具体实施方式

1. 术语定义

除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语应具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应是明确的，然而，在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。进一步地，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。在本申请中，“或”的使用意指“和/或”，除非另有说明。此外，术语“包括”以及其他形式的使用不是限制性的。此外，术语例如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含超过一个亚单位的元件和组分，除非另有具体说明。

一般地，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名法和技术是本领域众所周知且通常使用的那些。本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法执行，所述参考文献在本说明书自始至终引用且讨论，除非另有说明。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书执行，如本领域通常完成的或如本文描述的。与本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学结合使用的命名法以及实验室程序和技术是本领域众所周知且通常使用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制剂、配制和递送、和患者的治疗。

如本说明书和附加权利要求自始至终使用的，下述术语具有下述含义：

术语“受体”和“受体抗体”指提供或编码一个或多个构架区的至少80 ％、至少85％、至少90 ％、至少95 ％、至少98 ％或100 ％氨基酸序列的抗体或核酸序列。在某些实施方案中，术语“受体”指提供或编码一个或多个恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在另外一个实施方案中，术语“受体”指提供或编码一个或多个构架区和一个或多个恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在一个具体实施方案中，术语“受体”指人抗体氨基酸或核酸序列，其提供或编码一个或多个构架区的至少80 ％、特别是至少85 ％、至少90 ％、至少95 ％、至少98％或100 ％氨基酸序列。依照这个实施方案，受体可以含有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少10个氨基酸残基，其在人抗体的一个或多个具体位置上不出现。受体构架区和/或一个或多个受体恒定区可以例如衍生自或得自种系抗体基因、成熟抗体基因、功能抗体（例如本领域众所周知的抗体、开发中的抗体、或商购可得的抗体）。

如本文使用的，术语“抗体”泛指由4条多肽链，2条重（H）链和2条轻（L）链组成的任何免疫球蛋白（Ig）分子，或其任何功能片段、突变体、变体或衍生，其保留Ig分子的基本表位结合特征。此类突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。其非限制性实施方案在下文讨论。如果抗体能够与分子特异性反应，以从而结合分子与抗体，那么它被说成“能够结合”分子。

术语“抗体缀合物”指结合蛋白，例如与第二种化学部分例如治疗剂或细胞毒剂化学连接的抗体。术语“试剂”指示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或由生物学材料制成的提取物。特别地，治疗剂或细胞毒剂包括但不限于百日咳毒素、泰素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。

如本文使用的，术语“抗体构建体”指包含与接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域连接的本发明的一个或多个抗原结合部分的多肽。接头多肽包含通过肽键连接的2个或更多个氨基酸残基，并且用于连接一个或多个抗原结合部分。此类接头多肽是本领域众所周知的（参见例如，Holliger，P.等人（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444–6448；Poljak，R.J.等人（1994）Structure 2：1121–1123）。免疫球蛋白恒定结构域指重或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的且在表1中表示。

表1：人IgG重链恒定结构域和轻链恒定结构域的序列

再进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的更大免疫粘附分子的部分。此类免疫粘附分子的例子包括链霉亲和素核心区的使用，以制备四聚scFv分子（Kipriyanov，S.M.等人（1995）Human Antibodies and Hybridomas 6：93–101），和半胱氨酸残基、标记肽和C末端多组氨酸标记的使用，以制备二价和生物素化的scFv分子（Kipriyanov，S.M.等人（1994）Mol. Immunol. 31：1047–1058）。抗体部分例如Fab和F（ab'）₂片段可以使用常规技术由完整抗体制备，例如完整抗体分别地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，如本文描述的，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得。

如本文使用的，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”（或简单地“抗体部分”或“抗体片段”）指保留与抗原（例如hRGM A）特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。此类抗体实施方案还可以是双特异性、双重特异性或多特异性形式；与2种或更多种不同抗原特异性结合。在术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的例子包括（i）Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；（ii）F（ab'）₂片段，包括在铰链区通过二硫桥连接的2个Fab片段的二价片段；（iii）由VH和CH1结构域组成的Fd片段；（iv）由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，（v）包含单个可变结构域的dAb片段（Ward等人，（1989）Nature 341：544–546，Winter等人，PCT公开WO 90/05144 A1，引入本文作为参考）；和（vi）分离的互补决定区（CDR）。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开基因编码，但它们可以使用重组法通过合成接头进行连接，所述合成接头使得它们能够制备为单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子（称为单链Fv（scFv）；参见例如，Bird等人（1988）Science 242:423-426；和Huston等人（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883）。此种单链抗体也意欲涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。还包含其他形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，由此迫使该结构域与另一条链的互补结构域配对，并且产生2个抗原结合位点（参见例如，Holliger，P.等人（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444–6448；Poljak，R.J.等人（1994）Structure 2：1121–1123）。此类抗体结合部分是本领域已知的（Kontermann和Dubel编辑，Antibody Engineering（2001）Springer-Verlag. New York.第790页（ISBN 3-540-41354-5）。

术语“抗原决定簇”或“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何多肽决定簇。在特定实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面分组，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在特定实施方案中，可以具有特定三维结构特征，和/或特定电荷特征。表位是由抗体结合的抗原区域。在特定实施方案中，当抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优选识别其靶抗原时，它被说成特异性结合抗原。

