的第27位的Gly、第71位的Val和第92位的Val被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的VH

(12)包含序列编号70所示的氨基酸序列中的第71位的Val和第92位的Val被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的VH

(13)包含序列编号70所示的氨基酸序列的VH

(14)包含对上述(1)～(13)所示的VH，将其CDR的氨基酸序列取代成上述(A)所述的CDR的氨基酸序列后的氨基酸序列的VH

作为上述VH的氨基酸序列，例如可以列举：序列编号70所示的氨基酸序列中导入了选自第14位的Pro取代为Leu、第20位的Leu取代为Ile、第27位的Gly取代为Phe、第29位的Val取代为Leu、第30位的Ser取代为Thr、第34位的Val取代为Ala、第37位的Ile取代为Val、第48位的Ile取代为Met、第65位的Ser取代为Asp、第67位的Val取代为Leu、第71位的Val取代为Arg、第76位的Asn取代为Ser、第78位的Phe取代为Val、第82位的Leu取代为Met、第85位的Val取代为Leu、第92位的Val取代为Lys、第94位的Tyr取代为Phe或第109位的Thr取代为Ile的改变中的至少1种改变后的氨基酸序列。

另外，作为本发明的人源化抗体所含的VL，优选以下的(1)～(15)。

(1)包含序列编号71所示的氨基酸序列中的第7位的Pro、第10位的Val、第12位的Glu、第14位的Pro、第16位的Lys、第19位的Thr、第20位的Ile、第41位的Pro、第48位的Val、第75位的Ser、第81位的Leu、第82位的Lys、第88位的Asp和第90位的Tyr被取代为其他氨基酸残基的氨基酸序列的VL

(2)包含序列编号71所示的氨基酸序列中的第7位的Pro、第10位的Val、第12位的Glu、第14位的Pro、第19位的Thr、第20位的Ile、第41位的Pro、第48位的Val、第75位的Ser和第88位的Asp被取代为其他氨基酸残基的氨基酸序列的VL

(3)包含序列编号71所示的氨基酸序列中的第7位的Pro、第12位的Glu、第19位的Thr、第20位的Ile、第48位的Val、第75位的Ser、第81位的Leu、第88位的Asp和第90位的Tyr被取代为其他氨基酸残基的氨基酸序列的VL

(4)包含序列编号71所示的氨基酸序列中的第7位的Pro、第12位的Glu、第14位的Pro、第16位的Lys、第19位的Thr、第41位的Pro、第75位的Ser和第88位的Asp被取代为其他氨基酸残基的氨基酸序列的VL

(5)包含序列编号71所示的氨基酸序列中的第12位的Glu、第20位的Ile、第41位的Pro、第48位的Val、第75位的Ser、第88位的Asp和第90位的Tyr被取代为其他氨基酸残基的氨基酸序列的VL

(6)包含序列编号71所示的氨基酸序列中的第12位的Glu、第16位的Lys、第19位的Thr、第41位的Pro、第82位的Lys和第88位的Asp被取代为其他氨基酸残基的氨基酸序列的VL

(7)包含序列编号71所示的氨基酸序列中的第16位的Lys、第20位的Ile、第41位的Pro、第48位的Val、第88位的Asp和第90位的Tyr被取代为其他氨基酸残基的氨基酸序列的VL

(8)包含序列编号71所示的氨基酸序列中的第14位的Pro、第20位的Ile、第48位的Val、第75位的Ser、第81位的Leu和第88位的Asp被取代为其他氨基酸残基的氨基酸序列的VL

(9)包含序列编号71所示的氨基酸序列中的第12位的Glu、第14位的Pro、第20位的Ile、第48位的Val、第82位的Lys和第90位的Tyr被取代为其他氨基酸残基的氨基酸序列的VL

(10)包含序列编号71所示的氨基酸序列中的第19位的Thr、第41位的Pro、第48位的Val、第88位的Asp和第90位的Tyr被取代为其他氨基酸残基的氨基酸序列的VL

(11)包含序列编号71所示的氨基酸序列中的第12位的Glu、第14位的Pro、第41位的Pro、第75位的Ser和第88位的Asp被取代为其他氨基酸残基的氨基酸序列的VL

(12)包含序列编号71所示的氨基酸序列中的第41位的Pro、第75位的Ser、第88位的Asp和第90位的Tyr被取代为其他氨基酸残基的氨基酸序列的VL

(13)包含序列编号71所示的氨基酸序列中的第19位的Thr、第41位的Pro、第48位的Val和第88位的Asp被取代为其他氨基酸残基的氨基酸序列的VL

(14)包含序列编号71所示的氨基酸序列中的第20位的Ile、第48位的Val和第88位的Asp被取代为其他氨基酸残基的氨基酸序列的VL

(15)包含序列编号71的氨基酸序列的VL

作为上述VL的氨基酸序列，例如可以列举序列编号71所示的氨基酸序列中导入了选自第7位的Pro取代为Ser、第10位的Val取代为Met、第12位的Glu取代为Thr、第14位的Pro取代为Leu、第16位的Lys取代为Ser、第19位的Thr取代为Lys、第20位的Ile取代为Leu、第41位的Pro取代为Glu或Arg、第48位的Val取代为Met、第75位的Ser取代为Phe、第81位的Leu取代为Val、第82位的Lys取代为Gln、第88位的Asp取代为Ile或第90位的Tyr取代为Phe的改变中的至少1种改变后的氨基酸序列。

另外，作为本发明的人源化抗体，具体可以列举包含以下的(a)或(c)所示的VH和/或(b)所示的VL的人源化抗体。

(a)包含序列编号23所示的氨基酸序列的选自第11位的Leu、第14位的Leu、第19位的Ser、第27位的Phe、第68位的Ser、第71位的Arg、第77位的Gln、第79位的Phe、第83位的Asn、第85位的Leu和第107位的His中的至少1个氨基酸残基被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的抗体的VH

(b)包含序列编号26所示的氨基酸序列中的选自第3位的Val、第8位的Asn、第14位的Leu、第19位的Lys、第75位的Phe、第80位的Asn、第83位的Ile和第88位的Ile中的至少1个氨基酸残基被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的抗体的VL

(c)包含序列编号70所示的氨基酸序列的选自第10位的Gly、第13位的Lys、第19位的Ser、第20位的Leu、第27位的Gly、第29位的Val、第30位的Ser、第37位的Ile、第48位的Ile、第67位的Val、第68位的Thr、第71位的Val、第77位的Gln、第78位的Phe、第79位的Ser、第82位的Leu、第83位的Ser、第85位的Val、第86位的Thr、第87位的Ala、第88位的Ala、第92位的Val、第94位的Tyr和第109位的Thr中的至少1个氨基酸残基被取代为其他氨基酸残基后的氨基酸序列的抗体的VH

作为上述的人源化抗体，还包含将VH的CDR的氨基酸进行如下取代后的抗体。

VH的CDR1包含序列编号29所示的氨基酸序列或序列编号29所示的氨基酸序列中导入了第4位的Val取代为Ala的改变后的氨基酸序列，VH的CDR2包含序列编号30所示的氨基酸序列或序列编号30所示的氨基酸序列中导入了第16位的Ser取代为Asp的改变后的氨基酸序列，VH的CDR3包含序列编号31所示的氨基酸序列的抗体的VH。

作为上述VH的氨基酸序列，例如可以列举序列编号23所示的氨基酸序列中导入了选自第11位的Leu取代为Ala、第14位的Leu取代为Pro、第19位的Ser取代为Asp、第27位的Phe取代为Ala、第34位的Val取代为Ala、第65位的Ser取代为Asp、第68位的Ser取代为Ala、第71位的Arg取代为Lys、第77位的Gln取代为Glu、第79位的Phe取代为Ala、第83位的Asn取代为Asp、第85位的Leu取代为Asp或第107位的His取代为Gln的改变中的至少1种改变后的氨基酸序列。此外还可以列举：序列编号70所示的氨基酸序列导入了选自第10位的Gly取代为Asp、第13位的Lys取代为Gln、第19位的Ser取代为Asp、第20位的Leu取代为Ile、第27位的Gly取代为Phe、第29位的Val取代为Leu、第30位的Ser取代为Thr、第37位的Ile取代为Val、第48位的Ile取代为Met、第65位的Ser取代为Asp、第67位的Val取代为Leu、第68位的Thr取代为Ala、第71位的Val取代为Arg、第76位的Asn取代为Ser、第77位的Gln取代为Glu、第78位的Phe取代为Val、第79位的Ser取代为Phe、第82位的Leu取代为Met、第83位的Ser取代为Asp、第85位的Val取代为Leu、第86位的Thr取代为Gln、第87位的Ala取代为Thr、第88位的Ala取代为Asp、第92位的Val取代为Lys、第94位的Tyr取代为Phe、第109位的Thr取代为Ile或第110位的Leu取代为Met的改变中的至少1种改变后的氨基酸序列。

作为上述VL的氨基酸序列，例如可以列举序列编号26所示的氨基酸序列中导入了选自第3位的Val取代为Ala、第8位的Asn取代为Asp、第14位的Leu取代为Ala、第19位的Lys取代为Thr、第75位的Phe取代为Ser、第80位的Asn取代为Asp、第83位的Ile取代为Val或第88位的Ile取代为Val的改变中的至少1种改变后的氨基酸序列。

作为本发明的人源化抗体的具体例，可以列举包含含有图16、图17或图19所示的氨基酸序列的任意1个的VH和含有图18A或图18B所示的氨基酸序列的任意一个的VL的至少一种的人源化抗体。

另外，作为本发明的人源化抗体的具体例，可以列举包含含有选自序列编号71～87中的任意一个氨基酸序列的VH和/或含有选自序列编号70和88～97中的任意一个氨基酸序列的VL的人源化抗体。

此外，作为本发明的人源化抗体的具体例，可以列举以下的(a)～(w)的人源化抗体。

(a)包含含有序列编号94所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号73所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(b)包含含有序列编号95所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号73所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(c)包含含有序列编号91所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号75所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(d)包含含有序列编号98所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号75所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(e)包含含有序列编号89所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号77所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(f)包含含有序列编号97所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号77所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(g)包含含有序列编号97所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号78所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(h)包含含有序列编号98所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号78所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(i)包含含有序列编号91所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号79所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(j)包含含有序列编号95所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号79所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(k)包含含有序列编号98所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号79所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(l)包含含有序列编号89所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号81所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(m)包含含有序列编号91所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号81所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(n)包含含有序列编号95所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号81所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(o)包含含有序列编号97所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号81所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(p)包含含有序列编号98所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号81所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(q)包含含有序列编号94所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号85所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(r)包含含有序列编号95所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号85所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(s)包含含有序列编号97所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号85所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(t)包含含有序列编号98所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号85所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(u)包含含有序列编号94所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号87所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(v)包含含有序列编号97所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号87所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

(w)包含含有序列编号98所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号87所示的氨基酸序列的VL的人源化抗体。

人抗体原本是指在人体内天然存在的抗体，但是也包括由最近随着基因工程的、细胞工程、发育工程的技术进步所制作的人抗体噬菌体库和人抗体产生转基因动物得到的抗体等。

在人体内天然存在的抗体例如能够通过分离人外周血淋巴细胞、感染EB病毒等使其永生化，进行克隆，由此能够培养产生该抗体的淋巴细胞，能够从培养上清中纯化该抗体。

人抗体噬菌体库是通过将由人B细胞制备的抗体基因插入噬菌体基因，而使得Fab、scFv等的抗体片段在噬菌体表面表达得到的文库。通过该文库，以对固定化有抗原的底物的结合活性为指标，能够回收在表面表达具有所希望的抗原结合活性的抗体片段的噬菌体。该抗体片段还能够通过基因工程的方法变化为由2条完整的H链和2条完整的L链构成的人抗体分子。

人抗体产生转基因动物意味着将人抗体基因整合到细胞内的动物。具体而言，例如能够将小鼠ES细胞导入人抗体基因，将该ES细胞移植到小鼠的早期胚胎后，使其发育，由此制作人抗体产生转基因小鼠。来自人抗体产生转基因动物的人抗体能够通过使用通常的人以外的动物中进行的杂交瘤制作方法，取得人抗体产生杂交瘤，进行培养而使人抗体在培养上清中产生积累来制作。

在构成上述的抗体或抗体片段的氨基酸序列中，缺失、添加、取代或插入了1个以上的氨基酸且与上述的抗体或其抗体片段具有同样的活性的单克隆抗体或其抗体片段也包括在本发明的单克隆抗体或其抗体片段中。

缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸的数量为1个以上，其数量没有特别限定，是指能够通过部位特异性变异导入法[Molecular Cloning 2nd Edition、Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols inmolecular Biology、JohnWiley&Sons(1987-1997)、Nucleic Acids Research、10、6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、79、6409(1982)、Gene、34、315(1985)、Nucleic AcidsResearch、13、4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82、488(1985)]等公知的技术缺失、取代或添加的程度的数量。例如优选为1～数十个，更优选为1～20个，更加优选为1～10个，特别优选为1～5个。

在上述的抗体的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加1个以上的氨基酸残基表示如下情况。即，在相同序列中的任意的1个或多个氨基酸序列中中，存在1个或多个氨基酸残基的缺失、取代、插入或添加。另外，也由同时发生缺失、取代、插入或添加的情况，所取代、插入或添加的氨基酸残基有时为天然型和非天然型任意一种。

作为天然型氨基酸残基，例如可以列举L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸或L-半胱氨酸等。

以下表示能够相互取代的氨基酸残基的优选例。同一组中所含的氨基酸残基能够相互取代。

A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、甲硫氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸

B组：天门冬氨酸、谷氨酸、异天门冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸

C组：天冬酰胺、谷氨酰胺

D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2、4-二氨基丁酸、2、3-二氨基丙酸

E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸

F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸

G组：苯丙氨酸、酪氨酸

在本发明中，作为抗体片段，可以列举Fab、F(ab’)₂、Fab’、单链抗体(scFv)、二聚化V区(diabody，双功能抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含CDR的肽等。

Fab是利用作为蛋白质分解酶的木瓜蛋白酶处理IgG得到的片段中(在H链的第224位的氨基酸残基被切断的)、H链的N末端侧约一半与L链整体以二硫键结合的、分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。

本发明的Fab能够通过将本发明的单克隆抗体用木瓜蛋白酶处理得到。另外，也能够通过将编码该抗体的Fab的DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体，将该载体导入原核生物或真核生物使其表达，来制造Fab。

F(ab’)₂是利用作为蛋白质分解酶的胃蛋白酶分解IgG的铰链区的二硫键的下部得到的、2个Fab区由铰链部分结合而构成的分子量约10万的具有抗原结合活性的片段。

本发明的F(ab’)₂能够利用胃蛋白酶处理本发明的单克隆抗体而得到。另外，也能够将下述的Fab’以硫醚键或二硫键结合来制作。

Fab’是将上述F(ab’)₂的铰链区的二硫键切断得到的分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。本发明的Fab’能够通过将本发明的F(ab’)₂用二硫苏糖醇等的还原剂处理而得到。另外，也能够通过将编码该抗体的Fab’片段的DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体，将该载体导入原核生物或真核生物，使其表达来制造Fab’。

scFv是使用适当的肽接头(以下记作P)将1条VH和1条VL连结得到的VH-P-VL或VL-P-VH多肽且具有抗原结合活性的抗体片段。

本发明的scFv能够通过取得编码本发明的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体，将该表达载体导入原核生物或真核生物，由此使其表达，进行制造。

Diabody是scFv二聚物化而成的抗体片段，且具有二价的抗原结合活性。二价的抗原结合活性可以相同，也可以设为使一者不同的抗原结合活性。

本发明的diabody能够通过取得编码本发明的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA使得肽接头的氨基酸序列的长度为8个残基以下，将该DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体，将该表达载体导入原核生物或真核生物，由此使其表达进行制造。

dsFv是使VH和VL中的各1个氨基酸残基取代为半胱氨酸残基后的多肽经由该半胱氨酸残基间的二硫键结合而成的片段。取代为半胱氨酸残基的氨基酸残基能够根据已知的方法[Protein Engineering、7、697(1994)]，基于抗体的立体结构预测来选择。

本发明的dsFv能够通过取得编码本发明的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，构建编码dsFv的DNA，将该DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体，将该表达载体导入原核生物或真核生物，使其表达进行制造。

包含CDR的肽包含VH或VL的CDR的至少1个区域以上而构成。包含多个CDR的肽能够直接或经由适当的肽接头而结合。

本发明的包含CDR的肽能够通过构建编码本发明的单克隆抗体的VH和VL的CDR的DNA，将该DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体，将该表达载体导入原核生物或真核生物，使其表达进行制造。另外，包含CDR的肽也能够通过Fmoc法或tBoc法等的化学合成法来制造。

本发明的单克隆抗体或其抗体片段包含通过化学或基因工程学使放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、蛋白质等与本发明的单克隆抗体或其抗体片段结合得到的抗体或其抗体片段的衍生物。在使用抗体或其抗体片段的衍生物作为检测方法、定量方法、检测用试剂或定量用试剂时，作为与本发明的单克隆抗体或其抗体片段结合的药剂，可以列举通常的免疫学检测或测定法中使用的标记体。

本发明中的抗体或其抗体片段的衍生物能够通过化学方法[抗体工程学入门、地人书馆(1994)]在本发明的单克隆抗体或其抗体片段的H链或L链的N末端侧或C末端侧、抗体或其抗体片段中的适当的取代基或侧链、进而单克隆抗体或其抗体片段中的糖链等上结合放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、蛋白质等来制造。

另外，本发明中的抗体或其抗体片段的衍生物能够通过如下的基因工程学方法来制造，即，将编码本发明的单克隆抗体或其抗体片段的DNA与编码欲结合的蛋白质的DNA连结，将其插入表达载体，将该表达载体导入适当的宿主细胞，使其表达。

作为放射性同位素，例如可以列举¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、⁶⁴Cu、⁹⁹Tc、⁷⁷Lu、或²¹¹At等。放射性同位素能够通过氯胺T法等与抗体直接结合。另外，也可以使螯合放射性同位素的物质与抗体结合。作为螯合剂，例如可以列举1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。

作为低分子药剂，例如可以列举吖啶酯或洛芬碱等的发光物质、或异硫氰酸荧光素(FITC)或四甲基罗丹明异硫氰酸酯(RITC)等的荧光物质等。

作为使低分子药剂与抗体结合的方法，例如可以列举使药剂与抗体的氨基间经由戊二醛结合的方法、或使药剂的氨基与抗体的羧基经由水溶性碳化二亚胺结合的方法等。

作为高分子药剂，例如可以列举聚乙二醇(以下记作PEG)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯马来酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、或羟基丙基甲基丙烯酰胺等。通过使这些高分子化合物与抗体或抗体片段结合，可以期待(1)对化学、物理或生物性的各种因子的稳定性的提高、(2)血液半衰期的明显延长、(3)免疫原性的消失或抗体产生的抑制等的效果[生物共轭物医药品、广川书店(1993)]。例如作为使PEG与抗体结合的方法，可以列举与PEG化修饰试剂反应的方法等[生物共轭物医药品、广川书店(1993)]。作为PEG化修饰试剂，可以列举对赖氨酸的e-氨基的修饰剂(日本特开昭61-178926号公报)、对天门冬氨酸和谷氨酸的羧基的修饰剂(日本特开昭56-23587号公报)或对精氨酸的胍基的修饰剂(日本特开平2-117920号公报)等。

作为蛋白质，例如可以列举碱性磷酸酶、过氧化物酶或荧光素酶等酶。

本发明涉及包含BMP10拮抗剂的针对高血压和高血压性疾病的治疗剂。另外，以同时或逐次投予BMP9拮抗剂为特征的包含BMP10拮抗剂的对高血压和高血压性疾病的治疗剂也包括在本发明中。此外，以同时或逐次投予BMP10拮抗剂为特征的包含BMP9拮抗剂的以高血压和高血压性疾病的治疗剂也包括在本发明中。

本发明的BMP10拮抗剂中如上所述，包含本发明的抗BMP10单克隆抗体及其抗体片段。

作为高血压，只要是血压超过正常范围的情况均包括在高血压中，特别是有盐敏感性高血压等。其中，正常范围是指收缩期血压低于140mmHg、扩张期血压低于90mmHg。

作为高血压性疾病，有高血压其本身和由高血压持续导致的并发症。作为高血压，可以被分为原因不特定的原发性高血压和因特定原因引起的继发性高血压。被认为是原发性高血压的原因的特别有盐敏感性高血压。

作为继发性高血压，例如可以列举肾血管性高血压、肾实质性高血压、原发性醛固酮增多症、睡眠呼吸暂停综合征、嗜铬细胞瘤、库欣综合征、药物诱导性高血压、妊娠高血压、主动脉缩窄症、甲状腺功能减退症、甲状腺功能亢进症、甲状旁腺功能增强症、脑干血管压迫等。另外，作为高血压性疾病，例如可以列举钠排泄障碍、伴有高血压的肾脏肾小管间质障碍、肾脏肾小球障碍、心脏舒张功能障碍等。