术语“生物学活性的”指如本文定义的RGM A的所有固有生物学特性。

术语“经典残基”指CDR或构架中的残基，其限定如由Chothia等人（J. Mol. Biol.196：901–907（1987）；Chothia等人，J. Mol. Biol. 227：799（1992），两者引入本文作为参考）定义的特定经典CDR结构。根据Chothia等人，许多抗体的CDRs的关键部分具有几乎等同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上的极大多样性。每个经典结构主要指定关于形成环的氨基酸残基邻接区段的一组肽主链扭角。

术语“嵌合抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序列和来自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重和轻链可变区的抗体。嵌合抗体可以通过重组分子生物学技术产生，或可以物理上缀合在一起。

术语“CDR”指在抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在3个CDRs，对于每个可变区其指定CDR1、CDR2和CDR3。如本文使用的，术语“CDR组”指在能够结合抗原的单个可变区中出现的一组3个CDRs。这些CDRs的确切边界已根据不同系统不同定义。由Kabat（Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health，Bethesda，Md.（1987）和（1991））描述的系统不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了定义3个CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以称为Kabat CDRs。Chothia和同事（Chothia &Lesk，J. Mol. Biol. 196：901–917（1987）和Chothia等人，Nature 342：877–883（1989））发现在Kabat CDRs内的特定亚部分采用几乎等同的肽主链构象，尽管具有在氨基酸序列水平上的极大多样性。这些亚部分指定为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指定轻链和重链区域。这些区域可以称为Chothia CDRs，其具有与Kabat CDRs重叠的边界。定义与Kabat CDRs重叠的CDRs的其他边界已由Padlan（FASEB J. 9:133-139（1995））和MacCallum（J Mol Biol 262（5）：732–45（1996））描述。另外其他的CDR边界定义可能不严格遵循上述系统之一，但仍与KabatCDRs重叠，尽管它们可以根据下述预测或实验发现缩短或加长：特定残基或残基组或甚至整个CDRs不显著影响抗原结合。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何定义的CDRs，尽管特定实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDRs。

术语“CDR移植抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列由另一个物种的CDR序列替换，例如具有鼠重和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠CDRs（例如CDR3）已由人CDR序列替换。

术语“晶体”和“晶状的”指以晶体形式存在的抗体或其抗原结合部分。晶体是物质的一种固态形式，这不同于其他形式例如无定形固态或液体晶态。晶体由原子、离子、分子（例如蛋白质例如抗体）或分子装配（例如抗原/抗体复合物）的常规、重复、三维阵列组成。这些三维阵列根据本领域充分了解的特定数学关系排列。在晶体中重复的基本单位或构件块称为不对称单位。符合给定、充分定义的晶体学对称性的不对称单位在排列中的重复提供晶体的“晶胞”。在所有3个尺度中晶胞通过规则平移的重复提供了晶体。参见Giege，R.和Ducruix，A. Barrett，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，a PracticalApproach，第2版，第20页，1–16，Oxford University Press，New York，New York,（1999）."。

术语“供体”和“供体抗体”指提供一个或多个CDRs的抗体。在一个特定实施方案中，供体抗体是来自不同于由其获得或衍生构架区的抗体的物种的抗体。在人源化抗体的背景中，术语“供体抗体”指提供一个或多个CDRs的非人抗体。

术语“有效量”指这样的治疗量，其足以减少或改善病症或其一种或多种症状的严重性和/或持续时间，阻止病症的进展，引起病症的消退，阻止与病症相关的一种或多种症状的复发、发展、发作或进展，检测病症，或增强或改善另一种治疗（例如预防或治疗剂）的一种或多种预防或治疗效应。

术语“构架”或“构架序列”指可变区减去CDRs的其余序列。因为CDR序列的确切定义可以通过不同系统测定，所以对构架序列的含义实施相应不同解释。6个CDRs（轻链的CDR-L1、-L2和-L3以及重链的CDR-H1、-H2和-H3）也将在轻链和重链上的构架区分成在每条链上的4个亚区（FR1、FR2、FR3和FR4），其中CDR1定位于FR1和FR2之间，CDR2在FR2和FR3之间，并且CDR3在FR3和FR4之间。不将特定亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4，如由其他人提及的，构架区代表在单个、天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合FR's。如本文使用的，FR代表4个亚区之一，并且FRs代表构成构架区的4个亚区中的2个或更多个。

人重链和轻链受体序列是本领域已知的。在本发明的一个实施方案中，人重链和轻链受体序列选自表2和表3中所述的序列。关于人构架序列FR1至FR4的不同组合在所述表中陈述。

表2：人重链受体序列

表3：人轻链受体序列

术语“种系抗体基因”或“基因片段”指由非淋巴样细胞编码的免疫球蛋白序列，其未经历导致关于特定免疫球蛋白表达的遗传重排和突变的成熟过程（参见例如，Shapiro等人，Crit. Rev. Immunol. 22（3）：183-200（2002）；Marchalonis等人，Adv Exp Med Biol.484:13-30（2001））。由本发明的各个实施方案提供的优点之一源于下述认识：种系抗体基因比成熟抗体基因有可能保存物种中个体特有的必需氨基酸序列结构，因此当在那个物种中治疗上使用时，更不可能识别为来自外来来源。

如本文使用的，术语“人抗体”意欲包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括例如在CDRs且特别是CDR3中，不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，在体外通过随机或定点诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变）。然而，如本文使用的，术语“人抗体”不意欲包括其中衍生自另一个哺乳动物物种例如小鼠种系的CDR序列已移植到人构架序列上的抗体。