作为由高血压持续导致的并发症，例如有：脑梗塞、脑出血、蛛网膜下腔出血、动脉硬化、心绞痛、心肌梗塞、充血性心力衰竭(例如、收缩性心力衰竭、舒张性心力衰竭等)、心肌病(例如、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制性心肌病等)、右心衰竭、慢性肾病(例如、糖尿病肾病、肾硬化、多囊肾、慢性肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎等)、急性肾功能不全(例如、快速进行性肾小球肾炎、急性肾小管坏死等)、主动脉夹层、主动脉瘤、视网膜出血等。

作为本发明的治疗剂，含有上述本发明的单克隆抗体或该抗体片段作为有效成分。

作为本发明的医药组合物，含有上述本发明的单克隆抗体或该抗体片段作为有效成分。

作为本发明的医药组合物，可以含有生理学上可接受的稀释剂或载体，可以是与其他抗体或抗生物质这样的其他药剂的混合物。作为适当的载体，例如可以列举生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、磷酸缓冲生理盐水葡萄糖液和缓冲生理盐水，但不限定于这些。另外，抗体可以冻结干燥(冻干)，在需要时可以通过添加如上所述的缓冲水溶液来重塑使用。

作为给药途径，例如可以列举口服给药、或口腔内、呼吸道内、直肠内、皮下、肌肉内和静脉内等的非口服给药，优选静脉内给药。作为给药形态，能够以各种形态给药，作为这些形态，例如可以列举喷雾剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏和贴剂等。

乳剂和糖浆剂这样的液体制备物可以使用例如水、蔗糖、山梨糖醇、果糖等的糖类；聚乙二醇、丙二醇等的二醇类、芝麻油、橄榄油、大豆油等的油类；对羟基苯甲酸酯类等的防腐剂；草莓香料、薄荷等的香料类等作为添加剂来制造。

胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等可以使用例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等的赋形剂；淀粉、海藻酸钠等的崩解剂；硬脂酸镁、滑石等的润滑剂；聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等的结合剂；脂肪酸酯等的表面活性剂；甘油等的增塑剂等作为添加剂来制造。注射剂可以使用水、蔗糖、山梨糖醇、木糖、海藻糖、果糖等的糖类；甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇等的糖醇；磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、谷氨酸缓冲液等的缓冲液；脂肪酸酯等的表面活性剂等作为添加剂。

作为适合于非口服给药的制剂，例如可以列举注射剂、栓剂和喷雾剂等。注射剂的情况下，通常以单位给药量安瓿瓶或多给药量容器的状态提供。可以是使用时用适当的载体、例如不含发热物质的灭菌后的水再溶解的粉体。这些剂型通常含有在这些组合物中在制剂上通常所使用的乳化剂、悬浊剂等的添加剂。

作为注射方法，例如可以列举点滴静脉内注射、静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射和皮内注射等。另外，其给药量根据给药对象的年龄、给药途径、给药次数而不同，能够在大范围内变更。

栓剂是使用可可脂、氢化脂肪或羧酸等载体来制备的。另外，喷雾剂也能够使用本发明的抗体或抗体的功能性片段其本身来制备，或者使用不会对接受者(患者)的口腔和呼吸道粘膜产生刺激、且用于将上述抗体或抗体的功能性片段分散为微细颗粒、使其吸收容易的载体等来制备。

作为载体，具体例如可以列举乳糖和甘油等。根据上述抗体或抗体的功能性片段的性质或使用的载体的性质，能够为气溶胶或干粉等的制剂。另外，在这些非口服剂中也可以添加在口服剂中作为添加剂例示的成分。

其给药量根据症状、年龄或体重等而异，通常在口服给药时，对成人，1天约为0.01mg～1000mg，可以将它们1次、或分数次给药。另外，在非口服给药时，可以将1次约0.01mg～1000mg通过皮下注射、肌肉注射或静脉注射来给药。

含有本发明的抗体或该抗体片段、或者它们的衍生物的治疗剂可以仅包含作为有效成分的该抗体或该抗体片段或者它们的衍生物，优选与通常药理学上可接受的1种以上的载体一起混合，作为通过制剂学的技术领域中公知的任意的方法制造得到的医药制剂来提供。

给药途径优选使用在治疗时最有效的途径，可以列举口服给药、或口腔内、呼吸道内、直肠内、皮下、肌肉内或静脉内等的非口服给药，优选列举静脉内给药或皮下给药。

作为投予形态，例如可以列举喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏或贴剂等。

进而，本发明涉及含有特异性识别并与BMP10的氨基酸序列或其立体结构且结合的单克隆抗体或其抗体片段作为有效成分的BMP10的免疫学的检测或测定方法。

在本发明中，作为检测或测定BMP10的量的方法，可以列举任意公知的方法。例如可以列举免疫学的检测或测定方法等。

免疫学的检测或测定方法是指使用实施了标记的抗原或抗体，检测或测定抗体量或抗原量的方法。作为免疫学的检测或测定方法，可以列举放射性物质标记免疫抗体法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法(luminescentimmunoassay)、蛋白质印迹法或物理化学方法等。

以下，对本发明的抗体的制造方法、疾病的治疗方法和疾病的诊断方法进行具体说明。

1.单克隆抗体的制造方法

(1)抗原的制备

成为抗原的BMP10或表达了BMP10的组织能够通过将包含编码BMP10全长或其部分长度的cDNA的表达载体导入大肠菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞等而获得。另外，也可以从表达大量BMP10的人组织中纯化BMP10来获得。另外，也可以将该组织等直接作为抗原使用。此外，也可以通过Fmoc法或tBoc法等化学合成法制备具有BMP10的部分序列的合成肽，将其用于抗原。

本发明中所用的BMP10能够通过使用Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Current Protocolsinmolecular Biology、John Wiley&Sons(1987-1997)等中记载的方法等，例如通过以下的方法，使编码该BMP10的DNA在宿主细胞中表达来制造。

首先，通过将包含编码BMP10的部分的全长cDNA插入适当的表达载体的启动子的下游，制作重组载体。也可以代替上述全长cDNA，而使用基于全长cDNA所制备的包含编码多肽的部分的适当长度的DNA片段。接着，将所得到的该重组载体导入适合于该表达载体的宿主细胞，由此能够得到生产多肽的转化株。

作为表达载体，只要是能够在所使用的宿主细胞中自我复制或整合到染色体中且在能够转录编码多肽的DNA的位置含有适当的启动子就能够使用任意表达载体。

作为宿主细胞，只要是大肠杆菌等属于埃希氏菌属等的微生物、酵母、昆虫细胞、或动物细胞等能够表达目标基因的细胞，则可以使用任何细胞。

在使用大肠杆菌等的原核生物作为宿主细胞的情况下，重组载体优选为能够在原核生物中自我复制同时包含启动子、核糖体结合序列、编码BMP10的部分的DNA和转录终结序列的载体。另外，该重组载体中，转录终结序列并不是必须的，但优选在结构基因的正下方配置转录终结序列。此外，该重组载体中还可以包含控制启动子的基因。

作为该重组载体，优选使用将作为核糖体结合序列的Shine Dalgarno序列与起始密码子之间调节为适当距离(例如6～18个碱基)的质粒。

另外，作为编码该BMP10的DNA的碱基序列，能够以成为最适合在宿主内的表达的密码子的方式取代碱基，由此能够提高目标BMP10的生产率。

作为表达载体，只要是能够在使用的宿主细胞中发挥功能的载体，则能够使用任意载体，例如可以列举pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上由Roche Diagnostics公司制)、pKK233-2(Pharmacia公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(Qiagen公司制)、pKYP10(日本特开昭58-110600号公报)、pKYP200[AgriculturalBiological Chemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制)、pTrs30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[由大肠杆菌IGHA2(FERM BP-400)制备、日本特开昭60-221091号公报]、pGKA2[由大肠杆菌IGKA2(FERM BP-6798)制备、日本特开昭60-221091号公报]、pTerm2(美国专利第4，686，191号说明书、美国专利第4，939，094号说明书、美国专利第5，160，735号说明书)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司制)、pET系统(Novagen公司制)或pME18SFL3(东洋紡公司制)等。

作为启动子，只要能够在使用的宿主细胞中发挥功能，则可以为任意启动子。例如还可以列举trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子或T7启动子等来自大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，例如可以列举将2个Ptrp串联而成的串联启动子、tac启动子、lacT7启动子或let I启动子等的人为设计改变的启动子等。

作为宿主细胞，例如可以列举大肠杆菌XL-1Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49或大肠杆菌DH5α等。

作为重组载体向宿主细胞中的导入方法，只要是向使用的宿主细胞中导入DNA的方法则可以采用任意方法，例如可以列举使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、69、2110(1972)、Gene、17、107(1982)、Molecular&General Genetics、168、111(1979)]。

在使用动物细胞作为宿主的情况下，作为表达载体，只要能够在动物细胞中发挥功能则可以使用任意表达载体，例如可以列举pcDNAI(Invitrogen公司制)、pcDM8(Funakoshi公司制)、pAGE107[日本特开平3-22979号公报；Cytotechnology,3,133(1990)]、pAS3-3(日本特开平2-227075号公报)、pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制)、pcDNA3.1(Invitrogen公司制)、pREP4(Invitrogen公司制)、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3或pKANTEX93(国际公开第97/10354号)等。

作为启动子，只要能够在动物细胞中发挥功能，则可以使用任意启动子，例如可以列举巨细胞病毒(CMV)的immediate early(IE)基因的启动子、SV40的早期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热冲击启动子、SRα启动子或Moloney小鼠白血病病毒的启动子或增强子。另外，也可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。

作为宿主细胞，例如可以列举人白血病细胞Namalwa细胞、猴细胞COS细胞、中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞(Journal of Experimental Medicine、108、945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA、60、1275(1968)；Genetics、55、513(1968)；Chromosoma、41、129(1973)；Methods in Cell Science、18、115(1996)；Radiation Research、148、260(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77、4216(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA、60、1275(1968)；Cell、6、121(1975)；Molecular Cellgenetics、Appendix I、II(pp.883-900))、CHO/DG44、CHO-K1(ATCC编号：CCL-61)、DUkXB11(ATCC编号：CCL-9096)、Pro-5(ATCC编号：CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies、Cat#11619)、Pro-3、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NSO、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14、叙利亚仓鼠细胞BHK或HBT5637(日本特开昭63-000299号公报)等。

作为重组载体向宿主细胞的导入方法，只要是能够在动物细胞中导入DNA的方法则任意方法均可以使用。例如可以列举电穿孔法[Cytotechnology、3、133(1990)]、磷酸钙法(日本特开平2-227075号公报)或脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84、7413(1987)]等。

用培养基培养如上得到的保有整合了编码BMP10的DNA的重组载体的微生物、或动物细胞等来源的转化株，使该BMP10在培养物中产生积累，从该培养物采集，由此能够制作BMP10。用培养基培养该转化株的方法能够按照宿主的培养中所使用的通常的方法进行。

在来自真核生物的细胞中表达的情况下，能够得到添加了糖或糖链的BMP10。

在培养用使用了诱导性的启动子的重组载体转化了的微生物时，可以根据需要在培养基中添加诱导剂。例如在培养用使用了lac启动子的重组载体转化了的微生物时，可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷等，在培养用使用了trp启动子的重组载体转化了的微生物时，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。

作为培养将动物细胞作为宿主得到的转化株的培养基，例如可以列举通常所使用的RPMI1640培养基[The Journal of the American Medical Association、199、519(1967)]、Eagle的MEM培养基[Science、122、501(1952)]、Dulbecco改良MEM培养基[Virology、8、396(1959)]、199培养基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、73、1(1950)]、Iscove’sModified Dulbecco’s Medium(IMDM)培养基、或在这些培养基中添加了胎牛血清(FBS)等的培养基等。培养通常在pH6～8、30～40℃、5％CO₂存在下等的条件下进行1～7天。另外，在培养中，可以根据需要在培养基中添加卡那霉素、青霉素等的抗生物质。

作为编码BMP10的基因的表达方法，除了直接表达以外，还可以使用分泌生产或融合蛋白表达等的方法[Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)]。

作为BMP10的生产方法有：在宿主细胞内生产的方法、分泌到宿主细胞外的方法、或在宿主细胞外膜上生产的方法，能够通过改变所使用的宿主细胞或所生产的BMP10的结构，来选择适当的方法。

在宿主细胞内或宿主细胞外膜上生产BMP10的情况下，通过使用Paulson等人的方法[J.Biol.Chem.、264、17619(1989)]、Law等的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86、8227(1989)、Genes Develop.、4、1288(1990)]、日本特开平05-336963号公报或国际公开第94/23021号等中记载的方法，能够在宿主细胞外积极地分泌BMP10。

另外，也能够利用使用二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增系统(日本特开平2-227075号公报)，使BMP10的生产量提高。

所得到的BMP10例如能够如下进行分离、纯化。

在BMP10在细胞内以溶解状态表达的情况下，在培养结束后，将细胞利用离心分离回收，悬浮在水系缓冲液中后，使用超声波破碎机、法式压碎机、Menton Gaulin匀浆机或珠磨机(DYNO-MILL)等来破碎细胞，得到无细胞提取液。

从通过将上述无细胞提取液离心分离而得到的上清中，通过单独或组合使用通常的通常的蛋白质的分离纯化法、即溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙基氨基乙基(DEAE)-琼脂糖凝胶、DIAION HPA-75(三菱化学公司制)等树脂的阴离子交换色谱法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制)等树脂的阳离子交换色谱法、使用丁基琼脂糖凝胶、苯基琼脂糖凝胶等树脂的疏水性色谱法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和色谱法、色谱聚焦法、或等电点电泳等的电泳法等的方法，能够得到纯化标准品。

在BMP10在细胞内形成不溶体并表达的情况下，与上述同样将细胞回收后破碎，进行离心分离，由此作为沉淀组分回收该BMP10的不溶体。将回收的该BMP10的不溶体用蛋白质变性剂可溶化。将该可溶化液稀释或透析，由此将该BMP10恢复成正常的立体结构后，通过与上述同样的分离纯化法，能够得到多肽的纯化标准品。

在BMP10或其糖修饰体等的衍生物被分泌到细胞外的情况下，能够在培养上清中回收该BMP10或其糖修饰体等的衍生物。将该培养上清与上述同样地利用离心分离等方法来处理，由此取得可溶性组分，从该可溶性组分使用与上述同样的分离纯化法，由此能够得到纯化标准品。

另外，本发明中使用的BMP10也能够通过Fmoc法或tBoc法等化学合成法来制造。另外，也能够利用能够利用Devanst chemtech公司制、Perkin Elmer公司制、Pharmacia公司制、Protein Technology Instrument公司制、Synthecell-Vega公司制、Perceptive公司制或岛津制作所公司制等的肽合成机进行化学合成。

(2)动物的免疫和融合用抗体产生细胞的制备

对3～20周龄的小鼠、大鼠或仓鼠等的动物免疫(1)中得到的抗原,采集该动物的脾脏、淋巴结或末梢血中的抗体产生细胞。另外，在免疫原性低且在上述的动物中没有确认到充分的抗体滴度的上升的情况下，也能够使用BMP9敲除小鼠作为被免疫动物。

免疫通过在动物的皮下、皮内、静脉内或腹腔内例如与弗氏完全佐剂、或氢氧化铝凝胶和百日咳菌疫苗等的适当的佐剂一起投予抗原来进行。在抗原为部分肽的情况下，制作与BSA(牛血清白蛋白)或KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)等的载体蛋白的复合物，将其用作免疫原。

抗原的投予在第1次投予后，每隔1～2周进行2～10次。每次投予后第3～7天日由眼底静脉丛采血，利用酶免疫测定法[Antibodies-A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory(1988)]等测定其血清的抗体滴度。将对于免疫中使用的抗原，其血清显示充分的抗体滴度的动物作为融合用抗体产生细胞的供给源。

在抗原的最终投予后第3～7天，由免疫后的动物摘取脾脏等包含抗体产生细胞的组织，收集抗体产生细胞。在使用脾脏细胞的情况下，将脾脏切碎后，离心分离，进而除去红细胞，由此获得融合用抗体产生细胞。

(3)骨髓瘤细胞的制备

作为骨髓瘤细胞，使用由小鼠得到的株化细胞，例如可以使用8-氮鸟嘌呤耐性小鼠(来自Balb/C)骨髓瘤细胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiologyand Immunology、18、1(1978)]、P3-NS1/1Ag41(NS-1)[European J.Immunology、6、511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature、276、269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology、123、1548(1979)]或P3-X63-Ag8(X63)[Nature、256、495(1975)]等。

该骨髓瘤细胞用正常培养基[添加有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素、FBS和8-氮鸟嘌呤的RPMI1640培养基]传代，在细胞融合的3～4天前用正常培养基传代，确保融合当日2×10⁷个以上的细胞数。

(4)细胞融合与单克隆抗体产生杂交瘤的制备

将(2)中得到的融合用抗体产生细胞和(3)中得到的骨髓瘤细胞用最低必需培养基(MEM)培养基或PBS(磷酸二钠1.83g、磷酸一钾0.21g、食盐7.65g、蒸留水1升、pH7.2)充分清洗，以细胞数为融合用抗体产生细胞：骨髓瘤细胞＝5～10：1的方式混合，离心分离后，除去上清。

将沉淀的细胞团块充分地分散后，在37℃一边搅拌一边加入聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培养基和二甲亚砜的混合液。进而每1～2分钟添加MEM培养基1～2mL，这样数次后，加入MEM培养基使总量达到50mL。离心分离后，除去上清，将沉淀的细胞团块缓慢分散后，使融合用抗体产生细胞在HAT培养基[添加有次黄嘌呤、胸苷和氨基蝶呤的正常培养基]中将细胞缓慢悬浮。将该悬浊液在5％CO₂培养箱中于37℃培养7～14天。

培养后，吸取培养上清的一部分，通过后述的结合测试等的杂交瘤的选择方法，选择与包含BMP10的抗原反应但不与不含BMP10的抗原反应的细胞群。然后，反复进行2次通过极限稀释法的克隆[第1次使用HT培养基(从HAT培养基中去除了氨基蝶呤的培养基)、第2次使用正常培养基]，选择确认到稳定且强的抗体滴度的的克隆作为单克隆抗体产生杂交瘤。

(5)纯化单克隆抗体的制备

对进行了姥鲛烷处理[腹腔内投予2，6，10，14-四甲基十五烷(Pristane)0.5mL，饲养2周]的8～10周龄的小鼠或裸小鼠，在腹腔内注射(4)中得到的单克隆抗体产生杂交瘤。经过10～21天杂交瘤发生腹水癌化。从该小鼠收集腹水，进行离心分离除去固体成分后，用40～50％硫酸铵进行盐析，通过辛酸沉淀法、DEAE-琼脂糖凝胶柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱进行纯化，收集IgG或IgM组分，作为纯化单克隆抗体。

另外，将(4)中得到的单克隆抗体产生杂交瘤用添加有10％FBS的RPMI1640培养基等培养后，通过离心分离，除去上清，悬浮于Hybridoma-SFM培养基，培养3～7天。将所得到的细胞悬浊液离心分离，由所得到的上清，利用蛋白A柱或蛋白G柱进行纯化，收集IgG组分，也能够得到纯化单克隆抗体。此外，也可以在Hybridoma-SFM培养基中添加5％Daigo GF21。

抗体的亚类的确定使用亚类分型试剂盒通过酶免疫测定法进行。蛋白量的定量能够通过Lowry法和280nm时的吸光度计算。

(6)单克隆抗体的选择

单克隆抗体的选择通过以下所示的利用酶免疫测定法的结合测试和利用Biacore的动力学(kinetics)解析来进行。

(6-a)结合测试

作为抗原，使用由(1)中得到的将包含编码BMP10的cDNA的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞等中得到的基因导入细胞、重组蛋白或人组织得到的纯化多肽或部分肽等。在抗原为部分肽的情况下，可以制作并使用与BSA或KLH等载体蛋白的复合体。

将抗原分注于96孔板等板，进行固相化后，作为第1抗体分注血清、杂交瘤的培养上清或纯化单克隆抗体等的被测物质，使其反应。用PBS或包含0.05～0.1％的Tween-20的PBS(以下，也称为PBST)等充分清洗后，作为第2抗体分注由生物素、酶、化学发光物质或放射线化合物等标记后的抗免疫球蛋白抗体使其反应。用PBST充分清洗后，进行对应于第2抗体的标记物质的反应，选择对免疫原特异性反应的单克隆抗体。

另外，本发明的单克隆抗体也能够通过在上述的结合测试体系中添加被检抗体使其反应而取得。即，通过筛选在添加被检抗体时抑制单克隆抗体的结合的抗体，能够获得在对BMP10的氨基酸序列或其立体结构的结合上与所取得的单克隆抗体竞争的单克隆抗体。

此外，能够结合于与本发明的单克隆抗体所识别的表位相同的表位的抗体能够通过鉴定由上述的结合测定体系所取得的抗体的表位，制作模拟所鉴定得到的表位的、部分合成肽、或表位的立体结构的合成肽等，通过进行免疫而取得。

(6-b)通过Biacore的动力学解析

使用Biacore T100，测定抗原与被测物之间的结合的动力学，用仪器附带的的解析软件解析其结果。通过胺偶联法将抗小鼠IgG抗体固定于传感器芯片CM5之后，流通杂交瘤培养上清或纯化单克隆抗体等的被测物质，使适当量结合，进而流通浓度已知的多个浓度的抗原，测定结合、解离。