术语“人源化抗体”指包含来自非人物种（例如小鼠）的重和轻链可变区序列的抗体，但其中至少部分VH和/或VL序列已改变为更“人样的”，即更类似于人种系可变序列。一类人源化抗体是CDR移植抗体，其中人CDR序列引入非人VH和VL序列内，以替换相应非人CDR序列。人源化抗体包括抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其与目的抗原免疫特异性结合，并且包含具有基本上人抗体的氨基酸序列的构架（FR）区和具有基本上非人抗体的氨基酸序列的互补决定区（CDR）。如本文使用的，在CDR的背景中的术语“基本上”指具有与非人抗体CDR的氨基酸序列至少50、55、60、65、70、75或80 ％，特别是至少85 ％、至少90 ％、至少95 ％、至少98 ％或至少99 ％等同的氨基酸序列的CDR。人源化抗体包含至少一个且一般是2个可变结构域（Fab、Fab'、F（ab'）₂、FabC、Fv）的基本上全部，其中CDR区的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白（即供体抗体）的那些，并且构架区的全部或基本上全部是人免疫球蛋白共有序列的那些。特别地，人源化抗体还包含至少部分免疫球蛋白恒定区（Fc），一般是人免疫球蛋白的那种。在某些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及重链的至少可变结构域。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在具体实施方案中，人源化抗体仅含有轻链的人源化可变结构域和/或人源化重链。

人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何种类，包括IgY、IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括但不限于IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包含来自超过一个种类或同种型的序列，并且特别地使用本领域众所周知的技术，恒定结构域可以选择为最佳化所需效应子功能。

人源化抗体的构架和CDR区无需精确对应于亲本序列，例如供体抗体CDR或共有构架可以通过至少一个氨基酸残基的置换、插入和/或缺失进行诱变，从而使得在那个位点上的CDR或构架残基不对应于供体抗体或共有构架。在一个特定实施方案中，然而，此类突变将不是广泛的。通常，至少50、55、60、65、70、75或80 ％，特别地至少85 ％，更特别地至少90％且最特别地至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的那些。如本文使用的，术语“共有构架”指在共有免疫球蛋白序列中的构架区。如本文使用的，术语“共有免疫球蛋白序列”指由在相关免疫球蛋白序列家族中最频繁出现的氨基酸（或核苷酸）形成的序列（参见例如，Winnaker，From Genes to Clones（Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国1987）。在免疫球蛋白家族中，在共有序列中的每个位置由在家族中的那个位置上最频繁出现的氨基酸占据。如果2个氨基酸同样频繁地出现，那么任一可以包括在共有序列中。

术语“人RGM A”（本文缩写为hRGM A）指具有450个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇（gpi）锚定糖蛋白，首先描述为在地形投影的发展过程中的神经突生长拒斥剂或神经突生长抑制剂（Stahl等人Neuron 5：735–43，1990；Mueller，in Molecular Basis of Axon Growthand Nerve Pattern Formation，由H. Fujisawa编辑，Japan Scientific SocietiesPress，215–229，1997）。rgm基因家族涵盖3个不同基因，其中2种，rgm a和b在哺乳动物CNS中表达，而第三个成员，rgm c在外周中表达（Mueller等人，Philos. Trans. R. Soc.Lond. B Biol. Sci. 361：1513–29，2006），其中它在铁代谢中起重要作用。人RGM蛋白质具有43 ％–50 ％的序列同一性；人和大鼠RGM A的氨基酸同源性是89 ％。人RGM蛋白质与任何其他已知蛋白质不共享显著序列同源性。它们是含有RGD区的富含脯氨酸的蛋白质，并且与Von-Willebrand-因子结构域具有结构同源性，并且通过未知蛋白酶在N末端氨基酸168上切割，以获得功能活性蛋白质（Mueller等人，Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol.Sci. 361：1513–29，2006）。

在体外，RGM A通过与Neogenin结合在皮摩尔浓度抑制神经突长出，所述Neogenin已鉴定为RGM受体（Rajagopalan等人Nat Cell Biol.：6（8），756–62，2004）。Neogenin首先被描述为netrin结合蛋白（Keino-Masu等人Cell，87（2）：175–85，1996），但它对于Netrin（K_d 2nM）的亲和力比对于RGM（K_d 0.2 nM）的那种低1个数量级（Rajagopalan等人Nat CellBiol.：6（8），756–62，2004）。这是重要发现，因为Netrin-1与Neogenin或其紧密相关受体DCC（在结肠直肠癌中是缺失的）的结合已报道为刺激而不是抑制神经突生长（Braisted等人J. Neurosci. 20：5792–801，2000）。

除RGM A与Neogenin结合和诱导神经突生长抑制外，RGM A或B与骨形态发生蛋白BMP-2和BMP-4的结合可以代表关于成功神经再生和功能恢复的另一个障碍（Mueller等人，Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361：1513–29，2006）。2类蛋白质（Neogenin和BMPs）已报道为经由2个完全不同和独立的信号转导途径转导RGM A的神经突生长抑制信号。通常，这些BMP蛋白质的表达在成年CNS的大多数区域中是相对低的，但已报道了响应损伤和创伤在某些BMPs（例如BMP-2、BMP-6、BMP-7）的表达和累积中的快速增加（Lai等人，Neuroreport 8：2691 – 94， 1997；Martinez等人Brain Res. 894：1–11，2001；Hall和Miller，J. Neurosci. Res. 76：1–8，2004；Setoguchi等人，Exp. Neurol. 189：33–44，2004）。此外，在多发性硬化的模型，即实验性自身免疫脑脊髓炎（EAE）模型中，BMP-4、BMP-6和BMP-7在小鼠脊髓中是上调的（Ara等人，J. Neurosci.Res. 86：125–35，2008）。BMP-2已报道为通过与细胞表面RGM A、BMP受体I和II结合和通过直接激活LIM激酶抑制神经突生长（Matsuura等人Biochem Biophys Res Commun.，360：868–73，2007），并且因此预期阻断RGM A-BMP-2相互作用将进一步增加在CNS损伤后的功能恢复。