对所得到的数据，使用仪器附带的软件，利用1：1结合模型的动力学解析，获得各种参数。或者，将人BMP10例如利用胺偶联法固定在传感器芯片上后，流通浓度已知的多个浓度的纯化单克隆抗体，测定结合、解离。对所得到的数据，使用仪器附带的软件进行利用二价结合模型的动力学解析，获得各种参数。

2.基因重组抗体的制作

作为基因重组抗体的制作例，以下表示人型嵌合抗体和人源化抗体的制作方法。

(1)基因重组抗体表达用载体的构建

基因重组抗体表达用载体为重组有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体，能够通过在动物细胞用表达载体上分别克隆编码人抗体的CH和CL的DNA来构建。

人抗体的C区能够使用任意的人抗体的CH和CL。例如，使用人抗体的γ1亚类的CH和κ类的CL等。编码人抗体的CH和CL的DNA使用cDNA，但也可以使用包含外显子和内含子的染色体DNA。

动物细胞用表达载体中，只要能够重组入编码人抗体的C区的基因并进行表达的载体则可以任意使用。例如使用pAGE107[Cytotechnol.、3、133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.、101、1307(1987)]、pHSG274[Gene、27、223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78、1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.、4、173(1990)]、或pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.、13、79(1993)]等。另外，在表达IgG4PE R409K的情况下，例如可以使用N5KG4PE R409K(国际公开第2006/033386号)等。

动物细胞用表达载体中启动子和增强子使用SV40的早期启动子[J.Biochem.、101、1307(1987)]、Moloney小鼠白血病病毒LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.、149、960(1987)]或免疫球蛋白H链的启动子[Cell、41、479(1985)]和增强子[Cell、33、717(1983)]等。

作为基因重组抗体表达用载体，从基因重组抗体表达载体的构建的容易性、向动物细胞的导入的容易性、动物细胞内的抗体H链和L链的表达量的平衡均衡等的观点出发，能够使用抗体H链和L链存在于同一载体上的类型(串联型)的基因重组抗体表达用载体[J.Immunol.Methods、167、271(1994)]。另外，也可以使用抗体H链和L链存在于各自的载体上的类型。作为串联型的基因重组抗体表达用载体使用pKANTEX93(国际公开第97/10354号)、pEE18[Hybridoma、17、559(1998)]或N5KG4PE R409K(国际公开第2006/033386号)等。

(2)编码源自人以外的动物的抗体的V区的cDNA的取得和氨基酸序列的解析

编码非人抗体的VH和VL的cDNA的取得和氨基酸序列的解析能够如下进行。

由产生非人抗体的杂交瘤细胞提取mRNA，合成cDNA。将合成的cDNA克隆到噬菌体或质粒等的载体上，制作cDNA文库。

由上述文库，使用编码小鼠抗体的C区部分或V区部分的DNA作为探针，将具有编码VH或VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒分别分离。分别确定重组噬菌体或重组质粒上的目标小鼠抗体的VH或VL的全碱基序列，由碱基序列分别推定VH或VL的全氨基酸序列。

制作产生非人抗体的杂交瘤细胞的人以外的动物使用小鼠、大鼠、仓鼠或兔等，但只要能够制作杂交瘤细胞，则也可以使用任何动物。

在由杂交瘤细胞的全RNA的制备中使用硫氰酸胍-三氟乙酸铯法[Methods inEnzymol.、154、3(1987)]或RNA easy kit(Qiagen公司制)等的试剂盒等。

在从全RNA制备mRNA时，使用寡聚(dT)固定化纤维素柱法[Molecular Cloning、ALaboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]、或Oligo-dT30＜Super＞mRNA Purification Kit(Takara Bio公司制)等的试剂盒等。另外，也能够使用Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen公司制)或Quick Prep mRNAPurification Kit(Pharmacia公司制)等的试剂盒，从杂交瘤细胞制备mRNA。

在cDNA的合成和cDNA文库的制作时，使用公知的方法[Molecular Cloning、ALaboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols inmolecular Biology、Supplement 1、John Wiley &Sons(1987-1997)]、或SperScript plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Invitrogen公司制)、或ZAP-cDNA Synthesis Kit(Stratagene公司制)等的试剂盒等。

在制作cDNA文库时，作为重组有以从杂交瘤细胞提取的mRNA作为模板所合成的cDNA的载体，只要是重组有该cDNA的载体，任何载体都可以使用。例如使用ZAP ExPress[Strategies、5、58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research、17、9494(1989)]、λZAPII(Stratagene公司制)、λgt10、λgt11[DNA Cloning：A PracticalApproach、I、49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech公司制)、λEx Cell、pT7T3-18U(Pharmacia公司制)、pcD2[Mol.Cell.Biol.、3、280(1983)]或pUC18[Gene、33、103(1985)]等。

用于导入由噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌可以使用能够导入、表达和维持该cDNA文库的任何大肠杆菌。例如使用XL-1Blue MRF[Strategies、5、81(1992)]、C600[Genetics、39、440(1954)]、Y1088、Y1090[Science、222、778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.、166、1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.、16、118(1966)]或JM105[Gene、38、275(1985)]等。

从cDNA文库选择编码非人抗体的VH或VL的cDNA克隆时，使用利用了同位素或荧光标记后的探针的菌落杂交法或噬菌斑杂交法[Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]等。

另外，制备引物，将由mRNA合成的cDNA或cDNA文库作为模板，进行聚合酶链反应法[以下，记作PCR法、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols inmolecular Biology、Supplement 1、John Wiley&Sons(1987-1997)]，由此也能够制备编码VH或VL的cDNA。

将所选择的cDNA用适当的内切酶等切断后，克隆到pBluescriptSK(-)(Stratagene公司制)等的质粒上，通过通常使用的碱基序列解析方法等确定该cDNA的碱基序列。碱基序列解析方法例如进行了双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74、5463(1977)]等的反应后，使用ABI PRISM3700(PEBiosystems公司制)或A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia公司制)等的碱基序列自动分析装置等。

从确定了的碱基序列分别推测VH和VL的全氨基酸序列，与已知的抗体的VH和VL的全氨基酸序列[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]比较，由此分别确认所取得的cDNA是否编码包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整的氨基酸序列。

关于包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整的氨基酸序列，能够通过与已知的抗体的VH和VL的全氨基酸序列[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]比较，来推测分泌信号序列的长度和N末端氨基酸序列，进而能够鉴定它们所属的亚群。另外，VH和VL的各CDR的氨基酸序列也能够通过与已知的抗体的VH和VL的氨基酸序列[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]比较来发现。

另外，关于所得到的VH和VL的完整的氨基酸序列，例如对于SWISS-PROT或PIR-Protein等的任意的数据库，进行BLAST法[J.Mol.Biol.、215、403(1990)]等的同源性检索，由此能够确认VH和VL的完整的氨基酸序列是否为新的序列。

(3)人型嵌合抗体表达载体的构建

通过在(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各个基因的上游分别克隆分别编码非人抗体的VH或VL的cDNA，由此能够构建人型嵌合抗体表达载体。

为了连结编码非人抗体的VH或VL的cDNA的3’末端侧与人抗体的CH或CL的5’末端侧，制作连结部分的碱基序列编码适当的氨基酸、且成为适当的内切酶识别序列的方式设计的VH和VL的cDNA。

将制作得到的VH和VL的cDNA以它们以适当的形式表达的方式分别克隆到(1)中得到的人型CDR移植抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，构建人型嵌合抗体表达载体。

另外，也可以使用在两端具有适当的内切酶的识别序列的合成DNA通过PCR法分别扩增编码非人抗体VH或VL的cDNA，克隆到(1)中得到的基因重组抗体表达用载体。

(4)编码人型CDR移植抗体的V区的cDNA的构建

编码人型CDR移植抗体的VH或VL的cDNA能够如下构建。

分别选择移植非人抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列。所选择的FR的氨基酸序列只要是源自人抗体，则可以使用任意序列。

例如使用Protein Data Bank等的数据库中登录的人抗体的FR的氨基酸序列、或人抗体的FR的各亚群的共通氨基酸序列[A.L.F.DNA、US Dept.Health and HumanServices(1991)]等。为了抑制抗体的结合活性的降低，选择与原始的抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列具有尽可能高的同源性(至少60％以上)的FR的氨基酸序列。

然后，对所选择的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列分别移植原始的非人抗体的CDR的氨基酸序列，分别设计人型CDR移植抗体的VH或VL的氨基酸序列。考虑可看做抗体基因的碱基序列的密码子的使用频度[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]，将设计的氨基酸序列转换成DNA序列，分别设计编码人型CDR移植抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。

根据所设计的DNA序列，合成由100个碱基左右的长度构成的数条合成DNA，使用它们进行PCR反应。该情况下，从PCR反应中的反应效率和能够合成的DNA长度的观点出发，优选对H链、L链都设计6条合成DNA。

另外，通过在位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的内切酶的识别序列，能够在(1)中得到的人型CDR移植抗体表达用载体中容易地克隆编码人型CDR移植抗体的VH或VL的cDNA。

或者，能够通过使用根据所设计的DNA序列，作为1条DNA所合成的各H链、L链全长合成DNA来实施。

PCR反应后，将扩增产物分别克隆到pBluescript SK(-)(Stratagene公司制)等的质粒中，通过与(2)中记载的方法同样的方法，确定碱基序列，取得具有编码所希望的人型CDR移植抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列的质粒。

(5)人型CDR移植抗体的V区的氨基酸序列的改变

如果仅将非人抗体的VH和VL的CDR移植到人抗体的VH和VL的FR，则人型CDR移植抗体的抗原结合活性与原始的非人抗体相比降低[BIO/TECHNOLOGY、9、266(1991)]。

在人型CDR移植抗体中，鉴定人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列中，参与与直接抗原的结合的氨基酸残基、与CDR的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基、以及维持抗体的立体结构间接地参与与抗原的结合的氨基酸残基，将这些氨基酸残基取代为原始的非人抗体的氨基酸残基，由此能够使降低了的抗原结合活性上升。

为了鉴定与抗原结合活性相关的FR的氨基酸残基，通过使用X射线结晶解析[J.Mol.Biol.、112、535(1977)]或电脑建模[Protein Engineering、7、1501(1994)]等，能够进行抗体的立体结构的构建和解析。另外，对各个抗体制作数种改型体，反复研究各自与抗原结合活性的相关性，进行试错，由此能够取得具有所需的抗原结合活性的改型人型CDR移植抗体。

人抗体的VH和VL的FR的氨基酸残基通过使用改型用合成DNA进行(4)中记载的PCR反应，能够进行改型。关于PCR反应后的扩增产物通过(2)中记载的方法来确定碱基序列，确认实施了目标的改型。

(6)利用表面重塑法的编码人源化抗体的V区的cDNA的构建

利用表面重塑法的编码人源化抗体的VH或VL的cDNA能够如下构建。

分别选择非人抗体的VH或VL的FL的FR的氨基酸序列中被认为对抗原结合活性影响低的氨基酸残基，将该氨基酸残基取代为被认为抗原性低的氨基酸残基。

将这样设计的VH或VL的氨基酸序列考虑可看做抗体的基因的碱基序列的密码子的使用频度[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]转换成DNA序列，分别设计利用表面重塑法的编码人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。

根据所设计的DNA序列，合成由100个碱基左右的长度构成的数条合成DNA，使用它们进行PCR反应。该情况下，从PCR反应中的反应效率和能够合成的DNA长度的观点出发，优选对H链、L链均设计6条合成DNA。

另外，通过在位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的内切酶的识别序列，能够在(1)中得到的人源化抗体表达用载体容易地克隆利用表面重塑法的编码人源化抗体的VH或VL的cDNA。

或者，能够通过使用根据所设计的DNA序列，作为1条DNA所合成的各H链、L链全长合成DNA来实施。

PCR反应后，将扩增产物分别克隆到pBluescript SK(-)(Stratagene公司制)等的质粒上，通过与(2)中记载的方法同样的方法，确定碱基序列，取得具有编码所希望的人抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列的质粒。

(7)人源化抗体表达载体的构建

在(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，分别克隆所构建的编码基因重组抗体的VH或VL的cDNA，能够构建人源化抗体表达载体。

例如，通过在(4)、(5)或(6)中得到的构建人源化抗体的VH或VL时使用的合成DNA中，位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的内切酶的识别序列，能够以它们以适当的形式表达的方式分别克隆到(1)中得到的人源化抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游。

(8)基因重组抗体的瞬时表达

使用(3)和(7)中得到的基因重组抗体表达载体、或它们经改型后的表达载体，进行基因重组抗体的瞬时表达，能够有效地评价所制作的多种人源化抗体的抗原结合活性。

导入表达载体的宿主细胞只要能够表达基因重组抗体的宿主细胞，则则可以使用任何细胞，例如使用COS-7细胞(ATCC编号：CRL1651)[Methods in Nucleic Acids Res.、CRC Press、283(1991)]。

表达载体向COS-7细胞的导入使用DEAE-葡聚糖法[Methods in Nucleic AcidsRes.、CRC Press、(1991)]、或脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84、7413(1987)]等。

导入表达载体后，使用酶免疫抗体法[Monoclonal Antibodies-Principles andpractice、Third edition、Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、单克隆抗体实验手册、Kodansha Scientific(1987)]等测定培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性。

(9)稳定表达基因重组抗体的转化株的取得和基因重组抗体的制备

将(3)和(7)中得到的基因重组抗体表达载体导入适当的宿主细胞，由此能够得到稳定表达基因重组抗体的转化株。

表达载体向宿主细胞的导入使用电穿孔法[日本特开平2-257891号公报、Cytotechnology、3、133(1990)]等。

导入基因重组抗体表达载体的宿主细胞只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞，则可以使用任何细胞。

例如，使用CHO-K1(ATCC编号：CCL-61)、DUkXB11(ATCC编号：CCL-9096)、Pro-5(ATCC编号：CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies、Cat#11619)、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NSO、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14(ATCC编号：CRL1581)、小鼠P3-X63-Ag8653细胞(ATCC编号：CRL1580)、二氢叶酸还原酶基因缺损了的CHO细胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77、4216(1980)]、获得了凝集素耐性的Lec13[Somaticcell and Molecular Genetics、12、55(1986)]、α1，6-岩藻糖转移酶基因缺损了的CHO细胞(国际公开第2005/035586号、国际公开第02/31140号)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC编号：CRL1662)等。

导入表达载体后，稳定表达基因重组抗体的转化株通过用包含G418硫酸盐等药剂的动物细胞培养用培养基培养进行选择(日本特开平2-257891号公报)。

动物细胞培养用培养基使用RPMI1640培养基(Invitrogen公司制)、GIT培养基(日本制药公司制)、EX-CELL301培养基(JRH公司制)、IMDM培养基(Invitrogen公司制)、Hybridoma-SFM培养基(Invitrogen公司制)、或在这些培养基中添加了FBS等各种添加物的培养基等。

通过在培养基中培养所得到的转化株，使基因重组抗体在培养上清中表达积累。培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性能够通过ELISA法等来测定。另外，转化株能够利用DHFR扩增系统(日本特开平2-257891号公报)等，使基因重组抗体的表达量上升。

基因重组抗体能够从转化株的培养上清使用蛋白A柱来纯化[MonoclonalAntibodies-Principles and practice、Third edition、Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。另外，另外，也可以组合凝胶过滤、离子交换色谱法和超滤等蛋白质的纯化中使用的方法来纯化。

纯化了的基因重组抗体的H链、L链或抗体分子整体的分子量能够使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法[Nature、227、680(1970)]、或蛋白质印迹法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice、Third edition、Academic Press(1996)、Antibodies-ALaboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等来测定。

3.纯化单克隆抗体或其抗体片段的活性评价

纯化了的本发明的单克隆抗体或其抗体片段的活性评价能够如下进行。

对于BMP10和BMP10表达组织的结合活性使用利用上述的1-(6-a)所述的结合测试和(6-b)所述的Biacore系统等的表面等离子体共振法来测定。另外，使用荧光抗体法[Cancer Immunol.Immunother.、36、373(1993)]等来测定。

双特异性抗体的制造例如能够通过国际公开第2009/131239号中记载的方法等公知的方法来进行。

4.使用本发明的抗BMP10单克隆抗体或该抗体片段的疾病的治疗方法

本发明的单克隆抗体或该抗体片段能够用于治疗高血压和高血压性疾病。

含有本发明的单克隆抗体或其抗体片段或者它们的衍生物的治疗剂可以仅包含作为有效成分的该抗体或该抗体片段或者它们的衍生物，但通常与药理学上可接受的1种以上的载体一起混合，作为通过制剂学技术领域中公知的方法制造的医药制剂提供。

作为给药途径，例如可以列举口服给药、或口腔内、呼吸道内、直肠内、皮下、肌肉内或静脉内等的非口服给药。作为给药形态，例如可以列举喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏或贴剂等。

作为适合于口服给药的制剂，例如可以列举乳剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等。

乳剂或糖浆剂这样的液体调制物可以使用水、蔗糖、山梨糖醇或果糖等的糖类、聚乙二醇或丙二醇等二醇类、芝麻油、橄榄油或大豆油等的油类、对羟基苯甲酸酯类等的防腐剂、或草莓香料或薄荷等的香料类等作为添加剂来制造。

胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等是使用乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露糖醇等的赋形剂、淀粉或海藻酸钠等的崩解剂、硬脂酸镁或滑石等的润滑剂、聚乙烯醇、羟丙基纤维素或明胶等的结合剂、脂肪酸酯等的表面活性剂或甘油等的增塑剂等作为添加剂来制造的。

作为适合于非口服给药的制剂，例如可以列举注射剂、栓剂或喷雾剂等。

注射剂是使用包含盐溶液、葡萄糖溶液或其两者的混合物的载体等来制造的。

栓剂是使用可可脂、氢化脂肪或羧酸等载体来制造的。

喷雾剂是使用不会对接受者的口腔和呼吸道粘膜产生刺激、且将本发明的单克隆抗体或其抗体片段分散为微细的颗粒、使吸收容易的载体等来制造的。作为载体，例如使用乳糖或甘油等。另外，也可以作为气溶胶或干粉进行制造。

此外，在上述非口服剂中，也可以添加在适合于口服给药的制剂中作为添加剂例示的成分。

以下，利用实施例具体说明本发明，但本发明并不限定于下述实施例。使用的试剂种类只要没有特别说明，则为按照所附说明书使用的试剂。

实施例

[实施例1]抗人BMP10单克隆抗体的制作

1-1)免疫原的制备

作为免疫原使用人BMP10重组蛋白质或人BMP10成熟二聚体(R&D systems公司制、Cat#2926-BP)。人BMP10重组蛋白质按照国际公开第2014/007198号的实施例20中记载的方法制备。由该方法制备的人BMP10重组蛋白质包含成熟体、N末前肽体和全长体。

1-2)对动物的免疫和抗体产生细胞的制备

佐剂使用Sigma Adjuvant System(注册商标)(Sigma Aldrich公司制)、或Alum+百日咳疫苗佐剂(Nakarai Tesque公司制)，按照所附说明书制备将实施例1的1-1)中制备的人BMP10作为抗原的抗原悬浊液后，对WKY/NcrlCrlj大鼠或SD大鼠通过腹腔和皮下或肌肉内途径进行免疫。作为免疫后的抗原量，人BMP10重组蛋白质以20μg/头进行，人BMP10成熟二聚体以10μg/头进行。免疫包括最终增强(boost)合计进行2次或4次。脾脏在最终投予的第3～4天后摘出。

将摘出的脾脏在最低必需培养基(Nakarai Tesque公司制)(以下称为MEM培养基)中切碎后，通过离心分离(1200rpm、5分钟)回收脾细胞。所得到的脾细胞组分由于包含红细胞，所以添加红细胞裂解液(RED Blood Cell Lysing Buffer)(Sigma Aldrich公司制)，在冰上处理，由此将红细胞去除。或者采集肠骨淋巴结，在MEM培养基中将细胞分散，得到淋巴细胞。所得到的脾细胞或淋巴细胞用MEM培养基清洗2次后，供于细胞融合。

1-3)小鼠骨髓瘤细胞的制备

用在S-Clone克隆培养基CM-B(三光纯药公司制)中添加了庆大霉素(10μg/mL)的培养基(以下记作无血清培养基)驯化培养8-氮鸟嘌呤耐性小鼠骨髓瘤细胞株p3-U1[P3X63Ag8U.1、ATCC：CRL-1597、European Journal of Immunology、6、511(1976)]，确保细胞融合时所需要的细胞数(4×10⁷个以上)，供于细胞融合。

1-4)杂交瘤的制作

将实施例1的1-2)中得到的小鼠脾细胞或淋巴细胞和实施例1的1-3)中得到的骨髓瘤细胞以8：1的比例混合，进行离心分离(1200rpm、5分钟)。对所得到的沉淀组分(细胞群)一边缓慢摇动一边缓慢加入聚乙二醇-1000(纯正化学株式会社制、Cat#69257-1210)、MEM培养基、二甲基亚砜(DMSO、Sigma Aldrich公司制、Cat#D2650)的混合液500μL。然后，在该细胞液中一边缓慢摇动一边加入MEM培养基5mL，进而添加MEM培养基45mL。然后，将上述的包含该细胞液的试管离心分离(900rpm、5分钟)。