如上所述，脊髓损伤的大鼠和具有脑损伤的人显示在损伤部位处细胞RGM的大量累积，并且在大鼠中在脊柱病损部位处RGM A的染色模式非常类似于在人中的泛RGM抗体染色，暗示在人中的大多数泛RGM染色与RGM A定位相关，而不与RGM B定位相关（Schwab等人，Arch. Neurol.62：1561-8，2005a；Schwab等人Eur. J. Neurosci. 21：1569–76，2005 b；Hata等人J. Cell Biol.173：47–58，2006）。在健康人脑中，在白质纤维、少突胶质细胞、少数神经元的核周体、某些血管平滑肌和少数内皮细胞上检测到泛RGM染色（RGM A & B免疫反应性）。未观察到星形细胞的染色。在成年健康人脑中的RGM染色模式非常类似于在成年大鼠脊髓中观察到的染色模式（Schwab等人Eur. J. Neurosci. 21：1569–76，2005 b；Hata等人J. Cell Biol. 173：47–58，2006）。

基于在脑和脊髓损伤中在病损部位处RGM A的累积并且由于其细胞神经突生长抑制活性，预期蛋白质将发挥神经突生长抑制活性，并且其通过与人RGM A的至少一个表位结合的抗体或抗原结合片段的中和，可以导致受损神经纤维的改善再生长和特征在于神经纤维损伤和RGM累积的适应症中功能恢复的增强。

术语“RGM A”还涵盖从其他物种例如啮齿动物如小鼠或大鼠中分离或获得的RGMA分子；具体而言，大鼠衍生的分子在本文中指定为“大鼠RGM A”。

表4：RGM A相关分子的序列表

术语“RGM与其受体之一的结合的抑制”涵盖所述受体结合活性的部分（如例如约20 ％、40 ％、60 ％、80 ％、85 ％、90 ％、95 ％或更多）或完全减少。所述“结合的抑制”可以通过本领域可获得的任何合适方法进行测定，特别通过如本文例示的任何方法，如例如基于ELISA的结合测定。

如本文使用的，“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体（例如特异性结合hRGM A的分离的抗体基本上不含特异性结合除hRGM A外的抗原的抗体）。然而，特异性结合hRGM A的分离的抗体可以与其他抗原，例如来自其他物种的RGM A分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学制品。

术语“分离的多核苷酸”应意指这样的多核苷酸（例如具有基因组、cDNA或合成来源，或其某些组合），由于其起源，“分离的多核苷酸”：与“分离的多核苷酸”与之一起在自然界中发现的多核苷酸的全部或部分不结合；与在自然界中它与之不连接的多核苷酸可操作地连接；或在自然界中不作为较大序列的部分出现。

术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是这样的蛋白质或多肽，由于其起源或衍生来源，其与在其天然状态中伴随其的天然结合的组分不结合；基本上不含来自相同物种的其他蛋白质；由来自不同物种的细胞表达；或在自然界中不出现。因此，化学合成或在不同于它天然源于其的细胞的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合的组分“分离的”。使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术，蛋白质也可以通过分离致使基本上不含天然结合的组分。

术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域公认的这些术语指编号氨基酸残基的系统，所述氨基酸残基比抗体或其抗原结合部分的重和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变（即高变）（Kabat等人（1971）Ann. NY Acad，Sci. 190：382–391和Kabat，E.A.等人（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest， Fifth Edition，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91–3242）。对于重链可变区，高变区范围为关于CDR1的氨基酸位置31 – 35，关于CDR2的氨基酸50 –65，和关于CDR3的氨基酸位置95 – 102。对于轻链可变区，高变区范围为关于CDR1的氨基酸位置24 – 34，关于CDR2的氨基酸50 – 56，和关于CDR3的氨基酸位置89 – 97。

术语“Kd”指如本领域已知的特定抗体-抗原相互作用的解离常数。

术语“关键残基”指在可变区内的特定残基，其对抗体特别是人源化抗体的结合特异性和/或亲和力具有更多影响。关键残基包括但不限于下述中的一个或多个：与CDR相邻的残基，潜在糖基化位点（可以是N或O糖基化位点），罕见残基，能够与抗原相互作用的残基，能够与CDR相互作用的残基，经典残基，在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基，在Vernier区带内的残基，和在可变重链CDR1的Chothia定义和第一个重链构架的Kabat定义之间重叠的区域中的残基。