将所得到的沉淀组分(细胞团)，使用含有HAT的无血清培养基在96孔板上除去A列以外各接种200μL。此时，脾细胞或淋巴细胞数调整为每一个孔板为1.5×10⁷个/18mL，在37℃、5％CO₂的条件下培养。培养基更换使用含有HAT的无血清培养基适当进行到孔内的细胞达到适合于筛选的细胞数。

1-5)利用固相抗原ELISA的抗BMP10抗体产生杂交瘤的筛选

抗BMP10抗体产生杂交瘤的筛选使用在ELISA用板上将人BMP10固相化后的固相抗原ELISA体系。具体而言，将实施例1的1-1)中制备的人BMP10重组体、或人BMP10成熟二聚体(R&D systems公司制、Cat#2926-BP)用磷酸缓冲液(Nakarai Tesque公司制)调制成0.5μg/mL的容易以50μL/孔分注于96孔的ELISA用板(F96 MAXISORP NUNC-IMMNO PLATE、ThermoFisher Scientific公司制、Cat#442404)，在4℃静置过夜使其吸附。

将固相化液去除后，用PBS清洗3～5次，加入1％BSA-PBS(Nakarai Tesque公司制、Cat#099968-35)200μL/孔，在室温静置1小时，进行封闭。

然后，将杂交瘤上清以50μL/孔进行分注，室温静置1小时。将该板用PBST清洗3～5次后，将由1％BSA-PBS稀释1000倍的Goat F(ab’)₂Anti-Rat IgG-Fc(HRP)，pre-adsorbed(Abcam公司制、Cat#ab6257)以50μL/孔分注，在室温静置1小时。

将该板用PBST清洗3～5次，以50μL/孔添加ABTS(2，2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid、Wako公司制、Cat#016-08521)底物液或TMB底物液，使其显色，得到了适当的显色后，以50μL/孔添加5％SDS溶液或1mol/L盐酸，使用读板器(Spectra Max，Molecular Devices公司制)测定样品波长415nm、参照波长490nm时的吸光度(415nm-490nm)或样品波长450nm、参照波长570nm时的吸光度(450nm-570nm)。

1-6)能够检测BMP信号的细胞的制作

作为产生抗BMP10抗体的杂交瘤的筛选，使用能够检测各种BMP蛋白质的信号的细胞(以下、BMP信号检测细胞)。BMP信号检测细胞使用了日本特开2017-25011号公报的实施例5中记载的Id1-Luc/CHO细胞。

1-7)使用Id1-Luc/CHO的抗BMP10中和抗体产生杂交瘤的筛选

在96孔荧光·发光用板(Corning公司制、Cat#3916)上添加人BMP10成熟二聚体使其终浓度成为3ng/mL。然后，添加杂交瘤培养上清使其终浓度成为50％。然后，以成为5×10⁴个/孔的方式添加用Excell 325培养基[Excell 325 PF CHO(SAFC公司制、Cat#14340C-1000mL)、4mM L-谷氨酰胺、1×青霉素、1×链霉素(Nacalai公司制、Cat#09367-34)、0.5μg/mL hygromycin]悬浊得到的Id1-Luc/CHO细胞液。

此外，所有的样品用Excell 325培养基稀释，如果添加所有的样品，则使其成为100μL/孔。然后，将孔内的液体用板混合器混合均匀后，在37℃培养20小时。20小时后，加入根据所附说明书制备的Nano-Glo荧光素酶Assay测定液(Promega公司制、Cat#N1120)40μL/孔，搅拌后，用Glomax(Promega公司制)测定荧光素酶活性。

关于杂交瘤培养上清中的抗体的中和活性(％)，将不添加杂交瘤培养上清而仅添加BMP10成熟二聚体的孔的值作为0％，将不添加抗体而仅添加了Excell 325培养基的孔的值作为100％，而算出上述抗体的中和活性。

1-8)抗BMP10中和抗体产生杂交瘤的分离

将上述的筛选中显示50％以上的中和活性的样品判断为阳性。判断为阳性的杂交瘤用无血清培养基进行极限稀释，接种到96孔板进行单克隆化。单克隆化对来自第1次判断为阳性的孔的杂交瘤合计进行1～2次。通过以上的操作，分离产生18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体的杂交瘤。

1-9)抗体从杂交瘤的大量取得

将实施例1的1-8)中分离的杂交瘤接种到2个大烧瓶中。培养基使用无血清培养基。在37℃培养6-8天后，回收包含细胞的培养基。将回收了的培养基离心分离，将所得到的培养上清用0.22μm过滤器过滤。

从由过滤器过滤后的培养上清，使用填充了Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare公司制)或Ab-Capchure Extra(Protenova公司制)的空心柱，纯化抗人BMP10抗体。

[实施例2]使用Id1-Luc/CHO细胞取得的抗体与已知抗体的BMP10中和活性比较

关于取得的抗BMP10抗体和已知抗体，使用实施例1的1-6)中制作的Id1-Luc/CHO细胞进行BMP10的中和活性的比较。在96孔荧光·发光用板(Corning公司制、Cat#3916)添加人BMP10成熟二聚体(R&D systems公司制、Cat#2926-BP)使其终浓度成为3ng/mL，然后将已知抗体MAB2926(已知抗体是指MAB2926)和实施例1的1-9)中纯化的抗BMP10抗体18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体、或对照抗体(Purified Rat IgG1λIsotype control、BD公司制、Cat#553993)从终浓度3000ng/mL以3倍稀释阶段性地制备6个浓度进行添加。

然后，将由Excell 325培养基[Excell 325PF CHO(SAFC公司制、Cat#14340C-1000mL)、4mM L-谷氨酰胺、1×青霉素、1×链霉素(Nacalai公司制、Cat#09367-34)、0.5mg/mL hygromycin]悬浊的Id1-Luc/CHO细胞液以成为5×10⁴个/孔的方式添加。添加所有样品后，将孔内的液体用板混合器混匀后，在37℃培养20小时。

20小时后，将按照所附说明书制备的Nano-Glo荧光素酶Assay测定液(Promega公司制、Cat#N1120)以40μL/孔添加并搅拌后，用Glomax(Promega公司制)测定荧光素酶活性。作为抗体的中和活性(％)，将不添加抗体而仅添加了BMP10成熟二聚体的孔的值作为0％，将不添加抗体而仅添加了Excell 325培养基的孔的值作为100％，而算出抗体的中和活性。结果表示于图1。

如图1所示，对照抗体以外，所有抗体都显示对BMP10的中和活性。可知已知抗体MAB2926在3μg/ml时完全无法中和成熟BMP10 3ng/ml。相对于此，取得抗体11H10抗体、12H3抗体、18C1抗体在3μg/ml时能够完全中和成熟BMP10 3ng/ml。另外，18C1抗体、12H3抗体在比MAB2926低浓度时显示BMP10中和活性。

由以上的结果可知，3个取得抗体全部是比已知抗体的BMP10中和活性显著提高的抗体。

[实施例3]

使用人ALK1表达报告细胞的取得抗体和已知抗体的BMP10的中和活性比较

对于所取得的抗BMP10抗体和已知抗体的BMP10的中和活性，使用高表达人ALK1的人ALK1表达报告细胞进行比较。已知抗体使用MAB2926(R&D systems公司)。

3-1)人ALK1表达报告细胞的制作

人ALK1表达报告细胞使用日本特开2017-25011号公报的实施例6中记载的ALK1/Id1-Luc/CHO细胞。

3-2)新型取得抗体和已知抗体的BMP10中和活性比较

在96孔荧光·发光用板(Corning公司制、Cat#3916)中添加人BMP10成熟二聚体(R&D systems公司制、Cat#2926-BP)使其终浓度成为0.3ng/mL。然后，将作为抗BMP10抗体的18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体、MAB2926、或对照抗体(Purified Rat IgG1λIsotypecontrol、BD公司制、Cat#553993)从终浓度3000ng/mL以3倍稀释阶段性地制备成6个浓度进行添加。

然后，将由Excell 325培养基制备的ALK1/Id1-Luc/CHO细胞悬浊液以成为5×10⁴个/孔的方式添加。所有样品都用Excell 325培养基稀释，将人BMP10、抗体稀释液、细胞悬浊液合并起来使其成为100μL/孔。然后，将孔内的液体用板混合器混均后，在37℃培养20小时。

20小时后，添加按照所附说明书制备的Nano-Glo荧光素酶Assay测定液40μL/孔并搅拌后，使用Glomax(Promega公司制)测定荧光素酶活性。关于抗体的中和活性(％)，将不添加抗体而仅添加了BMP10成熟二聚体的孔的值设为0％，将不添加抗体而仅添加了Excell325培养基的孔的值作为100％，算出抗体的中和活性。结果表示于图2。

如图2所示，对照抗体和已知抗体MAB2926在ALK1/Id1-Luc/CHO细胞中不显示中和活性。而取得抗体18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体在ALK1/Id1-Luc/CHO细胞中显示明确的BMP10中和活性。另外，中和活性的强度为18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体的顺序。

由以上的结果可知，取得抗体是在ALK1高表达细胞中显示中和活性的新型抗体。

[实施例4]取得抗体对各种BMP家族分子的抑制作用

为了确认18C1抗体特异性地中和BMP10的现象，使用实施例1的1-6)中制作的Id1-Luc/CHO细胞，研究18C1抗体对各种BMP信号的抑制作用。

在96孔荧光·发光用板(Corning公司制、Cat#3916)中，添加人各种BMP成熟二聚体使其终浓度成为3ng/mL，然后，添加18C1抗体的稀释液使其终浓度成为1.0μg/mL。人各种BMP成熟二聚体使用人BMP2、人BMP4、人BMP6、人BMP7、人BMP9、人BMP10、人BMP15、人GDF5、人GDF7(均为R&D systems公司制)。然后添加由Excell 325培养基[Excell 325 PF CHO(SAFC公司制、Cat#14340C-1000mL)、4mM L-谷氨酰胺、1×青霉素、1×链霉素(Nacalai公司制、Cat#09367-34)、0.5μg/mL hygromycin]悬浊的Id1-Luc/CHO细胞液使其成为5×10⁴个/孔。

所有的样品用Excell 325培养基稀释，最终成为100μL/孔。然后，将孔内的液体用板混合器混均后，在37℃培养20小时。

20小时后，添加按照所附说明书制备的Nano-Glo荧光素酶Assay测定液(Promega公司制、Cat#N1120)40μL/孔并搅拌后，用Glomax(Promega公司制)测定荧光素酶活性。

关于抗体的中和活性(％)，将不添加抗体而仅添加了BMP成熟二聚体的孔的值作为0％，将不添加抗体而仅添加了Excell 325培养基的孔的值作为100％，算出抗体的中和活性。结果表示于图3。

如图3所示可知，18C1抗体是人BMP2、人BMP4、人BMP6、人BMP7、人BMP9、人BMP15、人GDF5、人GDF7引起的信号都没有任何抑制，仅人BMP10引起的信号特异性地抑制的抗体。

[实施例5]编码抗BMP10单克隆抗体的VH和VL的基因序列的分离

5-1)由抗BMP10单克隆抗体产生杂交瘤细胞的总RNA的制备

使用Maxwell 16LEV simplyRNA Tissue kit(Promega公司制#AS1280)，由实施例1中记载的产生18C1抗体、12H3抗体和11H10抗体的杂交瘤1×10⁶个，制备各个杂交瘤的总RNA。

5-2)抗BMP10单克隆抗体的VH和VL的基因克隆

使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司制、Cat#634924)从实施例5-1中取得的各杂交瘤的总RNA 1μg制作cDNA。将所得到的cDNA作为模板，通过组合试剂盒中所附的通用引物A mix(含有正向引物)和编码大鼠的IgG1、IgG2a重链恒定区的反向引物，进行VH的cDNA序列确定。

具体而言，使用大鼠IgG1特异性引物(序列编号1)、大鼠IgG2a特异性引物(序列编号2)，分别与通用引物A相组合，进行PCR反应，扩增各抗体的VH的cDNA片段。

另外，同样使用大鼠Ig(κ)特异性引物(序列编号3)或大鼠Ig(λ)特异性引物(序列编号4)，分别与通用引物A组合，由此进行PCR，扩增各抗体的VL的cDNA片段。

PCR进行包括在94℃30秒钟、72℃3分钟的反应循环5次、包括94℃30秒钟、70℃30秒钟、72℃3分钟的反应循环5次、包括94℃30秒钟、68℃30秒钟、72℃3分钟的反应循环25次。

进行琼脂糖凝胶电泳的结果，来自18C1抗体杂交瘤的cDNA在使用编码IgG1重链恒定区的特异性引物时，得到了PCR扩增产物。来自12H3抗体产生和11H10抗体杂交瘤的cDNA在使用编码IgG2a重链恒定区的特异性引物时，得到了PCR扩增产物。

另外，来自12H3抗体、11H10抗体产生杂交瘤的cDNA在使用大鼠Ig(κ)特异性引物时也得到了PCR扩增产物。来自18C1抗体产生杂交瘤的cDNA在使用大鼠Ig(λ)特异性引物时也得到了PCR扩增产物。将各个PCR扩增产物使用凝胶提取试剂盒(Gel Extraction Kit)(QIAEX II、QIAGEN公司制、Cat#20021)进行了纯化。

使用Zero Blunt TOPO PCR CloningKit for Sequencing(Invitrogen公司制、Cat#K287540SP)将所得到的基因片段插入pCR4载体(Invitrogen公司制)。

将所得到的质粒导入大肠杆菌DH5α株。由所得到的转化株使用自动质粒提取机(Kurabo公司制)提取质粒，分析碱基序列。其结果，确认到取得了在cDNA的5’末端存在推测为起始密码子的ATG序列的全长的VH cDNA和VL cDNA。

5-3)抗人BMP10单克隆抗体V区的基因序列的解析

实施例5-2中得到的18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体的VH的全碱基序列以序列编号5、6、7表示，将由该序列推测得到的包含信号序列的VH的全氨基酸序列以序列编号8、9、10表示，将VL的全碱基序列以序列编号11、12、13表示，将由该序列推测得到的包含信号序列的VL的全氨基酸序列以序列编号14、15、16表示。

另外，将序列编号5、6、7中除掉了信号序列后的碱基序列以序列编号17、18、19表示，将序列编号11、12、13中除掉了信号序列后的碱基序列以序列编号20、21、22表示，将序列编号8、9、10中除掉了信号序列后的氨基酸序列以序列编号23、24、25表示，将序列编号14、15、16中除掉了信号序列的氨基酸序列以序列编号26、27、28表示。

根据与已知的大鼠抗体的序列数据[SEQUENCES of Proteins of ImmunologicalInterest、US Dept.Health and Human Services(1991)]的比较确认了，分离后的各cDNA为包含分泌信号序列的编码18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体的全长cDNA。

将18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体的VH和VL的CDR通过与已知的抗体的氨基酸序列比较来进行鉴定。将18C1抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列以序列编号29、30和31表示，将VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列以序列编号32、33和34表示。将12H3抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列以序列编号35、36和37表示，将VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列以序列编号38、39和40表示。将11H10抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列以序列编号41、42和43表示，将VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列以序列编号44、45和46表示。

5-3)抗BMP10嵌合抗体的制作

18C1嵌合抗体的重组表达使用具有人λ型轻链恒定区和人IgG4改变型重链恒定区的N5LG4PE(R409K)载体，12H3和11H10嵌合抗体的重组表达使用具有人κ型轻链恒定区和人IgG4改变型重链恒定区的N5KG4PE(R409K)载体。在国际专利公报第WO2006033386中使用的N5KG4PE载体骨架中，制作导入了人IgG4重链恒定区的、EU-index中的第409位的Arg取代为Lys的改变的载体，将其命名为N5KG4PE(R409K)载体。另外，在该载体中，将人κ链恒定区部分取代为人λ恒定区的载体命名为N5LG4PE(R409K)载体。将编码VH、VL的cDNA插入上述抗体表达载体。VH插入到SalI、NheI位点之间，VL插入到BgIII、BlpI(λ型)或BgIII、BsiWI(κ型)位点之间。

将18C1抗体的插入的VH的碱基序列和VL的碱基序列以序列编号5、11表示，将由其表达的VH的氨基酸序列和VL的氨基酸序列以序列编号8、14表示。将12H3抗体的插入的VH的碱基序列和VL的碱基序列以序列编号6、12表示，将由其表达的VH的氨基酸序列和VL的氨基酸序列以序列编号9、15表示。将11H10抗体的插入的VH的碱基序列和VL的碱基序列以序列编号7、13表示，将由其表达的VH的氨基酸序列和VL的氨基酸序列以序列编号10、16表示。

18C1抗体的VL、VH的碱基序列的扩增使用由序列编号53～56所示的碱基序列构成的引物进行PCR，12H3抗体的VL、VH的碱基序列的扩增使用由57～60所示的碱基序列构成的引物进行PCR，11H10抗体的VL、VH的碱基序列的扩增使用由61～64所示的碱基序列构成的引物进行PCR。

使用制作的表达载体和Expi293F表达系统试剂盒(Expression System Kit)(Life Technologies公司制)来表达重组嵌合抗体。从培养上清中，使用Mab Select SuRe(GE Healthcare公司制)纯化抗体。使用NAP-25柱(GE Healthcare公司制)将缓冲液置换为D-PBS(-)(Nakarai Tesque公司制、Cat#14249-24)后，测定280nm的吸光度，确定抗体的浓度。作为分子吸光系数使用1.50mL/(mg·cm)。

5-4)利用Biacore的抗BMP10嵌合抗体对人BMP10蛋白质的结合活性评价

为了比较实施例5-3中得到的抗BMP10嵌合抗体和作为已知抗体的MAB2926(R&Dsystems公司)对人BMP10的结合活性，使用利用表面等离子体共振法(SPR法)的BiacoreT100(GE Healthcare Bio-Sciences公司制)测定对人BMP10成熟二聚体(R&Dsystems公司制、Cat#2926-BP)的结合活性。

嵌合抗体的结合活性如下测定。使用人类抗体捕获试剂盒(Human AntibodyCapture Kit)(GE Healthcare Bio-Sciences公司制、Cat#BR-1008-39)，按照所附的说明书，将抗人IgG抗体固定化于CM5传感器芯片(GE Healthcare Bio-Sciences公司制、BR100530)。在固定化有抗人IgG抗体的流动池中，以10μL/分钟的流速添加10秒钟制备为5μg/mL的18C1嵌合抗体(以下称为ch18C1抗体)或12H3嵌合抗体(以下称为ch12H3抗体)、11H10嵌合抗体(以下称为ch11H10抗体)。

另外，接着，将由300ng/mL以3倍稀释阶段性地调制成5个浓度的人成熟BMP10以30μL/分钟的流速，监测结合反应1分钟，监测解离反应30分钟。取得的传感图使用Bia评估软件(GE Healthcare Bio-Sciences公司制)分析，算出各抗体的动力学常数。

MAB2926的结合活性如下测定。使用小鼠抗体捕获试剂盒(Mouse AntibodyCapture Kit)(GE Healthcare Bio-Sciences公司制、Cat#BR-1008-38)，按照所附的说明书，将抗小鼠IgG抗体固定化于CM5传感器芯片(GE Healthcare Bio-Sciences公司制、BR100530)。在固定化有抗小鼠IgG抗体的流动池中，以10μL/分钟的流速添加10秒钟制备为5μg/mL的MAB2926。

另外，接着，将由300ng/mL以3倍稀释阶段性地调制成5个浓度的人成熟BMP10蛋白质以30μL/分钟的流速，监测结合反应1分钟，监测解离反应30分钟。取得的传感图使用Bia评估软件(GE Healthcare Bio-Sciences公司制)分析，算出MAB2926的动力学常数。所算出的各抗体的结合速度常数(ka)、解离速度常数(kd)和解离常数[kd/ka＝K_D]表示于表1。

表1

*由于ka超出了仪器的检测极限，所以作为参考值。

如表1所示可知，取得的ch18C1抗体、ch12H3抗体、ch11H10抗体比已知抗体MAB2926的结合强。

[实施例6]

取得的抗体竞争的受体的分析

6-1)ALK1-Fc的制备

ALK1-Fc按照国际公开第2010/126169号的实施例1中记载的方法制备。

6-2)通过Biacore的对竞争受体的分析

BMP10通过与I型和II型的2种受体结合而传递信号。为了分析取得的抗BMP10抗体与何种受体竞争，使用利用表面等离子体共振法(SPR法)的BiacoreT100(GE HealthcareBio-Sciences公司制)进行测定。

使用人类抗体捕获试剂盒(GE Healthcare Bio-Sciences公司制、Cat#BR-1008-39)，按照所附的说明书，将抗人IgG抗体固定化于CM5传感器芯片(GE Healthcare Bio-Sciences公司制、BR100530)。

在固定化有抗人IgG抗体的流动池中，以10μL/分钟的流速添加10秒钟制备为10μg/mL的ALK1-Fc、BMPR2-Fc(R&D systems公司制、Cat#811-BR-100)、内皮因子-Fc(R&Dsystems公司制、Cat#6578-EN-025)的任意一种。

另外，接着，以10μL/分钟的流速添加30秒钟制备为100ng/ml的人成熟BMP10(R&Dsystems公司制、Cat#2926-BP)和抗BMP10抗体1μg/ml的混合物。

将结果表示于表2。在表2中，将在抗体和成熟BMP10的混合物与捕获的ALK1-Fc、BMPR2-Fc、内皮因子-Fc结合的情况记作+，将不结合的情况记作-。

表2

抗体名称	ALK1-Fc	BMPR2-Fc	Endoglin-Fc
				MAB2926	-	+	+
11H10抗体	+	-	-
				12H3抗体	+	-	-
18C1抗体	+	-	-

如表2所示，成熟BMP10和抗体的混合物不与所捕获了的受体结合的情况，可以说抗体与受体发生竞争。结果可知，MAB2926抑制BMP10与ALK1-Fc的结合。

另一方面，MAB2926不抑制BMP10与BMPR2-Fc和内皮因子-Fc的结合抑制。18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体都不抑制BMP10与ALK1-Fc的结合。另一方面，18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体都抑制BMP10与BMPR2-Fc和内皮因子-Fc的结合。

由以上的结果可知，18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体为与已知抗体抑制的受体不同的新型抑制方式的抗体。

[实施例7]

取得抗体对正常动物的血压的作用的评价

使用SD大鼠，评价18C1抗体对血压的作用。购入6周龄的雄性SD大鼠(CharlesRiver Laboratories Japan,Inc.制)，供于实验。饮水以自由摄取的方式提供灭菌自来水，食饵以自由摄取的方式提供固体饲料FR-2(Funabashi Farm Co.,Ltd.制)。驯化饲养后，在7周龄实施遥测发射器植入手术。

具体而言，将戊巴比妥钠(东京化成工业株式会公司制)50mg/kg投予到大鼠的腹腔内，实施麻醉。将遥测发射器(TA11PA-C40、Data Sciences International)的血压感应器插入腹部主动脉内，将主体植入腹腔内。通过一般状态观察和血流动力学监测，确认了顺利从手术的影响中回复。将植入了遥测发射器的动物以收缩期血压的平均值为指标进行分组。12周龄时进行抗体的投予。

具体而言，将18C1抗体以PBS调制成1mg/mL的抗体以1mL/kg的用量投予。将12H3抗体或11H10抗体以PBS调制成5mg/ml的抗体以1mL/kg的用量投予。投予以皮下途径进行。将由发射器发送的血压波形的信号由设置在笼子下的接受板(RPC-1，Data SciencesInternational)接受。信号经由数据交换矩阵(Data Exchange Matrix)(Data SciencesInternational)，读取到数据取得/分析系统(DATAQUEST ART Gold ver2.30，DataSciences International)，每5分钟获取10秒钟的收缩期血压的测定数据。将结果表示于图4A～图4C。

如图4A和图4B所示，通过18C1抗体、12H3抗体的投予，确认到收缩期血压的下降。另外，18C1抗体比12H3抗体的降压作用强。另一方面，如图4C所示，在11H10抗体的投予中，没有确认到对收缩期血压的影响。以上可知新发现了抗BMP10抗体具有降压作用。

此外得知，降压作用与抗体的体外(in vitro)的BMP10中和活性相关，在具有相对较弱的中和活性的11H10抗体时，没有确认到降压作用。由此可知，新发现了仅具有强的BMP10中和活性的抗体具有降压作用。

[实施例8]

18C1抗体对自然发病高血压大鼠的血压的作用的评价

为了调查取得抗体对高血压动物的降压作用，使用雄性自然发病高血压大鼠(SHR/Izm、日本SLC公司)评价18C1抗体对血压的作用。

购入14周龄的雄性SHR/Izm大鼠(日本SLC)，供于实验。饮水以自由摄取的方式提供灭菌自来水，食饵以自由摄取的方式提供固形饲料FR-2(Funabashi Farm Co.,Ltd.制)。驯化饲养之后，在16周龄实施遥测发射器植入手术。遥测发射器植入手术方法和血压波型的取得按照实施例7进行。在21周龄，将18C1抗体以PBS调制成5mg/ml的抗体以1mL/kg的用量投予。投予以皮下途径进行。将结果表示于图5。

如图5所示，通过18C1抗体5mg/kg的投予，在约1个月期间，观察到了收缩期血压持续性地下降。由以上表明BMP10的中和对高血压病情具有治疗效果。

[实施例9]

18C1抗体对Dahl食盐感受性大鼠的作用的评价

评价BMP10抗体对Dahl食盐感受性大鼠(以下Dahl-S大鼠)给予高盐所诱发的高血压和心脏或肾脏的障碍的作用。购入5周龄的雄性Dahl食盐感受性大鼠(DIS/Eis：Slc)(日本SLC公司制)，供于实验。

投喂FR-2饲料(Funabashi Farm Co.,Ltd.制)直到6周龄，之后投喂高盐饲料(含8％NaCl的FR-2饲料、Oriental Yeast公司制)。作为正常对照组，使用在6周龄以后也投喂正常食(FR-2饲料)的Dahl―S大鼠。饮水使其自由摄取动物用饮水。

8周龄时刻进行血压和心率的测定。血压和心率的测定使用小鼠·大鼠非观血式血压计(BP-98E、Softron公司制)，在2次测定驯化后实施。8周龄时刻以体重、血压和心率为指标，将高盐饲料组以各组12只分成2组，将介质(PBS 1mL/kg)或18C1抗体以成为5mg/kg的用量的方式以每周1次的频度进行皮下投予。

在16周龄时刻实施血压测定、超声心动图检查、尿参数测定。进而在异氟烷吸入麻醉下从腹部主动脉采血，放血致死后进行剖检。摘取心脏、肺和两侧肾脏，测量组织重量。

超声心动图检查如下进行：在异氟烷吸入麻醉下将大鼠的前胸部剃毛，使用小动物用高分辨率超声成像系统(Vevo2100、Visual Sonic公司制)和高频/高帧频探头(MS-200、VisualSonic公司制)，以中心频率15.0MHz的超声波进行。通过M模式法，在乳头肌水平测量左心室后壁厚度(LVPW；s、LVPW；d)。通过在二尖瓣环上放置样品量的组织多普勒法，测定二尖瓣环速度(e’)。

采尿在自由摄取饲料和自由饮水下，在代谢笼(T-480、Tokiwa Kagaku KikaiCo.,Ltd.制)中进行24小时。尿样品在尿量测定后以1870×g离心分离4℃、15分钟，将其上清用于测定。尿中参数使用自动分析装置日立7170S(日立制作所公司制)或或全自动电解质分析装置[PVA-EXII、A&T公司制]测定。

采取的心脏、主动脉和肾脏供于病理组织学分析。具体而言，将采取的心脏、主动脉和肾脏用10vol％中性缓冲福尔马林溶液固定。按照常规方法由石蜡包埋块制作切片，实施Masson trichrome(MT)染色或Hematoxylin-Eosin(HE)染色。

肾脏肾小球障碍病理评分如下进行：在光学显微镜下观察HE染色标本，每个个体以100个以上肾小球为对象，将每个肾小球的病变(系膜扩张(mesangial expansion)、肾小球硬化(glomerular sclerosis)、和/或肾小球毛细血管塌陷(glomerular capillarycollapse))区域比例分级为下述5个阶段(0：正常(normal)、1：1-25％、2：26-50％、3：51-75％、4：76-100％)。然后，算出每个个体的肾小球病变评分(“各级的分数”ד每个级别的肾小球的比例”的总和)。统计解析以评分为1以上的肾小球数进行比较。

肾脏肾小管间质障碍病理评分如下进行：在光学显微镜下观察HE染色标本，对每个个体，将各切片的肾小管和间质病变(嗜碱性肾小管(basophilic tubule)，透明管型(hyaline cast)，间质性炎症(interstitial inflammation)和/或肾小管扩张(tubulardilatation))占各切片面积的比例分级成5个阶段(0：正常、1：1-25％、2：26-50％、3：51-75％、4：76-100％)。

将结果表示于图6～13。

如图6所示，通过高盐饮食，Dahl-S大鼠的血压明显上升。通过18C1抗体的投予，由高盐饮食诱发的Dahl-S大鼠的高血压被抑制到与正常饮食组相同程度。

另外，如图7A、图7B所示，通过高盐饮食，Dahl-S大鼠的血中钠量、尿钠排泄量均增加。通过18C1抗体的投予，尿钠排泄量进一步增加。进而通过18C1抗体的投予，血中钠量被正常化到与正常饮食组相同程度。由以上的结果可知，抗BMP10抗体对Dahl―S大鼠的因高盐饮食造成的钠潴留和高血压效果显著。

另一方面，如图8所示，通过高盐饮食，Dahl-S大鼠的尿量增加，通过抗BMP10抗体，尿量降低。即表明抗BMP10抗体具有使食盐感受性病情的肾脏钠排泄障碍正常化的作用，并且表示其具有与使尿量增加的利尿药不同的作用机理。

如图9所示，高盐饮食组中确认到了比正常饮食组的尿蛋白排泄量的增加。另外，如图10A、图10B和图11B所示，在高盐饮食组中，肾脏中确认到了透明管型、嗜碱性肾小管、肾小管扩张，确认到了肾脏肾小管间质明显受损。此外，如图10D、图10E和图11A所示，在高盐饮食组中确认到肾小球透明样物质沉淀，确认到肾脏肾小球明显受损。另一方面，如图9、图10C和图10F所示，在高盐饮食+18C1抗体投予组中，尿蛋白质排泄量的增加、肾脏肾小球障碍和肾脏肾小管间质障碍都明显得到抑制。

由以上的结果表明抗BMP10抗体对高血压引起的肾小球障碍、肾小管间质障碍具有治疗效果。

如图12A所示，确认到高盐饮食组比正常饮食组的左心室后壁厚度的肥厚。此外，如图12B所示，确认到高盐饮食组比正常饮食组的左室扩张功能的指标e’的减少，表明发生了心脏舒张功能障碍。

如图13所示，高盐饮食组中确认到肺重量的增加，表明发生了由左室扩张功能障碍引起的肺充血。另一方面，如图12A、图12B和图13所示，在高盐饮食+18C1抗体投予组中，左心室后壁厚度、e’和肺重量被维持为与正常饮食组相同程度。

由以上的结果表明抗BMP10抗体对由高血压引起的舒张性心力衰竭具有治疗效果。

[实施例10]

抗BMP10抗体对人血清的中和活性的评价

作为ALK1的配体，除了BMP10以外，还已知BMP9。为了评价对血中的BMP9、BMP10的中和活性，比较由人血清刺激人ALK1表达报告细胞时的中和活性。

10-1)作为抗BMP9抗体的10D5抗体的取得

抗BMP9抗体10D5按照国际公开第2014/007198号的实施例7中记载的方法制备。

10-2)取得抗体与已知抗体的BMP10中和活性比较

在96孔荧光·发光用板(Corning公司制、Cat#3916)添加人血清(Human True Aserum，pool of donars、Biopredic international公司制、Cat#SER019)使其终浓度达到5％。

然后，添加作为抗BMP10抗体的18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体、作为抗BMP9抗体的10D5抗体、或对照抗体(Purified Rat IgG1λIsotype control、BD公司制、Cat#553993)、或抗BMP9抗体与抗BMP10抗体的混合物。作为抗BMP9抗体与抗BMP10抗体的混合物，使用12H3抗体与10D5抗体、或者11H10抗体与10D5抗体的混合物。

就抗体而言，不论是否混合，各抗体都以终浓度从10000ng/mL起以3倍稀释成为5个阶段的浓度的方式制备、添加。然后，添加ALK1/Id1-Luc/CHO细胞悬浊液使其成为5×10⁴个/孔。所有的样品都以Excell 325培养基稀释，使人血清、抗体稀释液、细胞悬浊液合起来，最终成为100μL/孔。将孔内的液体用板混合器混均后，在37℃培养20小时。

20小时后，加入按照所附说明书制备的Nano-Glo荧光素酶Assay测定液40μL/孔。搅拌后，使用Glomax(Promega公司制)测定荧光素酶活性。作为抗体的中和活性(％)，将不添加抗体而仅添加了血清的孔的值作为0％，将不添加抗体而仅添加了Excell 325培养基的孔的值作为100％来计算抗体的中和活性。

结果，如图14所示，对照抗体、作为抗BMP10抗体的12H3抗体、11H10抗体、作为抗BMP9抗体的10D5抗体对于人血清都不显示中和活性。另一方面，12H3抗体与10D5抗体的混合物、以及11H10抗体与10D5抗体的混合物对人血清显示明显的中和活性。

由以上的结果表示在人血清中存在人BMP9/BMP10异源二聚体。另外，作为抗BMP10抗体的18C1抗体单独就对人血清显示中和活性。由此表明18C1抗体是对存在于人血清中的人BMP9/BMP10异源二聚体具有强力的中和活性的新型抗体。

[实施例11]

人血中的BMP9/BMP10异源二聚体的检测

为了检测实施例10中表明的BMP9/BMP10异源二聚体，用抗BMP9抗体和抗BMP10抗体进行夹心ELISA。

11-1)12H3抗体的生物素化

为了作为夹心ELISA的检测抗体使用，进行作为抗BMP10抗体的12H3抗体的生物素化。生物素化使用同仁化学研究所公司制的生物素标记试剂盒(Biotin Labeling Kit)-NH2试剂盒(Cat#LK03)进行。方法按照制品记载的所附文件进行。

11-2)使用抗BMP9抗体、抗BMP10抗体的夹心ELISA

将作为抗BMP9抗体的10D5抗体、作为抗BMP10抗体的11H10抗体、或对照抗体(纯化的小鼠IgG1κ同型对照(Purified Mouse IgG1κIsotype control)、BD公司制、Cat#554121)以碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(50mM NaHCO₃ pH9.6、Sigma-Aldrich公司Cat#C3041)稀释成3μg/ml的稀释液作为固相化液，以100μL/孔加入到96孔的ELISA用板(F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE、Thermo Fisher ScientifiC公司制、Cat#442404)，在4℃静置过夜，使其吸附。

去除抗体液后，加入1％BSA-PBS 300μL/孔，在室温静置1小时进行封闭，用PBST清洗5次。然后，以100μL/孔添加将人血清(Human True A serum，pool of donars、Biopredicinternational公司制、Cat#SER019)由0.1％BSA-PBST稀释成终浓度为1％、2％、4％、8％、16％的溶液，在室温静置1小时使其反应后，用PBST清洗5次。

然后，以100μL/孔分注将实施例11的11-1)中制作的生物素化12H3抗体由0.1％BSA-PBST制备成50ng/mL的溶液，在室温静置1小时。将该板以PBST清洗5次后，100μL/孔加入由0.1％BSA-PBST稀释500倍的链霉亲和素(Streptavidin)-PolyHRP80，Pre-diluted inStabilizer(1/20)(Stereospecific Detection Technologies公司制、Cat#SP80D50)，在室温静置1小时。

将板用PBST清洗5次，添加TMB底物液(TMB+Substrate-Chromogen、Dako公司制、Cat#S1599)50μL/孔使其显色，在得到了适当的显色时，添加1N硫酸溶液(Wako公司制、Cat#192-04755)50μL/孔，使用Multiskan Spectrum(Thermo Labsystems公司制)测定450、570nm的吸光度。将结果表示于图15。

如图15所示，将对照抗体和作为抗BMP10抗体的11H10抗体固相化时，没有确认到对血清的反应。另一方面，将作为抗BMP9抗体的10D5抗体固相化的情况下，确认到了血清浓度依赖性的明确的反应。由以上的结果表明，在人血清中存在由抗BMP9抗体、抗BMP10抗体同时识别的BMP9/BMP10异源二聚体。

[实施例12]

18C1抗体的人源化抗体的制作

(1)18C1人源化抗体的VH和VL的氨基酸序列的设计

由以下记载的方法设计18C1人源化抗体的各种VH和VL的氨基酸序列。以后的记述中作为具有各个VH和VL的氨基酸序列的18C1人源化抗体的总称，记作hz18C1抗体。作为适于18C1抗体的CDR的氨基酸序列的移植的已知的人抗体的骨架区(以下记作FR)的氨基酸序列，从Kabat等人[Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept.Healthand Human Services(1991)]所报告的人FR共有序列和人抗体种系(germline)序列中选择hSGHII和V1-22，在这些的FR上移植CDR。

在SGHII的FR的氨基酸序列的适当的位置分别移植序列编号29、30、31所示的18C1VH的CDR1～3的氨基酸序列，设计hz18C1 HV0(序列编号70)。另外，在V1-22的FR(作为FR4直接使用18C1嵌合抗体的FR)的氨基酸序列的适当的位置分别移植序列编号32、33、34所示的18C1 VL的CDR1～3的氨基酸序列，设计hz18C1 LV0(序列编号71)。

利用如上所述设计的hz18C1 HV0和hz18C1 LV0的电脑建模，鉴定被认为对抗体的结合活性有影响的FR的氨基酸残基。其结果，在hz18C1 LV0HV0抗体的可变区的FR的氨基酸残基中，作为使抗原结合部位的三维结构变化，被认为对抗体的结合活性有影响的氨基酸残基，在VH时，选择序列编号70所示的氨基酸序列的第14位的Pro、第20位的Leu、第27位的Gly、第29位的Val、第30位的Ser、第37位的Ile、第48位的Ile、第67位的Val、第71位的Val、第76位的Asn、第78位的Phe、第82位的Leu、第85位的Val、第92位的Val、第94位的Tyr和第109位的Thr，在VL时，选择序列编号71所示的氨基酸序列的第7位的Pro、第10位的Val、第12位的Glu、第14位的Pro、第16位的Lys、第19位的Thr、第20位的Ile、第41位的Pro、第48位的Val、第75位的Ser、第81位的Leu、第82位的Lys、第88位的Asp和第90位的Tyr。在这些选择的氨基酸残基中，将至少1个以上的氨基酸残基取代为存在于18C1抗体的相同部位的氨基酸残基，设计具有各种改变的人源化抗体的VH和VL。

除了如上所述的标准的CDR移植的设计以外，对一部分VH或VL还同时进行VH CDR的改变。在进行了该VH CDR的改变的hz18C1抗体的VH中，导入了序列编号29所示的VH的CDR1的氨基酸序列中的第4位的Val取代为Ala的改变、序列编号30所示的VH的CDR2中的第16位的Ser取代为Asp的改变中的至少1种改变。

作为由以上的过程设计的氨基酸序列具体的例子，VH表示在图16中，VL表示在图18A中。

另外，除了上述CDR移植方法以外，通过表面重塑方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA1994，91(3)：969-73和Protein Enginerring 1996,10,895-90)，由上述构建的18C1抗体的可变区的模型结构，将被认为对抗体的结合活性没有影响的FR内的氨基酸残基取代为被认为使抗原性降低的氨基酸残基，设计了具有各种改变的人源化抗体的VL和VH。对一部分VL或VH还同时进行了CDR移植法时所提到的VH CDR的改变。

具体而言，导入了序列编号26所示的氨基酸序列中的第3位的Val取代为Ala、第8位的Asn取代为Asp、第14位的Leu取代为Ala、第19位的Lys取代为Thr、第75位的Phe取代为Ser、第80位的Asn取代为Asp、第83位的Ile取代为Val或第88位的Ile取代为Val的氨基酸改变中的至少1种改变。由此，作为hz18C1抗体的VL，分别设计由序列编号72～87所示的氨基酸序列构成的hz18C1 VLres01～16，表示于图18B。

另外，关于VH，导入了序列编号23所示的氨基酸序列中的第11位的Leu取代为Ala、第14位的Leu取代为Pro、第19位的Ser取代为Asp、第27位的Phe取代为Ala、第34位的Val取代为Ala、第65位的Ser取代为Asp、第68位的Ser取代为Ala、第71位的Arg取代为Lys、第77位的Gln取代为Glu、第79位的Phe取代为Ala、第83位的Asn取代为Asp、第85位的Leu取代为Asp或者第107位的His取代为Gln的氨基酸改变中的至少1种改变。作为这样设计的hz18C1抗体的VH，将hz18C1 VHres01～32表示于图17。关于hz18C1 VHres16，将其氨基酸序列表示于序列编号98。

此外，作为人源化抗体的VH氨基酸序列，组合CDR移植方法和表面重塑方法，设计VH氨基酸序列。具体而言，导入了序列编号70所示的氨基酸序列的第10位的Gly取代为Asp、第13位的Lys取代为Gln、第19位的Ser取代为Asp、第20位的Leu取代为Ile、第27位的Gly取代为Phe、第29位的Val取代为Leu、第30位的Ser取代为Thr、第37位的Ile取代为Val、第48位的Ile取代为Met、第65位的Ser取代为Asp、第67位的Val取代为Leu、第68位的Thr取代为Ala、第71位的Val取代为Arg、第76位的Asn取代为Ser、第77位的Gln取代为Glu、第78位的Phe取代为Val、第79位的Ser取代为Phe、第82位的Leu取代为Met、第83位的Ser取代为Asp、第85位的Val取代为Leu、第86位的Thr取代为Gln、第87位的Ala取代为Thr、第88位的Ala取代为Asp、第92位的Val取代为Lys、第94位的Tyr取代为Phe、第109位的Thr取代为Ile和第110位的Leu取代为Met的氨基酸改变中的至少1种改变。由此，作为hz18C1抗体的VH，设计hz18C1 HVmut01～10(序列编号88～97)，各自的氨基酸序列表示于图19。其中，hz18C1HVmut01～04的CDR1～3均包含与18C1抗体相同的氨基酸序列(分别为序列编号29～31所示的氨基酸序列)。另一方面，hz18C1 HVmut05～10在CDR2中包含变异。即，hz18C1 HVmut05～10的CDR1和3分别包含序列编号29和31所示的氨基酸序列，CDR2包含序列编号30所示的氨基酸序列的第16位的Ser被取代成Asp的氨基酸序列(序列编号99)。