术语“k_on”指如本领域已知的关于抗体与抗原结合以形成抗体/抗原复合物的结合速率常数。

术语“k_off”指如本领域已知的关于抗体与抗体/抗原复合物解离的离开速率常数。

术语“标记的结合蛋白”指具有掺入的标记的蛋白质，所述标记提供结合蛋白的鉴定。特别地，标记是可检测标记，例如放射性标记的氨基酸的掺入或附着至生物素基部分的多肽，所述生物素基部分可以通过标记的抗生物素蛋白（例如含有可以通过光学或比色法检测的荧光标记或酶促活性的链霉抗生物素蛋白）进行检测。关于多肽的标记的例子包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素（例如³H、¹⁴C、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho或¹⁵³Sm）；荧光标记（例如FITC、罗丹明、镧系磷光体）、酶促标记（例如辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶）；化学发光标记；生物素基；由二次报道分子（例如亮氨酸拉链对序列、关于二次抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签）识别的预定多肽表位；和磁性试剂例如钆螯合剂。

术语“局部治疗”指本发明的结合蛋白或含有其的制剂直接在待治疗的哺乳动物体内的预期区域上的任何施用形式，在所述哺乳动物中预期诱导所需神经保护或神经再生作用。

术语“调整”和“调节”可互换使用，并且指目的分子的活性（例如hRGM A的生物学活性）中的变化或改变。调整可以是目的分子的特定活性或功能量级中的增加或减少。分子的示例性活性和功能包括但不限于结合特征、酶促活性、细胞受体激活和信号转导。

相应地，术语“调节剂”是能够改变或更改目的分子的活性或功能（例如hRGM A的生物学活性）的化合物。例如，与在不存在调节剂的情况下观察到的活性或功能量级比较，调节剂可以引起分子的特定活性或功能量级中的增加或减少。如本文使用的，术语“激动剂”指这样的调节剂，当与目的分子接触时，与在不存在激动剂的情况下观察到的活性或功能量级比较，其引起分子的特定活性或功能量级中的增加。特定目的激动剂可以包括但不限于一种或多种hRGM A多肽、核酸、碳水化合物或与hRGM A结合的任何其他分子。如本文使用的，术语“拮抗剂”指这样的调节剂，当与目的分子接触时，与在不存在拮抗剂的情况下观察到的活性或功能量级比较，其引起分子的特定活性或功能量级中的减少。示例性拮抗剂包括但不限于蛋白质、肽、抗体、肽体（peptibodies）、碳水化合物或小有机分子。肽体例如在WO01/83525中描述。

特别有利的拮抗剂包括阻断或调解hRGM A的生物学或免疫活性的那些。hRGM A的拮抗剂可以包括但不限于与hRGM A结合的蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其他分子，如与RGM A分子相互作用的单克隆抗体。应当指出与RGM A的相互作用可以导致其他配体/细胞膜组分的结合和中和，并且对于针对多重疾病的附加或协同功能可以是有用的。

术语“单克隆抗体”指抗体分子的制剂，其共享共同的重链和共同的轻链氨基酸序列，与含有不同抗体的混合物的“多克隆”抗体制剂形成对比。单克隆抗体可以通过几种新技术如噬菌体、细菌、酵母或核糖体展示，以及由杂交瘤衍生的抗体例示的常规方法生成（例如通过经由杂交瘤技术制备的杂交瘤分泌的抗体，例如标准Kohler和Milstein杂交瘤方法（（1975）Nature 256：495–497）。

在全长抗体中，每条重链包括重链可变区（本文缩写为HCVR或VH）和重链恒定区。重链恒定区包括3个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区（本文缩写为LCVR或VL）和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域，CL。VH和VL区可以进一步再分成称为互补性决定区（CDRs）的高变区，由称为构架区（FR）的更保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成，从氨基末端到羧基末端以下述次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以具有任何类型（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、类别（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亚类。

术语“神经保护的”或“神经保护”指这样的治疗，其使神经元细胞特别是包含RNFL细胞的细胞不受损害或变性（可通过观察视网膜中的RGC（视网膜神经节细胞）轴突不受变性的保护分析的；或如上文定义的经由RNFL厚度丧失可测量的“异常”RNFL变性的抑制。

术语“神经再生的”或“神经再生”指根据本发明的治疗，其导致神经元细胞特别是包含损害RNFL细胞的细胞的修复或再生长（可通过例如视网膜的光学相干断层扫描（OTC），视神经的弥散张量成像；视网膜神经元萌芽分析的）。

术语“中和”指当结合蛋白特异性结合靶蛋白时，靶蛋白的生物学活性的中和。中和可以是所述结合蛋白与靶的结合的不同途径的结果。例如，中和可以是通过在靶区域中结合蛋白的结合引起的，其不影响与靶分子的受体结合。可替代地，结合蛋白的结合可以导致受体与靶的结合的阻断，所述阻断最终中和靶蛋白活性。中和结合蛋白是其与RGM A的结合导致hRGM A的生物学活性中和的中和抗体。特别地，中和结合蛋白结合hRGM A，且使hRGMA的生物学活性减少至少约20 ％、40 ％、60 ％、80 ％、85 ％或更多。通过中和结合蛋白的hRGM A的生物学活性中和可以通过测量本领域众所周知的hRGM A生物学活性的一种或多种指示剂进行评估。例如，hRGM A的中和逆转Ntera神经元长出测定中的抑制（参见下文实施例3）。Ntera神经突长出测定解决了神经突长出的抑制。在不存在抑制性RGM A蛋白质或片段的情况下和在长出刺激底物层粘连蛋白的存在下，神经元Ntera聚集体显示长出神经突的广泛和密集网络。RGM A或RGM A片段抑制神经突长出，导致神经突的长度和数目减少。在具有分化人NTera神经元的聚集体的神经突长出测定中，功能阻断RGM A拮抗剂或MABs如mAb 5F9中和有力fc缀合的hRGM A轻链片段（氨基酸47–168）的神经突长出抑制活性，导致神经突长度和数目中的强烈增加。