(2)人源化抗体的可变区基因的设计

使用动物细胞中高频度使用的密码子设计编码表3所示的人源化抗体的可变区的氨基酸序列的碱基序列。

表3

(3)人源化抗体的制作

将与(2)中设计的碱基序列对应的基因片段利用无缝克隆法导入表达载体，制作所需的质粒。其中，作为VL表达载体，使用具有信号序列和人λ链恒定区序列的pCI-OtCMV＿hL载体，作为VH表达载体，使用具有信号序列和人γ链恒定区序列的pCI-OtCAG＿hG4PE(R409K)载体。pCI-OtCAG＿hG4PE(R409K)载体所具有的恒定区序列是将人IgG4的重链恒定区的EU-index中的第228位的Ser残基取代为Pro、第235位的Leu残基取代为Glu和第409位的Arg残基取代为Lys的IgG4变异体(以下，记作IgG4PE R409K(WO2006/033386))的重链恒定区。此外，这些载体是以Promega公司pCI载体为共通主骨架并导入为了表达人抗体基因所需要的内切酶位点，由全合成所制作的载体。完成的质粒使用NucleoBond Xtra Midi EF试剂盒(Takara Bio公司)大量制备。然后，使用Expi293表达系统试剂盒(ExpressionSystem Kit)(Life Technologies公司)使目标人源化抗体瞬时表达。质粒的导入的方法根据所附说明书。

轻链的表达载体与重链的表达载体以1:2的比率混合并导入。将导入质粒后的细胞在37℃、5％CO₂、125rpm的条件下培养3天。然后，进行细胞培养悬浊液的离心分离，通过0.2μm过滤器(Thermo Scientific公司)回收培养上清。由培养上清，通过使用MabSelectSuRe(GE Healthcare公司)的亲和纯化，取得纯化抗体。

具体而言，将填充到柱中的树脂用PBS平衡化后，在该柱中添加培养上清，用PBS清洗2次，用Wash缓冲液1(PBS with 1M NaCl)、Wash缓冲液2(20mM柠檬酸、50mM NaCl，pH5.0)各清洗1次后，使用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸、50mM NaCl，pH 3.4)将抗体洗脱。在所得到的抗体溶液中以1/10量加入中和缓冲液(1M磷酸-NaOH，pH 7.0)进行中和，使用NAP25(GEHealthcare公司)将抗体溶液的溶剂置换成PBS。关于置换缓冲液后的抗体溶液，使用Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units(Millipore公司)进行通过超滤的浓缩，使用Nanodrop(Thermo Scientific公司)测定吸光度A₂₈₀，进行抗体溶液的浓度的测定和调整。吸光系数按照C.N.Pace等人的方法(1995，Prot.Sci.4：2411-2423)由各自的人源化抗体的氨基酸序列算出。纯化后的抗体利用分析用凝胶过滤色谱(使用岛津制作所公司制的装置、东曹公司制柱TSKgel SuperSW3000)和SDS-PAGE进行品质确认。

[实施例13]

抗BMP10人源化抗体的结合活性评价

为了比较实施例5-3中得到的ch18C1抗体和实施例12中得到的抗BMP10人源化抗体对人BMP10的结合活性，使用BiacoreT100(GE Healthcare Bio-Sciences公司制)利用表面等离子体共振法(SPR法)测定对人BMP10成熟二聚体(R&D systems公司制、Cat#2926-BP)的结合活性。

抗BMP10抗体的结合活性如下测定。使用人类抗体捕获试剂盒(GE HealthcareBio-Sciences公司制、Cat#BR-1008-39)按照所附的说明书，将抗人IgG抗体固定化于CM5传感器芯片(GE Healthcare Bio-Sciences公司制、BR100530)。在固定化了抗人IgG抗体的流动池中，以10μL/分钟的流速添加10秒钟制备为5μg/mL的抗体。

然后，将由100ng/mL以3倍稀释阶段性地调制成5个浓度的人成熟BMP10以30μL/分钟的流速，监测结合反应1分钟，监测解离反应10分钟。取得的传感图使用Bia EvaluationSoftware(GE Healthcare Bio-Sciences公司制)分析，算出各抗体的动力学常数。所算出的各抗体的结合速度常数(ka)、解离速度常数(kd)和解离常数[kd/ka＝K_D]表示于表4。

表4

由以上的结果可知所制作的抗BMP10人源化抗体具有与ch18C1抗体同等的结合活性。

[实施例14]

抗BMP10人源化抗体与ch18C1抗体的中和活性比较

14-1)抗BMP10人源化抗体对BMP10同源二聚体的中和活性评价

关于所取得的抗BMP10人源化抗体和ch18C1抗体，使用实施例3的3-1)中制作的人ALK1表达报告细胞比较对BMP10的中和活性。

在96孔荧光·发光用板(Corning公司制、Cat#3916)添加人BMP10成熟二聚体(R&Dsystems公司制、Cat#2926-BP)使终浓度为0.3ng/mL，然后，将实施例12中取得的抗BMP10人源化抗体或ch18C1抗体从终浓度3000ng/mL起以3倍稀释阶段性地调制成7个浓度，来添加。

然后，添加以Excell 325培养基[Excell 325PF CHO(SAFC公司制、Cat#14340C-1000mL)、4mM L-谷氨酰胺、1×青霉素、1×链霉素(Nacalai公司制、Cat#09367-34)、0.5mg/mL潮霉素(hygromycin)]悬浊得到的ALK1/Id1-Luc/CHO细胞液使其成为5×10⁴个/孔。添加了所有的样品后，将孔内的液体用板混合器混匀，在37℃培养20小时。

20小时后，添加按照所附说明书制备的Nano-Glo荧光素酶Assay测定液(Promega公司制、Cat#N1120)40μL/孔并搅拌后，用Glomax(Promega公司制)测定荧光素酶活性。作为抗体的中和活性(％)，将不添加抗体而仅添加了BMP10成熟二聚体的孔的值作为0％，将不添加抗体而仅添加了Excell 325培养基的孔的值作为100％，算出抗体的中和活性。将结果表示于图20～25。

如图20～25所示，所制作的抗BMP10人源化抗体均显示与ch18C1抗体同等的中和活性。

14-2)抗BMP10人源化抗体对人血中BMP9/10异源二聚体的中和活性评价

关于所取得的抗BMP10人源化抗体和ch18C1抗体，使用人ALK1表达报告细胞比较对人血中BMP9/BMP10异源二聚体的中和活性。人ALK1表达报告细胞使用实施例3的3-1)中制作的细胞进行。

在96孔荧光·发光用板(Corning公司制、Cat#3916)添加人血清(Human True Aserum，pool of donars、Biopredic international公司制、Cat#SER019)使终浓度为10％。

然后，以1000ng/ml的终浓度添加抗BMP10人源化抗体或ch18C1抗体。然后，添加ALK1/Id1-Luc/CHO细胞悬浊液使其为5×10⁴个/孔。关于所有的孔，以液量为100μL/孔的方式添加Excell 325培养基。将孔内的液体用板混合器混均后，在37℃培养20小时。

20小时后，加入按照所附说明书制备的Nano-Glo荧光素酶Assay测定液40μL/孔，搅拌后，使用Glomax(Promega公司制)测定荧光素酶活性。

如图26所示，抗BMP10人源化抗体对人血中BMP9/BMP10异源二聚体均显示与ch18C1抗体同等的中和活性。

[实施例15]

对于正常动物的血压的BMP9/10异源二聚体中和作用的评价

使用SD大鼠，评价中和BMP9/10异源二聚体时对血压的作用。购入6周龄的雄性SD大鼠(Charles River Laboratories Japan,Inc.制)，供于实验。饮水以自由摄取方式投喂灭菌自来水，食饵以自由摄取方式投喂固体饲料FR-2(Funabashi Farm Co.,Ltd.制)。驯化饲养后，以7周龄实施遥测发射器植入手术。遥测发射器植入手术方法和血压波形的取得按照实施例7进行。

对BMP9抗体投予组，以1mL/kg的用量投予用PBS将BMP9抗体10D5调制为10mg/ml的抗体。对BMP9/BMP10异源二聚体中和组，以1mL/kg的用量投予用PBS将BMP9抗体10D5和BMP10抗体11H10混合制备成最终浓度分别成为10mg/ml、5mg/ml的抗体。投予以皮下途径进行。

如图27A所示，与介质投予时相比，通过10D5抗体的投予，没有确认到收缩期血压的变化。另一方面如图27B所示，与介质投予时相比，在混合投予10D5抗体和11H10抗体的BMP9/BMP10异源二聚体中和组中，确认到了收缩期血压的降低。

10D5抗体和11H10抗体均在单独使用时不引起收缩期血压的变化。但是新发现了如果同时使用10D5抗体和11H10抗体，则通过BMP9/BMP10异源二聚体的中和，而显示降压作用。

[实施例16]

人BMP10同源二聚体对正常动物的血压的作用的评价

16-1)人BMP10重组蛋白质的制备

为了评价人BMP10同源二聚体对血压的作用，制备了人BMP10重组蛋白质。人BMP10表达载体按照国际公开第2014/007198号的实施例20中记载的方法制备。另外，人弗林表达质粒通过使用In-Fusion HD Cloning Kit(Takara Bio公司制)将人弗林全长cDNA重组入pEAK8载体(Edge Biosystems公司)来制作。

使用EXPI 293Expression system(ThermoFisher Scientific公司制)，对人BMP10和人弗林进行瞬时表达，使人BMP10重组蛋白质表达。通过离心分离和利用0.22μm过滤器的过滤从培养液取得培养上清。

接着，使用Ni-NTA琼脂糖(Agarose)(QIAGEN公司制)，将各蛋白质纯化。作为结合缓冲液(Binding buffer)使用20mM HEPES-NaOH(pH 7.4)、500mM NaCl 40mM咪唑(Imidazole)，作为洗脱缓冲液(Elution buffer)使用20mM HEPES-NaOH(pH 7.4)、500mMNaCl 200mM咪唑。

使用NAP-25柱(GE Healthcare公司制、17-0852-02)，将缓冲液置换成PBS。测定280nm的吸光度，确定各蛋白质溶液的浓度。作为分子吸光系数，使用0.96mL/(mg·cm)。这样得到的BMP10重组蛋白质不含全长体，仅含有成熟体和N末前肽体，但是与实施例1-1的方法中制作的包含全长体的BMP10重组蛋白质同样地形成同源二聚体，具有作为BMP10的功能。

16-2)BMP10重组蛋白质对血压的作用的评价

使用SD大鼠评价投予人BMP10重组蛋白质时对血压的作用。购入6周龄的雄性SD大鼠(Charles River Laboratories Japan,Inc.制)，供于实验。饮水以自由摄取的方式投喂灭菌自来水，食饵以自由摄取的方式投喂固体饲料FR-2(Funabashi Farm Co.,Ltd.制)。驯化饲养后，在7周龄实施遥测发射器植入手术。

遥测发射器植入手术方法和血压波型的取得按照实施例7进行。以1mL/kg的用量投予用PBS将实施例16-1中得到的人BMP10重组蛋白质调制成0.5mg/ml的溶液。投予以静脉内途径进行。

如图28所示，与介质投予时比较，通过投予人BMP10重组蛋白质，确认到了收缩期血压的上升。

通过以上的结果新发现了人BMP10同源二聚体具有升压作用。

利用特定的方式详细说明了本发明，但本领域技术人员明白不脱离本发明的意图和范围能够进行各种变更和变形。此外，本申请基于2017年12月12日申请的日本专利申请(日本特愿2017-238106号)，将其整体通过引用援引于此。

序列表自由文本

序列编号1：大鼠IgG1特异性引物RV1的碱基序列

序列编号2：大鼠IgG2a特异性引物RV1的碱基序列

序列编号3：大鼠Ig(κ)特异性引物RV1的碱基序列

序列编号4：大鼠Ig(λ)特异性引物RV1的碱基序列

序列编号5：18C1抗体的VH全碱基序列

序列编号6：12H3抗体的VH全碱基序列

序列编号7：11H10抗体的VH全碱基序列

序列编号8：18C1抗体的VH全氨基酸序列(包含信号序列)

序列编号9：12H3抗体的VH全氨基酸序列(包含信号序列)

序列编号10：11H10抗体的VH全氨基酸序列(包含信号序列)

序列编号11：18C1抗体的VL全碱基序列

序列编号12：12H3抗体的VL全碱基序列

序列编号13：11H10抗体的VL全碱基序列

序列编号14：18C1抗体的VL全氨基酸序列(包含信号序列)

序列编号15：12H3抗体的VL全氨基酸序列(包含信号序列)

序列编号16：11H10抗体的VL全氨基酸序列(包含信号序列)

序列编号17：18C1抗体的VH碱基序列(不包含信号序列)

序列编号18：12H3抗体的VH碱基序列(不包含信号序列)

序列编号19：11H10抗体的VH碱基序列(不包含信号序列)

序列编号20：18C1抗体的VL碱基序列(不包含信号序列)

序列编号21：12H3抗体的VL碱基序列(不包含信号序列)

序列编号22：11H10抗体的VL碱基序列(不包含信号序列)

序列编号23：18C1抗体的VH氨基酸序列(不包含信号序列)

序列编号24：12H3抗体的VH氨基酸序列(不包含信号序列)

序列编号25：11H10抗体的VH氨基酸序列(不包含信号序列)

序列编号26：18C1抗体的VL氨基酸序列(不包含信号序列)

序列编号27：12H3抗体的VL氨基酸序列(不包含信号序列)

序列编号28：11H10抗体的VL氨基酸序列(不包含信号序列)

序列编号29：18C1抗体VH的CDR1氨基酸序列

序列编号30：18C1抗体VH的CDR2氨基酸序列

序列编号31：18C1抗体VH的CDR3氨基酸序列

序列编号32：18C1抗体VL的CDR1氨基酸序列

序列编号33：18C1抗体VL的CDR2氨基酸序列

序列编号34：18C1抗体VL的CDR3氨基酸序列

序列编号35：12H3抗体VH的CDR1氨基酸序列

序列编号36：12H3抗体VH的CDR2氨基酸序列

序列编号37：12H3抗体VH的CDR3氨基酸序列

序列编号38：12H3抗体VL的CDR1氨基酸序列

序列编号39：12H3抗体VL的CDR2氨基酸序列

序列编号40：12H3抗体VL的CDR3氨基酸序列

序列编号41：11H10抗体VH的CDR1氨基酸序列

序列编号42：11H10抗体VH的CDR2氨基酸序列

序列编号43：11H10抗体VH的CDR3氨基酸序列

序列编号44：11H10抗体VL的CDR1氨基酸序列

序列编号45：11H10抗体VL的CDR2氨基酸序列

序列编号46：11H10抗体VL的CDR3氨基酸序列)

序列编号47：人BMP10蛋白质的氨基酸序列(包含信号序列)

序列编号48：人BMP10成熟区域的氨基酸序列

序列编号49：编码人BMP10蛋白质的碱基序列(包含信号序列)

序列编号50：编码人BMP10成熟区域的碱基序列

序列编号51：人BMPRII的氨基酸序列

序列编号52：人ALK1的氨基酸序列

序列编号53：18C1抗体的轻链的扩增中使用的引物Fwd的碱基序列

序列编号54：18C1抗体的轻链的扩增中使用的引物Rv的碱基序列

序列编号55：18C1抗体的重链的扩增中使用的引物Fwd的碱基序列

序列编号56：18C1抗体的重链的扩增中使用的引物Rv的碱基序列

序列编号57：12H3抗体的轻链的扩增中使用的引物Fwd的碱基序列

序列编号58：12H3抗体的轻链的扩增中使用的引物Rv的碱基序列

序列编号59：12H3抗体的重链的扩增中使用的引物Fwd的碱基序列

序列编号60：12H3抗体的重链的扩增中使用的引物Rv的碱基序列

序列编号61：11H10抗体的轻链的扩增中使用的引物Fwd的碱基序列

序列编号62：11H10抗体的轻链的扩增中使用的引物Rv的碱基序列

序列编号63：11H10抗体的重链的扩增中使用的引物Fwd的碱基序列

序列编号64：11H10抗体的重链的扩增中使用的引物Rv的碱基序列

序列编号65：人BMP9成熟区域的氨基酸序列

序列编号66：人BMP9蛋白质的氨基酸序列(包含信号序列)

序列编号67：编码人BMP9蛋白质的碱基序列(包含信号序列)

序列编号68：编码人BMP9成熟区域的碱基序列

序列编号69：人内皮因子的氨基酸序列

序列编号70：人源化18C1抗体HV0的氨基酸序列

序列编号71：人源化18C1抗体LV0的氨基酸序列

序列编号72：人源化18C1抗体VLres01的氨基酸序列

序列编号73：人源化18C1抗体VLres02的氨基酸序列

序列编号74：人源化18C1抗体VLres03的氨基酸序列

序列编号75：人源化18C1抗体VLres04的氨基酸序列

序列编号76：人源化18C1抗体VLres05的氨基酸序列

序列编号77：人源化18C1抗体VLres06的氨基酸序列

序列编号78：人源化18C1抗体VLres07的氨基酸序列

序列编号79：人源化18C1抗体VLres08的氨基酸序列

序列编号80：人源化18C1抗体VLres09的氨基酸序列

序列编号81：人源化18C1抗体VLres10的氨基酸序列

序列编号82：人源化18C1抗体VLres11的氨基酸序列

序列编号83：人源化18C1抗体VLres12的氨基酸序列

序列编号84：人源化18C1抗体VLres13的氨基酸序列

序列编号85：人源化18C1抗体VLres14的氨基酸序列

序列编号86：人源化18C1抗体VLres15的氨基酸序列

序列编号87：人源化18C1抗体VLres16的氨基酸序列

序列编号88：人源化18C1抗体HVmut01的氨基酸序列

序列编号89：人源化18C1抗体HVmut02的氨基酸序列

序列编号90：人源化18C1抗体HVmut03的氨基酸序列

序列编号91：人源化18C1抗体HVmut04的氨基酸序列

序列编号92：人源化18C1抗体HVmut05的氨基酸序列

序列编号93：人源化18C1抗体HVmut06的氨基酸序列

序列编号94：人源化18C1抗体HVmut07的氨基酸序列

序列编号95：人源化18C1抗体HVmut08的氨基酸序列

序列编号96：人源化18C1抗体HVmut09的氨基酸序列

序列编号97：人源化18C1抗体HVmut10的氨基酸序列

序列编号98：人源化18C1抗体VHres16的氨基酸序列

序列编号99：人源化18C1抗体HVmut05～10的CDR2的氨基酸序列

序列表

<110> 协和麒麟株式会社

<120> 抗BMP10抗体和以该抗体为有效成分的对高血压和高血压性疾病的治疗剂

<130> PD01027A

<150> JP2017-238106

<151> 2017-12-12

<160> 99

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 大鼠IgG1的RV1引物

<400> 1

tagagyccag actgcaggac agctg 25

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述:大鼠IgG2a的RV1引物

<400> 2

ggatagacag akggggctg 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述:大鼠Ig kappa的RV1引物

<400> 3

cttggtcaac gagagggtgc tg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 大鼠Ig rambda的RV1引物

<400> 4

gagctcytca gwkgaaggtg 20

<210> 5

<211> 402

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 5

atggctgtgc tggtgctgct cctctgcctg gtgacatttc caaactctgt cttgacccag 60

gtacaactga aggagacagg acctgaccta gtgcaactga cacagaccct gtccatcaca 120

tgcactgtct ctgggttctc attaaccacc tataatgtgc actgggtccg tcagcctcca 180

ggaaaaggtc tggagtggat gggaacaatg tggaatggtg gaggcataga ttataattca 240

gcattcaaat cccgactgag tatcagcagg gacacctcca agagccaagt gttcttgaaa 300

atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc aagtacttct gtgccagact gggctactac 360

gttgattact ggggccacgg aatcatggtc acagtctcct ca 402

<210> 6

<211> 402

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 6

atggctgtgc ttgtgctgct cctctgcctg gtgacatttc caaactctgt cttgacccag 60

gtacaactga aggagacagg acctgaccta gtgcaactga cacagaccct gtccatcaca 120

tgcactgtct ctgggttctc attaagcacc tataatgttc attgggtccg tcagcctcca 180

ggaaagggtc tggagtggat gggagcaatg tggaatggtg gaggtataaa ttataattca 240

gcatttaaat cccgactgag tatcagtagg gacacctcca agagccaagt tttcttaaaa 300

atgaacagtt tgcaaactga tgacacagcc aagtacttct gtgccagatt cggctatggg 360

tttgattact ggggccaagg agtcatggtc acagtctcct ca 402

<210> 7

<211> 402

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 7

atggctgtgc tggtgctgct cctctgcctg gtgacatttc caaactctgt cttgacccag 60

gtacaactga aggagacagg acctgaccta gtgcaactga cacagaccct gtccatcaca 120

tgcactgtct ctgggttctc attaaccacc tataatgttc actgggtccg tcagcctcca 180

ggaaagggtc tggagtggat gggagcaatg tggaatggtg gaggcacaga ttataattca 240

gcatttaaat cccgactgag tatcagcagg gacacctcca agagccaagt tttcttaaaa 300

atgaacagtt tgcaaactga tgacacagcc aagtacttct gtgccaggct agctgaggga 360

tttgattact ggggccaagg agtcatggtc acagtctcct ca 402

<210> 8

<211> 134

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 8

Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Asn Ser

1 5 10 15

Val Leu Thr Gln Val Gln Leu Lys Glu Thr Gly Pro Asp Leu Val Gln

20 25 30

Leu Thr Gln Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Thr Thr Tyr Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Thr Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asp Tyr Asn Ser