术语“中和单克隆抗体”指抗体分子的制剂，其在与特异性抗原结合后能够竞争且抑制天然配体对于所述抗原的结合。在本申请的一个特定实施方案中，本发明的中和抗体能够与RGM A竞争结合Neogenin和/或BMP-2和/或BMP-4，并且阻止RGM A生物学活性或功能。特别地，本发明的中和抗体能够与RGM A结合且阻止与Neogenin和/或BMP-2和/或BMP-4的结合，且阻止RGM A生物学活性或功能。术语“活性”包括活性例如抗体例如与RGM A抗原结合的抗hRGM A抗体对于抗原的结合特异性/亲和力，和/或抗体例如其与hRGM A的结合抑制hRGM A的生物学活性的抗hRGM A抗体的中和效力，例如如在下文实验节段中所述的hRGMA-Neogenin结合测定、hRGM A-BMP-2结合测定或hRGM A-BMP-4结合测定中测定的。

RGM A的生物学活性可以描述为调节细胞迁移。细胞迁移的具体例子是神经突生长，其由RGM A蛋白质阻碍或抑制。此外，RGM A蛋白质已显示调整BMP蛋白质的活性。本文公开的例子描述了RGM蛋白质在一旁对BMP途径的协同、加强活性和RGM蛋白质对BMP途径的抑制活性，其对于铁代谢、骨和软骨再生的调节和在CNS中对于髓鞘再生和再生是重要的。

术语“可操作地连接的”指其中所述组分处于允许其以其预期方式起作用的关联中的并列。与编码序列“可操作地连接的”控制序列以这样的方式连接，从而使得在与控制序列相容的条件下达到编码序列的表达。“可操作地连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列，和反式或在远处起作用以控制目的基因的表达控制序列。如本文使用的，术语“表达控制序列”指多核苷酸序列，其是实现它们与之连接的编码序列表达和加工所需的。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列（即Kozak共有序列）；增强蛋白质稳定性的序列；和当需要时，增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质取决于宿主生物而不同；在原核生物中，此类控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，一般地，此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意欲包括其存在对于表达和加工是必需的组分，并且还可以包括其存在是有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。

术语“多核苷酸”意指聚合形式的2个或更多个核苷酸，为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或修饰形式的任一类型的核苷酸。该术语包括单和双链形式的DNA，但主要是双链DNA。

术语“多肽”指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白质”与术语多肽可互换使用，并且还指氨基酸的聚合链。术语“多肽”涵盖天然或人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。

术语“重组宿主细胞”（或简单地“宿主细胞”）意指外源DNA已引入其内的细胞。应当理解此类术语不仅意指特定主题细胞，还意指此类细胞的后代。因为特定修饰可以由于突变或环境影响在后续代中出现，所以此类后代可能事实上不等同于亲本细胞，但仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。特别地，宿主细胞包括选自任何生命界的原核和真核细胞。特定真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。最特别地，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293和COS；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成、以及组织培养和转化（例如电穿孔、脂转染）。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域通常完成的或如本文描述的执行。前述技术和程序一般可以根据本领域众所周知且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法执行，所述参考文献在本说明书自始至终引用且讨论。参见例如，Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual（第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.（1989）），其为了任何目的引入本文作为参考。

如本文使用的，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体（下文进一步描述的），从重组、组合人抗体文库中分离的抗体（Hoogenboom H.R.,（1997）TIB Tech. 15：62–70；Azzazy H.和Highsmith W.E.,（2002）Clin. Biochem. 35：425–445；Gavilondo J.V.和Larrick J.W.（2002）BioTechniques 29：128–145；Hoogenboom H.和Chames P.（2000）Immunology Today 21：371–378），从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物（例如小鼠）中分离的抗体（参见例如，Taylor，L. D.等人（1992）Nucl. Acids Res. 20：6287–6295；Kellermann S-A.和Green L.L.（2002）Current Opinion in Biotechnology 13：593–597；Little M.等人（2000）Immunology Today 21：364–370），或通过任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体，所述任何其他方法涉及人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接。此类重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在特定实施方案中，对此类重组人抗体实施体外诱变（或当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变），并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其虽然衍生自人种系VH和VL序列且与之相关，但可能并非天然存在于体内人抗体种系储库内。

术语“回收”指通过分离致使化学种类例如多肽基本上不含天然结合的组分的过程，例如使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术。

术语“RNFL”是视网膜的最内层，并且主要由来自构成视神经的神经节细胞神经元的轴突组成。视网膜层结构包含所述最里面的RNFL，随后为内丛状层（IPL）、外丛状层（OPL）、光感受器层（PRL）和视网膜色素上皮（RPE）。在健康个体中，RNFL到15岁时仅约110–120 µm厚，并且最正常的个体在视网膜厚度中将丧失约0.017 ％/年，这经过60年等于约10–20 µm（RNFL厚度中的变化可以例如通过如Frohman等人，上文描述的OCT法进行测定）。所述厚度丧失还可以指定“正常”RNFL变性。

超过或大于所述“正常”变性的变性或厚度丧失还可以指定为“异常”或“疾病相关的”RNFL变性。特别地，厚度的此类异常丧失可以超过0.017％，如例如超过0.02 ％、或超过0.1 ％、或超过1％、或超过5％、或超过10 ％或超过20 ％/年，如例如1 - 10 ％或2 - 5％/月。