65 70 75 80

Ala Phe Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln

85 90 95

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Lys Tyr

100 105 110

Phe Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly His Gly Ile

115 120 125

Met Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 9

<211> 134

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 9

Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Asn Ser

1 5 10 15

Val Leu Thr Gln Val Gln Leu Lys Glu Thr Gly Pro Asp Leu Val Gln

20 25 30

Leu Thr Gln Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Ser Thr Tyr Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Ala Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asn Tyr Asn Ser

65 70 75 80

Ala Phe Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln

85 90 95

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Lys Tyr

100 105 110

Phe Cys Ala Arg Phe Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val

115 120 125

Met Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 10

<211> 134

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 10

Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Asn Ser

1 5 10 15

Val Leu Thr Gln Val Gln Leu Lys Glu Thr Gly Pro Asp Leu Val Gln

20 25 30

Leu Thr Gln Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Ser Thr Tyr Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Ala Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asn Tyr Asn Ser

65 70 75 80

Ala Phe Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln

85 90 95

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Lys Tyr

100 105 110

Phe Cys Ala Arg Phe Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val

115 120 125

Met Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 11

<211> 390

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 11

atgacatgga ctctactatt ccttgctgtt cttcatcact taacagggtc atgtgcccag 60

tttgtgctta ttcagtcaaa ctctatgtct acgtctctag gaagcacagt caaactgtct 120

tgcaagcgca gcactggtaa cattggaagc agctatgtgt actggtacca gcagcatgag 180

ggaagatctc ccaccactat gatttatgat ggtgataaga gaccagatgg agttcctgat 240

aggttctctg gctccattga cagctcttcc aactcagcct tcctgacaat caataatgtg 300

cagattgaag atgaagctat ctacttctgt cagtctttca gtagtggtat taagtttatt 360

ttcggcggtg gaaccaagct cactgtccta 390

<210> 12

<211> 393

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 12

atgggcatca ggatggagtc acatactagg gtcttcatat tcctgctgct ctggttgtct 60

ggtggtgatg gggaaactgt gatgacccag tctcccacat ccatgtccac atcaatagga 120

gagagggtca ccctgaactg caaggccagt cagagtgtgg gcattaatgt agactggtac 180

caacggacac cagggcagtc tcctaaactg ctgatacatg gggcatccaa tcggcacact 240

ggggtccctg atcgcttcac aggcagtgga tttgggagag atttcactct caccatcagc 300

aacgtggagg ctgaagacct gactatttat tattgtctgc agtatggctc cattcctctc 360

acgtttggag ctgggaccaa gctggaactg ata 393

<210> 13

<211> 381

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 13

atggaatcac atactcaggt cttcatattc ctgctgctct ggttgtctgg tgcagatggg 60

gacactgtga tgacccagtc tcccgcatcc atgtccacgt cagtgggaga gagggtcacc 120

gtgaactgca aggccagtca gagtgtgggt actgttgttg cctggttcca acagaaacca 180

gggcagtctc ctaaacgact gatctacttg gcaaccaatc ggcacactgg ggtccctgat 240

cgcttcacag gcagtggatt tgggagagat ttcactctta ccatcagcaa tgtggaggct 300

gaagacctgg ctgtttatta ctgtctgcag tatggctcca ttccattcac gttcggctca 360

gggacgaagt tggaaataaa a 381

<210> 14

<211> 130

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 14

Met Thr Trp Thr Leu Leu Phe Leu Ala Val Leu His His Leu Thr Gly

1 5 10 15

Ser Cys Ala Gln Phe Val Leu Ile Gln Ser Asn Ser Met Ser Thr Ser

20 25 30

Leu Gly Ser Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile

35 40 45

Gly Ser Ser Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro

50 55 60

Thr Thr Met Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Phe Leu Thr

85 90 95

Ile Asn Asn Val Gln Ile Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Ser

100 105 110

Phe Ser Ser Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

115 120 125

Val Leu

130

<210> 15

<211> 131

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 15

Met Gly Ile Arg Met Glu Ser His Thr Arg Val Phe Ile Phe Leu Leu

1 5 10 15

Leu Trp Leu Ser Gly Gly Asp Gly Glu Thr Val Met Thr Gln Ser Pro

20 25 30

Thr Ser Met Ser Thr Ser Ile Gly Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys

35 40 45

Ala Ser Gln Ser Val Gly Ile Asn Val Asp Trp Tyr Gln Arg Thr Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile His Gly Ala Ser Asn Arg His Thr

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Phe Gly Arg Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Ala Glu Asp Leu Thr Ile Tyr Tyr Cys

100 105 110

Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Leu Ile

130

<210> 16

<211> 127

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 16

Met Glu Ser His Thr Gln Val Phe Ile Phe Leu Leu Leu Trp Leu Ser

1 5 10 15

Gly Ala Asp Gly Asp Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Met Ser

20 25 30

Thr Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Val Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Gly Thr Val Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Thr Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Phe Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Asn Val Glu Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly

100 105 110

Ser Ile Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 17

<211> 345

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 17

caggtacaac tgaaggagac aggacctgac ctagtgcaac tgacacagac cctgtccatc 60

acatgcactg tctctgggtt ctcattaacc acctataatg tgcactgggt ccgtcagcct 120

ccaggaaaag gtctggagtg gatgggaaca atgtggaatg gtggaggcat agattataat 180

tcagcattca aatcccgact gagtatcagc agggacacct ccaagagcca agtgttcttg 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccaagtact tctgtgccag actgggctac 300

tacgttgatt actggggcca cggaatcatg gtcacagtct cctca 345

<210> 18

<211> 345

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 18

caggtacaac tgaaggagac aggacctgac ctagtgcaac tgacacagac cctgtccatc 60

acatgcactg tctctgggtt ctcattaagc acctataatg ttcattgggt ccgtcagcct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gatgggagca atgtggaatg gtggaggtat aaattataat 180

tcagcattta aatcccgact gagtatcagt agggacacct ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtttgcaaac tgatgacaca gccaagtact tctgtgccag attcggctat 300

gggtttgatt actggggcca aggagtcatg gtcacagtct cctca 345

<210> 19

<211> 345

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 19

caggtacaac tgaaggagac aggacctgac ctagtgcaac tgacacagac cctgtccatc 60

acatgcactg tctctgggtt ctcattaacc acctataatg ttcactgggt ccgtcagcct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gatgggagca atgtggaatg gtggaggcac agattataat 180

tcagcattta aatcccgact gagtatcagc agggacacct ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtttgcaaac tgatgacaca gccaagtact tctgtgccag gctagctgag 300

ggatttgatt actggggcca aggagtcatg gtcacagtct cctca 345

<210> 20

<211> 333

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 20

cagtttgtgc ttattcagtc aaactctatg tctacgtctc taggaagcac agtcaaactg 60

tcttgcaagc gcagcactgg taacattgga agcagctatg tgtactggta ccagcagcat 120

gagggaagat ctcccaccac tatgatttat gatggtgata agagaccaga tggagttcct 180

gataggttct ctggctccat tgacagctct tccaactcag ccttcctgac aatcaataat 240

gtgcagattg aagatgaagc tatctacttc tgtcagtctt tcagtagtgg tattaagttt 300

attttcggcg gtggaaccaa gctcactgtc cta 333

<210> 21

<211> 321

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 21

gaaactgtga tgacccagtc tcccacatcc atgtccacat caataggaga gagggtcacc 60

ctgaactgca aggccagtca gagtgtgggc attaatgtag actggtacca acggacacca 120

gggcagtctc ctaaactgct gatacatggg gcatccaatc ggcacactgg ggtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatt tgggagagat ttcactctca ccatcagcaa cgtggaggct 240

gaagacctga ctatttatta ttgtctgcag tatggctcca ttcctctcac gtttggagct 300

gggaccaagc tggaactgat a 321

<210> 22

<211> 321

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 22

gacactgtga tgacccagtc tcccgcatcc atgtccacgt cagtgggaga gagggtcacc 60

gtgaactgca aggccagtca gagtgtgggt actgttgttg cctggttcca acagaaacca 120

gggcagtctc ctaaacgact gatctacttg gcaaccaatc ggcacactgg ggtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatt tgggagagat ttcactctta ccatcagcaa tgtggaggct 240

gaagacctgg ctgtttatta ctgtctgcag tatggctcca ttccattcac gttcggctca 300

gggacgaagt tggaaataaa a 321

<210> 23

<211> 115

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 23

Gln Val Gln Leu Lys Glu Thr Gly Pro Asp Leu Val Gln Leu Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Leu Gly Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly His Gly Ile Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 115

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 24

Gln Val Gln Leu Lys Glu Thr Gly Pro Asp Leu Val Gln Leu Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Phe Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 115

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 25

Gln Val Gln Leu Lys Glu Thr Gly Pro Asp Leu Val Gln Leu Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Met Trp Asn Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Leu Ala Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 111

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 26

Gln Phe Val Leu Ile Gln Ser Asn Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Phe Leu Thr Ile Asn Asn

65 70 75 80

Val Gln Ile Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 27

<211> 107

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 27

Glu Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Met Ser Thr Ser Ile Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Ile Asn

20 25 30

Val Asp Trp Tyr Gln Arg Thr Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Gly Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Phe Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Thr Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Ile

100 105

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 28

Asp Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Val Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Val

20 25 30

Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Leu Ala Thr Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Phe Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

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<211> 5

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 29

Thr Tyr Asn Val His

1 5

<210> 30

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<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 30

Thr Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Ser

1 5 10 15

<210> 31

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<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 31

Leu Gly Tyr Tyr Val Asp Tyr

1 5

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<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 32

Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser Tyr Val Tyr

1 5 10

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<211> 7

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 33

Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp

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<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 34

Gln Ser Phe Ser Ser Gly Ile Lys Phe Ile

1 5 10

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<211> 5

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 35

Thr Tyr Asn Val His

1 5

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<211> 16

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 36

Ala Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Ser

1 5 10 15

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<211> 7

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 37

Phe Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr

1 5

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<211> 11

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 38

Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Ile Asn Val Asp

1 5 10

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<211> 7

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 39

Gly Ala Ser Asn Arg His Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 40

Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Pro Leu Thr

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 41

Thr Tyr Asn Val His

1 5

<210> 42

<211> 16

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 42

Ala Met Trp Asn Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Ser

1 5 10 15

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 43

Leu Ala Glu Gly Phe Asp Tyr

1 5

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<211> 11

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 44

Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Val Val Ala

1 5 10

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<211> 7

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 45

Leu Ala Thr Asn Arg His Thr

1 5

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 46

Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Pro Phe Thr

1 5

<210> 47

<211> 424

<212> PRT

<213> 人

<400> 47

Met Gly Ser Leu Val Leu Thr Leu Cys Ala Leu Phe Cys Leu Ala Ala

1 5 10 15

Tyr Leu Val Ser Gly Ser Pro Ile Met Asn Leu Glu Gln Ser Pro Leu

20 25 30

Glu Glu Asp Met Ser Leu Phe Gly Asp Val Phe Ser Glu Gln Asp Gly

35 40 45

Val Asp Phe Asn Thr Leu Leu Gln Ser Met Lys Asp Glu Phe Leu Lys

50 55 60

Thr Leu Asn Leu Ser Asp Ile Pro Thr Gln Asp Ser Ala Lys Val Asp

65 70 75 80

Pro Pro Glu Tyr Met Leu Glu Leu Tyr Asn Lys Phe Ala Thr Asp Arg

85 90 95

Thr Ser Met Pro Ser Ala Asn Ile Ile Arg Ser Phe Lys Asn Glu Asp

100 105 110

Leu Phe Ser Gln Pro Val Ser Phe Asn Gly Leu Arg Lys Tyr Pro Leu

115 120 125

Leu Phe Asn Val Ser Ile Pro His His Glu Glu Val Ile Met Ala Glu

130 135 140

Leu Arg Leu Tyr Thr Leu Val Gln Arg Asp Arg Met Ile Tyr Asp Gly

145 150 155 160

Val Asp Arg Lys Ile Thr Ile Phe Glu Val Leu Glu Ser Lys Gly Asp

165 170 175

Asn Glu Gly Glu Arg Asn Met Leu Val Leu Val Ser Gly Glu Ile Tyr

180 185 190

Gly Thr Asn Ser Glu Trp Glu Thr Phe Asp Val Thr Asp Ala Ile Arg

195 200 205

Arg Trp Gln Lys Ser Gly Ser Ser Thr His Gln Leu Glu Val His Ile

210 215 220

Glu Ser Lys His Asp Glu Ala Glu Asp Ala Ser Ser Gly Arg Leu Glu

225 230 235 240

Ile Asp Thr Ser Ala Gln Asn Lys His Asn Pro Leu Leu Ile Val Phe

245 250 255

Ser Asp Asp Gln Ser Ser Asp Lys Glu Arg Lys Glu Glu Leu Asn Glu

260 265 270

Met Ile Ser His Glu Gln Leu Pro Glu Leu Asp Asn Leu Gly Leu Asp

275 280 285

Ser Phe Ser Ser Gly Pro Gly Glu Glu Ala Leu Leu Gln Met Arg Ser

290 295 300

Asn Ile Ile Tyr Asp Ser Thr Ala Arg Ile Arg Arg Asn Ala Lys Gly

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Asn Tyr Cys Lys Arg Thr Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Glu Ile Gly

325 330 335

Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Pro Gly Tyr Glu Ala Tyr Glu Cys

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Arg Gly Val Cys Asn Tyr Pro Leu Ala Glu His Leu Thr Pro Thr Lys

355 360 365

His Ala Ile Ile Gln Ala Leu Val His Leu Lys Asn Ser Gln Lys Ala

370 375 380

Ser Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Glu Pro Ile Ser Ile Leu

385 390 395 400

Tyr Leu Asp Lys Gly Val Val Thr Tyr Lys Phe Lys Tyr Glu Gly Met

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Ala Val Ser Glu Cys Gly Cys Arg

420

<210> 48

<211> 108

<212> PRT

<213> 人

<400> 48

Asn Ala Lys Gly Asn Tyr Cys Lys Arg Thr Pro Leu Tyr Ile Asp Phe

1 5 10 15

Lys Glu Ile Gly Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Pro Gly Tyr Glu

20 25 30

Ala Tyr Glu Cys Arg Gly Val Cys Asn Tyr Pro Leu Ala Glu His Leu

35 40 45

Thr Pro Thr Lys His Ala Ile Ile Gln Ala Leu Val His Leu Lys Asn

50 55 60

Ser Gln Lys Ala Ser Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Glu Pro

65 70 75 80

Ile Ser Ile Leu Tyr Leu Asp Lys Gly Val Val Thr Tyr Lys Phe Lys

85 90 95

Tyr Glu Gly Met Ala Val Ser Glu Cys Gly Cys Arg

100 105

<210> 49

<211> 1275

<212> DNA

<213> 人

<400> 49

atgggctctc tggtcctgac actgtgcgct cttttctgcc tggcagctta cttggtttct 60

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gagtttctta agacactaaa cctctctgac atccccacgc aggattcagc caaggtggac 240

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atcatggctg aacttaggct atacacactg gtgcaaaggg atcgtatgat atacgatgga 480

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<210> 50

<211> 327

<212> DNA

<213> 人

<400> 50

aacgccaaag gaaactactg taagaggacc ccgctctaca tcgacttcaa ggagattggg 60

tgggactcct ggatcatcgc tccgcctgga tacgaagcct atgaatgccg tggtgtttgt 120

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<210> 51

<211> 1038

<212> PRT

<213> 人

<400> 51

Met Thr Ser Ser Leu Gln Arg Pro Trp Arg Val Pro Trp Leu Pro Trp

1 5 10 15

Thr Ile Leu Leu Val Ser Thr Ala Ala Ala Ser Gln Asn Gln Glu Arg

20 25 30

Leu Cys Ala Phe Lys Asp Pro Tyr Gln Gln Asp Leu Gly Ile Gly Glu

35 40 45

Ser Arg Ile Ser His Glu Asn Gly Thr Ile Leu Cys Ser Lys Gly Ser

50 55 60

Thr Cys Tyr Gly Leu Trp Glu Lys Ser Lys Gly Asp Ile Asn Leu Val

65 70 75 80

Lys Gln Gly Cys Trp Ser His Ile Gly Asp Pro Gln Glu Cys His Tyr

85 90 95

Glu Glu Cys Val Val Thr Thr Thr Pro Pro Ser Ile Gln Asn Gly Thr

100 105 110

Tyr Arg Phe Cys Cys Cys Ser Thr Asp Leu Cys Asn Val Asn Phe Thr

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Glu Asn Phe Pro Pro Pro Asp Thr Thr Pro Leu Ser Pro Pro His Ser

130 135 140

Phe Asn Arg Asp Glu Thr Ile Ile Ile Ala Leu Ala Ser Val Ser Val

145 150 155 160

Leu Ala Val Leu Ile Val Ala Leu Cys Phe Gly Tyr Arg Met Leu Thr

165 170 175

Gly Asp Arg Lys Gln Gly Leu His Ser Met Asn Met Met Glu Ala Ala

180 185 190

Ala Ser Glu Pro Ser Leu Asp Leu Asp Asn Leu Lys Leu Leu Glu Leu

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Ile Gly Arg Gly Arg Tyr Gly Ala Val Tyr Lys Gly Ser Leu Asp Glu

210 215 220

Arg Pro Val Ala Val Lys Val Phe Ser Phe Ala Asn Arg Gln Asn Phe

225 230 235 240

Ile Asn Glu Lys Asn Ile Tyr Arg Val Pro Leu Met Glu His Asp Asn

245 250 255

Ile Ala Arg Phe Ile Val Gly Asp Glu Arg Val Thr Ala Asp Gly Arg

260 265 270

Met Glu Tyr Leu Leu Val Met Glu Tyr Tyr Pro Asn Gly Ser Leu Cys

275 280 285

Lys Tyr Leu Ser Leu His Thr Ser Asp Trp Val Ser Ser Cys Arg Leu

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Ala His Ser Val Thr Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His Thr Glu Leu Pro

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Arg Gly Asp His Tyr Lys Pro Ala Ile Ser His Arg Asp Leu Asn Ser

325 330 335

Arg Asn Val Leu Val Lys Asn Asp Gly Thr Cys Val Ile Ser Asp Phe

340 345 350

Gly Leu Ser Met Arg Leu Thr Gly Asn Arg Leu Val Arg Pro Gly Glu

355 360 365

Glu Asp Asn Ala Ala Ile Ser Glu Val Gly Thr Ile Arg Tyr Met Ala

370 375 380

Pro Glu Val Leu Glu Gly Ala Val Asn Leu Arg Asp Cys Glu Ser Ala

385 390 395 400

Leu Lys Gln Val Asp Met Tyr Ala Leu Gly Leu Ile Tyr Trp Glu Ile

405 410 415

Phe Met Arg Cys Thr Asp Leu Phe Pro Gly Glu Ser Val Pro Glu Tyr

420 425 430

Gln Met Ala Phe Gln Thr Glu Val Gly Asn His Pro Thr Phe Glu Asp

435 440 445

Met Gln Val Leu Val Ser Arg Glu Lys Gln Arg Pro Lys Phe Pro Glu

450 455 460

Ala Trp Lys Glu Asn Ser Leu Ala Val Arg Ser Leu Lys Glu Thr Ile

465 470 475 480

Glu Asp Cys Trp Asp Gln Asp Ala Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys

485 490 495

Ala Glu Glu Arg Met Ala Glu Leu Met Met Ile Trp Glu Arg Asn Lys

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Arg Asn Leu Ser His Asn Arg Arg Val Pro Lys Ile Gly Pro Tyr Pro

530 535 540

Asp Tyr Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Glu Asp Ser Ile His His Thr Asp

545 550 555 560

Ser Ile Val Lys Asn Ile Ser Ser Glu His Ser Met Ser Ser Thr Pro

565 570 575

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His Thr Thr Asn Val Ala Gln Ser Ile Gly Pro Thr Pro Val Cys Leu

645 650 655

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Val Asp Lys Asn Leu Lys Glu Ser Ser Asp Glu Asn Leu Met Glu His