术语“RNFL变性”涵盖RNFL的正常且特别是异常的疾病相关厚度丧失。

术语“样品”以其最广泛的含义使用。如本文使用的，“生物学样品”包括但不限于来自活体或以前活体的物质的任何数量。此类活体包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴、犬、兔及其他动物。此类物质包括但不限于血液、血清、尿、滑液、细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾脏。

如本文使用的，提及抗体、蛋白质或肽与第二种化学种类的相互作用的术语“特异结合”或“特异性结合”，意指相互作用取决于在化学种类上的特定结构（例如如下文定义的“抗原决定簇”或“表位”）的存在；例如，抗体识别且结合特异性蛋白质结构而不是一般地蛋白质。如果抗体对于表位“A”是特异性的，那么在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A（或游离的未标记的A）的分子的存在将减少标记的A与抗体结合的量。

术语“表面等离振子共振”指例如使用BIAcore系统通过检测在生物传感器基质内蛋白质浓度中的改变，允许分析实时生物特异性相互作用的光学现象（PharmaciaBiosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ）。关于进一步描述，参见Jönsson，U.等人（1993）Ann. Biol. Clin. 51：19–26；Jönsson，U.等人（1991）Biotechniques 11：620–627；Johnsson，B.等人（1995）J. Mol. Recognit. 8：125–131；和Johnnson，B.等人（1991）Anal. Biochem. 198：268–277。

术语“全身性治疗”指本发明的结合蛋白或含有其的制剂对于待治疗的哺乳动物体内的任何施用形式，从而使得结合蛋白经由血流到达神经保护或神经再生作用的预期场所。例如，全身性施用涵盖本发明的结合蛋白或含有其的制剂的输注或注射。

术语“转化”指通过其外源DNA进入宿主细胞的任何过程。转化可以使用本领域众所周知的各种方法在天然或人工条件下发生。转化可以依赖于用于将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞内的任何已知方法。该方法基于待转化的宿主细胞进行选择，并且可以包括但不限于病毒感染、电穿孔、脂转染和粒子轰击。此类“转化的”细胞包括稳定转化的细胞，其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的部分复制。它们还包括瞬时表达插入的DNA或RNA有限时间段的细胞。

术语“转基因生物”指具有含有转基因的细胞的生物，其中引入生物（或生物祖先）内的转基因表达在生物中不天然表达的多肽。“转基因”是DNA构建体，其稳定且可操作地整合到转基因生物由其发展的细胞的基因组内，指导编码基因产物在转基因生物的一个或多个细胞类型或组织中的表达。

术语“RNFL变性的治疗”指RNFL变性的治疗（即急性）和预防治疗。所述治疗可以是“神经再生的”或“神经保护的”；所述治疗可以以“局部”或“全身性”治疗的形式。

术语“载体”指能够转运它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其指另外的DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。特定载体能够在它们引入其内的宿主细胞中自主复制（例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其他载体（例如非附加型哺乳动物载体）可以在引入宿主细胞内后整合到宿主细胞的基因组内，并且从而连同宿主基因组一起复制。此外，特定载体能够指导它们与之可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”（或简单地“表达载体”）。一般而言，在重组DNA技术中利用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用形式的载体。然而，本发明意欲包括此类其他形式的表达载体，例如病毒载体（例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒），其发挥等价功能。

术语“vernier区带”指可以调整CDR结构且细调与抗原的拟合的构架残基亚组，如由Foote和Winter（1992，J. Mol. Biol. 224：487–499，其引入本文作为参考）描述的。Vernier区带残基形成在CDRs下的层，并且可以影响CDRs的结构和抗体的亲和力。

2. RGM A抗体的用途

针对RGM A的中和单克隆抗体选择性抑制RGM A与其受体Neogenin以及骨形态发生蛋白2和4（BMP-2、BMP-4）的结合。中和单克隆抗体刺激受损或损害神经纤维的再生长和再生神经纤维的功能突触的形成，且在视神经损伤的体内大鼠模型中诱导长距离再生，并且它还增强损伤和再生神经纤维的髓鞘再生（参见PCT/EP2009/001437）。

令人惊讶的是，观察到针对RGM A的抗体与对RNFL的另外尚未识别的直接治疗作用有关。特别地，患有与RNFL变性有关的眼疾病或具有RNFL变性危险的患者可以用如本文定义的抗体分子进行治疗。本发明还基于令人惊讶的发现：全身性施用的本发明的抗体定位于视网膜中，且在眼的病变区直接发挥其有利效应。

因此，首次，本文提供了使用能够结合RGM A的抗体直接治疗特定患者组的方法，旨在保护不受RNFL变性或旨在已变性RNFL的再生。

另一个实施方案涉及使用能够结合RGM A的抗体神经保护治疗如在大量疾病状况中观察到的RNFL变性。

另一个实施方案涉及单克隆抗体用于治疗RNFL变性的用途，所述单克隆抗体阻断RGM A且阻止RGM A及其受体和/或结合蛋白即Neogenin和BMP-2、BMP-4之间的相互作用。