675 680 685

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690 695 700

Ser Leu Leu Tyr Pro Leu Ile Lys Leu Ala Val Glu Ala Thr Gly Gln

705 710 715 720

Gln Asp Phe Thr Gln Thr Ala Asn Gly Gln Ala Cys Leu Ile Pro Asp

725 730 735

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740 745 750

Lys Arg Pro Thr Ser Leu Pro Leu Asn Thr Lys Asn Ser Thr Lys Glu

755 760 765

Pro Arg Leu Lys Phe Gly Ser Lys His Lys Ser Asn Leu Lys Gln Val

770 775 780

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785 790 795 800

Val Val Thr Val Thr Met Asn Gly Val Ala Gly Arg Asn His Ser Val

805 810 815

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820 825 830

Gly Gln Thr Thr Asn Ile Val Thr His Arg Ala Gln Glu Met Leu Gln

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865 870 875 880

Glu Gly Val Leu Asp Arg Leu Val Asp Arg Arg Glu Arg Pro Leu Glu

885 890 895

Gly Gly Arg Thr Asn Ser Asn Asn Asn Asn Ser Asn Pro Cys Ser Glu

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Gln Asp Val Leu Ala Gln Gly Val Pro Ser Thr Ala Ala Asp Pro Gly

915 920 925

Pro Ser Lys Pro Arg Arg Ala Gln Arg Pro Asn Ser Leu Asp Leu Ser

930 935 940

Ala Thr Asn Val Leu Asp Gly Ser Ser Ile Gln Ile Gly Glu Ser Thr

945 950 955 960

Gln Asp Gly Lys Ser Gly Ser Gly Glu Lys Ile Lys Lys Arg Val Lys

965 970 975

Thr Pro Tyr Ser Leu Lys Arg Trp Arg Pro Ser Thr Trp Val Ile Ser

980 985 990

Thr Glu Ser Leu Asp Cys Glu Val Asn Asn Asn Gly Ser Asn Arg Ala

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Val His Ser Lys Ser Ser Thr Ala Val Tyr Leu Ala Glu Gly Gly

1010 1015 1020

Thr Ala Thr Thr Met Val Ser Lys Asp Ile Gly Met Asn Cys Leu

1025 1030 1035

<210> 52

<211> 503

<212> PRT

<213> 人

<400> 52

Met Thr Leu Gly Ser Pro Arg Lys Gly Leu Leu Met Leu Leu Met Ala

1 5 10 15

Leu Val Thr Gln Gly Asp Pro Val Lys Pro Ser Arg Gly Pro Leu Val

20 25 30

Thr Cys Thr Cys Glu Ser Pro His Cys Lys Gly Pro Thr Cys Arg Gly

35 40 45

Ala Trp Cys Thr Val Val Leu Val Arg Glu Glu Gly Arg His Pro Gln

50 55 60

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65 70 75 80

Pro Thr Glu Phe Val Asn His Tyr Cys Cys Asp Ser His Leu Cys Asn

85 90 95

His Asn Val Ser Leu Val Leu Glu Ala Thr Gln Pro Pro Ser Glu Gln

100 105 110

Pro Gly Thr Asp Gly Gln Leu Ala Leu Ile Leu Gly Pro Val Leu Ala

115 120 125

Leu Leu Ala Leu Val Ala Leu Gly Val Leu Gly Leu Trp His Val Arg

130 135 140

Arg Arg Gln Glu Lys Gln Arg Gly Leu His Ser Glu Leu Gly Glu Ser

145 150 155 160

Ser Leu Ile Leu Lys Ala Ser Glu Gln Gly Asp Ser Met Leu Gly Asp

165 170 175

Leu Leu Asp Ser Asp Cys Thr Thr Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Phe

180 185 190

Leu Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Gln Val Ala Leu Val Glu Cys Val

195 200 205

Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Arg Gly Leu Trp His Gly Glu

210 215 220

Ser Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Asp Glu Gln Ser Trp Phe

225 230 235 240

Arg Glu Thr Glu Ile Tyr Asn Thr Val Leu Leu Arg His Asp Asn Ile

245 250 255

Leu Gly Phe Ile Ala Ser Asp Met Thr Ser Arg Asn Ser Ser Thr Gln

260 265 270

Leu Trp Leu Ile Thr His Tyr His Glu His Gly Ser Leu Tyr Asp Phe

275 280 285

Leu Gln Arg Gln Thr Leu Glu Pro His Leu Ala Leu Arg Leu Ala Val

290 295 300

Ser Ala Ala Cys Gly Leu Ala His Leu His Val Glu Ile Phe Gly Thr

305 310 315 320

Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Phe Lys Ser Arg Asn Val

325 330 335

Leu Val Lys Ser Asn Leu Gln Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala

340 345 350

Val Met His Ser Gln Gly Ser Asp Tyr Leu Asp Ile Gly Asn Asn Pro

355 360 365

Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp Glu Gln

370 375 380

Ile Arg Thr Asp Cys Phe Glu Ser Tyr Lys Trp Thr Asp Ile Trp Ala

385 390 395 400

Phe Gly Leu Val Leu Trp Glu Ile Ala Arg Arg Thr Ile Val Asn Gly

405 410 415

Ile Val Glu Asp Tyr Arg Pro Pro Phe Tyr Asp Val Val Pro Asn Asp

420 425 430

Pro Ser Phe Glu Asp Met Lys Lys Val Val Cys Val Asp Gln Gln Thr

435 440 445

Pro Thr Ile Pro Asn Arg Leu Ala Ala Asp Pro Val Leu Ser Gly Leu

450 455 460

Ala Gln Met Met Arg Glu Cys Trp Tyr Pro Asn Pro Ser Ala Arg Leu

465 470 475 480

Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Gln Lys Ile Ser Asn Ser Pro

485 490 495

Glu Lys Pro Lys Val Ile Gln

500

<210> 53

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列的描述: 18C1轻链的正向引物

<400> 53

attgtgccgg aagctgggct cagtttgtgc ttattcagtc aaac 44

<210> 54

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 18C1轻链的引物R

<400> 54

gcggccttgg gctgacctag gacagtgagc ttggttccac 40

<210> 55

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 18C1重链的引物F

<400> 55

aagggcgtgc agtgccaggt acaactgaag gagacaggac 40

<210> 56

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 18C1重链的引物R

<400> 56

gccccttggt gctagctgag gagactgtga ccatgattcc gtgg 44

<210> 57

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 12H3轻链的引物F

<400> 57

tcccgcgtcc tctagtgaaa ctgtgatgac ccagtctc 38

<210> 58

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 12H3轻链的引物R

<400> 58

gtgcagccac cgtacgtatc agttccagct tggtcccagc tc 42

<210> 59

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列的描述:12H3重链的引物F

<400> 59

aagggcgtgc agtgccaggt acaactgaag gagacaggac 40

<210> 60

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 12H3重链的引物R

<400> 60

gccccttggt gctagctgag gagactgtga ccatgactc 39

<210> 61

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 11H10轻链的引物F

<400> 61

cccgcgtcct ctagtgacac tgtgatgacc cagtctcccg 40

<210> 62

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述:11H10轻链的引物R

<400> 62

gtgcagccac cgtacgtttt atttccaact tcgtccctga 40

<210> 63

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 11H10重链的引物F

<400> 63

aagggcgtgc agtgccaggt acaactgaag gagacaggac 40

<210> 64

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 11H10重链的引物R

<400> 64

gccccttggt gctagctgag gagactgtga ccatgactcc 40

<210> 65

<211> 110

<212> PRT

<213> 人

<400> 65

Ser Ala Gly Ala Gly Ser His Cys Gln Lys Thr Ser Leu Arg Val Asn

1 5 10 15

Phe Glu Asp Ile Gly Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Lys Glu Tyr

20 25 30

Glu Ala Tyr Glu Cys Lys Gly Gly Cys Phe Phe Pro Leu Ala Asp Asp

35 40 45

Val Thr Pro Thr Lys His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Leu Lys

50 55 60

Phe Pro Thr Lys Val Gly Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Ser

65 70 75 80

Pro Ile Ser Val Leu Tyr Lys Asp Asp Met Gly Val Pro Thr Leu Lys

85 90 95

Tyr His Tyr Glu Gly Met Ser Val Ala Glu Cys Gly Cys Arg

100 105 110

<210> 66

<211> 429

<212> PRT

<213> 人

<400> 66

Met Cys Pro Gly Ala Leu Trp Val Ala Leu Pro Leu Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Ala Gly Ser Leu Gln Gly Lys Pro Leu Gln Ser Trp Gly Arg Gly Ser

20 25 30

Ala Gly Gly Asn Ala His Ser Pro Leu Gly Val Pro Gly Gly Gly Leu

35 40 45

Pro Glu His Thr Phe Asn Leu Lys Met Phe Leu Glu Asn Val Lys Val

50 55 60

Asp Phe Leu Arg Ser Leu Asn Leu Ser Gly Val Pro Ser Gln Asp Lys

65 70 75 80

Thr Arg Val Glu Pro Pro Gln Tyr Met Ile Asp Leu Tyr Asn Arg Tyr

85 90 95

Thr Ser Asp Lys Ser Thr Thr Pro Ala Ser Asn Ile Val Arg Ser Phe

100 105 110

Ser Met Glu Asp Ala Ile Ser Ile Thr Ala Thr Glu Asp Phe Pro Phe

115 120 125

Gln Lys His Ile Leu Leu Phe Asn Ile Ser Ile Pro Arg His Glu Gln

130 135 140

Ile Thr Arg Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Val Ser Cys Gln Asn His Val

145 150 155 160

Asp Pro Ser His Asp Leu Lys Gly Ser Val Val Ile Tyr Asp Val Leu

165 170 175

Asp Gly Thr Asp Ala Trp Asp Ser Ala Thr Glu Thr Lys Thr Phe Leu

180 185 190

Val Ser Gln Asp Ile Gln Asp Glu Gly Trp Glu Thr Leu Glu Val Ser

195 200 205

Ser Ala Val Lys Arg Trp Val Arg Ser Asp Ser Thr Lys Ser Lys Asn

210 215 220

Lys Leu Glu Val Thr Val Glu Ser His Arg Lys Gly Cys Asp Thr Leu

225 230 235 240

Asp Ile Ser Val Pro Pro Gly Ser Arg Asn Leu Pro Phe Phe Val Val

245 250 255

Phe Ser Asn Asp His Ser Ser Gly Thr Lys Glu Thr Arg Leu Glu Leu

260 265 270

Arg Glu Met Ile Ser His Glu Gln Glu Ser Val Leu Lys Lys Leu Ser

275 280 285

Lys Asp Gly Ser Thr Glu Ala Gly Glu Ser Ser His Glu Glu Asp Thr

290 295 300

Asp Gly His Val Ala Ala Gly Ser Thr Leu Ala Arg Arg Lys Arg Ser

305 310 315 320

Ala Gly Ala Gly Ser His Cys Gln Lys Thr Ser Leu Arg Val Asn Phe

325 330 335

Glu Asp Ile Gly Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Lys Glu Tyr Glu

340 345 350

Ala Tyr Glu Cys Lys Gly Gly Cys Phe Phe Pro Leu Ala Asp Asp Val

355 360 365

Thr Pro Thr Lys His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Leu Lys Phe

370 375 380

Pro Thr Lys Val Gly Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Ser Pro

385 390 395 400

Ile Ser Val Leu Tyr Lys Asp Asp Met Gly Val Pro Thr Leu Lys Tyr

405 410 415

His Tyr Glu Gly Met Ser Val Ala Glu Cys Gly Cys Arg

420 425

<210> 67

<211> 1290

<212> DNA

<213> 人

<400> 67

atgtgtcctg gggcactgtg ggtggccctg cccctgctgt ccctgctggc tggctcccta 60

caggggaagc cactgcagag ctggggacga gggtctgctg ggggaaacgc ccacagccca 120

ctgggggtgc ctggaggtgg gctgcctgag cacaccttca acctgaagat gtttctggag 180

aacgtgaagg tggatttcct gcgcagcctt aacctgagtg gggtcccttc gcaggacaaa 240

accagggtgg agccgccgca gtacatgatt gacctgtaca acaggtacac gtccgataag 300

tcgactacgc cagcgtccaa cattgtgcgg agcttcagca tggaagatgc catctccata 360

actgccacag aggacttccc cttccagaag cacatcttgc tcttcaacat ctccattcct 420

aggcatgagc agatcaccag agctgagctc cgactctatg tctcctgtca aaatcacgtg 480

gacccctctc atgacctgaa aggaagcgtg gtcatttatg atgttctgga tggaacagat 540

gcctgggata gtgctacaga gaccaagacc ttcctggtgt cccaggacat tcaggatgag 600

ggctgggaga ccttggaagt gtccagcgcc gtgaagcgct gggtccggtc cgactccacc 660

aagagcaaaa ataagctgga agtgactgtg gagagccaca ggaagggctg cgacacgctg 720

gacatcagtg tccccccagg ttccagaaac ctgcccttct ttgttgtctt ctccaatgac 780

cacagcagtg ggaccaagga gaccaggctg gagctgaggg agatgatcag ccatgaacaa 840

gagagcgtgc tcaagaagct gtccaaggac ggctccacag aggcaggtga gagcagtcac 900

gaggaggaca cggatggcca cgtggctgcg gggtcgactt tagccaggcg gaaaaggagc 960

gccggggctg gcagccactg tcaaaagacc tccctgcggg taaacttcga ggacatcggc 1020

tgggacagct ggatcattgc acccaaggag tatgaagcct acgagtgtaa gggcggctgc 1080

ttcttcccct tggctgacga tgtgacgccg acgaaacacg ctatcgtgca gaccctggtg 1140

catctcaagt tccccacaaa ggtgggcaag gcctgctgtg tgcccaccaa actgagcccc 1200

atctccgtcc tctacaagga tgacatgggg gtgcccaccc tcaagtacca ttacgagggc 1260

atgagcgtgg cagagtgtgg gtgcaggtag 1290

<210> 68

<211> 333

<212> DNA

<213> 人

<400> 68

agcgccgggg ctggcagcca ctgtcaaaag acctccctgc gggtaaactt cgaggacatc 60

ggctgggaca gctggatcat tgcacccaag gagtatgaag cctacgagtg taagggcggc 120

tgcttcttcc ccttggctga cgatgtgacg ccgacgaaac acgctatcgt gcagaccctg 180

gtgcatctca agttccccac aaaggtgggc aaggcctgct gtgtgcccac caaactgagc 240

cccatctccg tcctctacaa ggatgacatg ggggtgccca ccctcaagta ccattacgag 300

ggcatgagcg tggcagagtg tgggtgcagg tag 333

<210> 69

<211> 658

<212> PRT

<213> 人

<400> 69

Met Asp Arg Gly Thr Leu Pro Leu Ala Val Ala Leu Leu Leu Ala Ser

1 5 10 15

Cys Ser Leu Ser Pro Thr Ser Leu Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu

20 25 30

Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln

35 40 45

Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val

50 55 60

His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu

65 70 75 80

Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu

85 90 95

Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu

100 105 110

Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln

115 120 125

Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr

130 135 140

Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala

145 150 155 160

Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln

165 170 175

Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg

180 185 190

Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His

195 200 205

Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu

210 215 220

Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu

225 230 235 240

Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro

245 250 255

Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp

260 265 270

Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg

275 280 285

Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg

290 295 300

Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala

305 310 315 320

Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr

325 330 335

Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro

340 345 350

Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met

355 360 365

Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile

370 375 380

Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly

385 390 395 400

Asp Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val

405 410 415

Ser Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser

420 425 430

Ser Ser Pro Gln Arg Lys Lys Val His Cys Leu Asn Met Asp Ser Leu

435 440 445

Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His Phe Leu Gln Ala Ser

450 455 460

Asn Thr Ile Glu Pro Gly Gln Gln Ser Phe Val Gln Val Arg Val Ser

465 470 475 480

Pro Ser Val Ser Glu Phe Leu Leu Gln Leu Asp Ser Cys His Leu Asp

485 490 495

Leu Gly Pro Glu Gly Gly Thr Val Glu Leu Ile Gln Gly Arg Ala Ala

500 505 510

Lys Gly Asn Cys Val Ser Leu Leu Ser Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro

515 520 525

Arg Phe Ser Phe Leu Leu His Phe Tyr Thr Val Pro Ile Pro Lys Thr

530 535 540

Gly Thr Leu Ser Cys Thr Val Ala Leu Arg Pro Lys Thr Gly Ser Gln

545 550 555 560

Asp Gln Glu Val His Arg Thr Val Phe Met Arg Leu Asn Ile Ile Ser

565 570 575

Pro Asp Leu Ser Gly Cys Thr Ser Lys Gly Leu Val Leu Pro Ala Val

580 585 590

Leu Gly Ile Thr Phe Gly Ala Phe Leu Ile Gly Ala Leu Leu Thr Ala

595 600 605

Ala Leu Trp Tyr Ile Tyr Ser His Thr Arg Ser Pro Ser Lys Arg Glu

610 615 620

Pro Val Val Ala Val Ala Ala Pro Ala Ser Ser Glu Ser Ser Ser Thr

625 630 635 640

Asn His Ser Ile Gly Ser Thr Gln Ser Thr Pro Cys Ser Thr Ser Ser

645 650 655

Met Ala

<210> 70

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述:人源化18C1 HV0的氨基酸序列

<400> 70

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Thr Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Leu Gly Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 71

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 LV0的氨基酸序列

<400> 71

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly

65 70 75 80

Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 72

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述:人源化18C1 VLres01的氨基酸序列

<400> 72

Gln Phe Ala Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Ala Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Asn Asp

65 70 75 80

Val Gln Ile Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 73

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 VLres02的氨基酸序列

<400> 73

Gln Phe Val Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Ala Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Asn Asp

65 70 75 80

Val Gln Ile Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 74

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 VLres03的氨基酸序列

<400> 74

Gln Phe Ala Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Asn Asp

65 70 75 80

Val Gln Ile Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 75

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 VLres04的氨基酸序列

<400> 75

Gln Phe Ala Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Ala Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Asn Asp

65 70 75 80

Val Gln Ile Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 76

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 VLres05的氨基酸序列

<400> 76

Gln Phe Ala Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Ala Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Asn Asp

65 70 75 80

Val Gln Val Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 77

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 VLres06的氨基酸序列

<400> 77

Gln Phe Val Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Ala Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Asn Asp

65 70 75 80

Val Gln Val Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 78

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 VLres07的氨基酸序列

<400> 78

Gln Phe Ala Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Asn Asp

65 70 75 80

Val Gln Val Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 79

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述:人源化18C1 VLres08的氨基酸序列

<400> 79

Gln Phe Ala Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Ala Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Asn Asp

65 70 75 80

Val Gln Val Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 80

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 VLres09的氨基酸序列

<400> 80

Gln Phe Ala Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Ala Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Asn Asn

65 70 75 80

Val Gln Ile Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 81

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 VLres10的氨基酸序列

<400> 81

Gln Phe Val Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Ala Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Asn Asn

65 70 75 80

Val Gln Ile Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 82

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 VLres11的氨基酸序列

<400> 82

Gln Phe Ala Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Asn Asn

65 70 75 80

Val Gln Ile Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 83

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述:人源化18C1 VLres12的氨基酸序列

<400> 83

Gln Phe Ala Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Ala Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Asn Asn

65 70 75 80

Val Gln Ile Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 84

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述:人源化18C1 VLres13的氨基酸序列

<400> 84

Gln Phe Ala Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Ala Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Phe Leu Thr Ile Asn Asp

65 70 75 80

Val Gln Ile Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 85

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 VLres14的氨基酸序列

<400> 85

Gln Phe Val Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Ala Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Phe Leu Thr Ile Asn Asp

65 70 75 80

Val Gln Ile Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 86

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 VLres15的氨基酸序列

<400> 86

Gln Phe Ala Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Phe Leu Thr Ile Asn Asp

65 70 75 80

Val Gln Ile Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 87

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 VLres16的氨基酸序列

<400> 87

Gln Phe Ala Leu Ile Gln Ser Asp Ser Met Ser Thr Ser Ala Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met

35 40 45

Ile Tyr Asp Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Phe Leu Thr Ile Asn Asp

65 70 75 80

Val Gln Ile Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Ser Ser

85 90 95

Gly Ile Lys Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 88

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 HVmut01的氨基酸序列

<400> 88

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Asp Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

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85 90 95

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100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 89

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 HVmut02的氨基酸序列

<400> 89

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Asp Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Leu Gly Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 90

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 HVmut03的氨基酸序列

<400> 90

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Asp Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ala Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Glu Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Leu Gly Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 91

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 HVmut04的氨基酸序列

<400> 91

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Asp Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ala Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Glu Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

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100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 92

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 HVmut05的氨基酸序列

<400> 92

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Asp Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Asp Arg Leu Ala Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Glu Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

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100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 93

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 HVmut06的氨基酸序列

<400> 93

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Asp Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Asp Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Glu Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Leu Gly Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 94

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 HVmut07的氨基酸序列

<400> 94

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Asp Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Asp Arg Leu Ala Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Leu Gly Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 95

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 HVmut08的氨基酸序列

<400> 95

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Asp Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Asp Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

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100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 96

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 HVmut09的氨基酸序列

<400> 96

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Asp Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Asp Arg Leu Ala Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Glu Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Leu Gly Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 97

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 HVmut10的氨基酸序列

<400> 97

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Asp Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Asp Arg Leu Ala Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Glu Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Leu Gly Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 98

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 VHres16的氨基酸序列

<400> 98

Gln Val Gln Leu Lys Glu Thr Gly Pro Asp Leu Val Gln Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Asp Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ala Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Glu Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Leu Gly Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 99

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工序列描述: 人源化18C1 HVmut05-10的CDR2的氨基酸序列

<400> 99

Thr Met Trp Asn Gly Gly Gly Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Asp

1 5 10 15