本发明的另一个实施方案涉及用于在RNFL变性治疗中使用的关于人RGM A的结合蛋白。

在另一个实施方案中，所述治疗是治疗或预防、神经再生或神经保护、局部或全身性治疗。

在另一个实施方案中，作为所述治疗的结果：

a. 观察到视网膜神经元萌芽；和/或

b. 在视网膜中的RGC（视网膜神经节细胞）轴突保护不受变性。

根据一个方面，本发明提供了用于在RNFL变性治疗中使用的结合蛋白，其以1 x10^-7 M或更少的K_D和1 x 10^-2 s^-1或更少的k_off速率常数与人RGM A（hRGM A）解离，两者通过表面等离振子共振测定。

根据另一个方面，本发明涉及用于在RNFL变性治疗中使用的结合蛋白，如例如显示上述动力学特征的结合蛋白，如在标准体外测定如例如如下文实施例3中例示的Ntera神经突长出测定中测定的，其与人RGM A结合且中和人RGM A的神经突长出抑制活性。

另一个实施方案还涉及用于如上所述使用的结合蛋白，其具有下述另外的功能特征中的至少一个：

与大鼠RGM A结合，

与人RGM C结合，和

与大鼠RGM C结合。

在另一个实施方案中，如本文定义的结合蛋白调整RGM与其受体中的至少一种结合的能力。此类结合蛋白与人RGM A的受体结合结构域结合。对于RGM A，N和C末端受体结合结构域已得到鉴定。本发明的结合蛋白的特定实施方案与RGM A的N末端受体结合结构域结合，如通过在N末端hRGM A片段如例如47-168和受体分子如Neogenin和BMP-4之间的结合的抑制举例说明的。所述N末端hRGM A片段可以具有约30 - 约150、或约30 - 约122个氨基酸残基的总长度。作为非限制性例子，可以提及如本文描述的hRGM A的片段0（对应于N末端残基47-168）或任何更短的受体结合片段。

在另一个实施方案中，所述结合蛋白调整或抑制下述相互作用中的至少一种：

人RGM A与人BMP-4的结合，

hRGM A与人Neogenin的结合，

hRGM C与人Neogenin的结合，

人RGM A与人BMP-2的结合。

根据一个特定实施方案，如本文定义的结合蛋白是人源化抗体。

如上所述的结合蛋白可以具有抗原结合结构域，所述结合蛋白能够结合RGM分子的表位，所述抗原结合结构域包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个CDR

GTTPDY （SEQ ID NO:59），

FQATHDPLT （SEQ ID NO:62），

ARRNEYYGSSFFDY （SEQ ID NO:65），

LQGYIPPRT （SEQ ID NO:68），和

与所述序列之一具有至少50 ％序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗原结合结构域的结合蛋白，所述结合蛋白能够结合RGM分子的表位，所述抗原结合结构域包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个CDR：

GTTPDY （SEQ ID NO:59），

FQATHDPLT （SEQ ID NO:62），

ARRNEYYGSSFFDY （SEQ ID NO:65），

LQGYIPPRT （SEQ ID NO:68），和

与所述序列之一具有至少50 ％序列同一性，如例如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 ％同一性的修饰的CDR氨基酸序列。

例如，所述结合蛋白可以包含所述CDRs中的2个，如例如SEQ ID NO:59和62；或SEQID NO:65和68；其中所述CDRs中的至少一个可以是修饰的，与所述序列之一具有至少50 ％序列同一性，如例如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 ％同一性。

所述结合蛋白可以进一步包括包含选自SEQ ID NO:57、58、60、61、63、64、66、67的氨基酸序列的至少一个CDR，和与所述序列之一具有至少50 ％序列同一性，如例如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 ％同一性的修饰的CDR氨基酸序列。

在另一个实施方案中，所述至少一个CDR包含选自下述的氨基酸序列：

在另一个实施方案中，所述结合蛋白包含至少3个CDRs，其选自由下述构成的可变结构域CDR组：

或可变结构域组，其中所述3个CDRs中的至少一个是与亲本序列具有至少50 ％序列同一性，如例如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 ％同一性的修饰的CDR氨基酸序列。

所述上文提及的修饰各自可以通过单个或多个氨基酸添加、缺失或特别地置换或其组合生成。

在另一个实施方案中，结合蛋白包含至少2个可变结构域CDR组。

所述至少2个可变结构域CDR组选自：

VH 5F9组和VL 5F9组；和

VH 8D1组和VL 8D1组

如根据本发明的另一个实施方案使用的结合蛋白进一步包含人受体构架。

所述人受体构架可以包含选自SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32和33的至少一个氨基酸序列。

本发明的结合蛋白可以包含选自下述组的至少一组构架序列：

（1）VH3-48组（Seq ID NO：15、16和17）

VH3-33组（SEQ ID NO：21、22和23）

VH3-23组（SEQ ID NO：24、25和26）

所述组各自与选自下述的进一步构架序列组合

JH3（SEQ ID NO:18），

JH4（SEQ ID NO:19），

JH6（SEQ ID NO:20）；

或

（2）选自下述组

A18组：（SEQ ID NO:27、28和29）

A17组：（SEQ ID NO:31、32和33）

所述组各自与选自JK2（SEQ ID NO:2）的进一步构架序列组合。

如上定义的结合蛋白包含选自SEQ ID NO:35、36、37、38、39、40、41、42和43的至少一个CDR移植的重链可变结构域；和/或选自SEQ ID NO:44、45和46的至少一个CDR移植的轻链可变结构域。

如根据本发明的另一个实施方案使用的结合蛋白包含2个可变结构域的组合，其中所述2个可变结构域具有选自下述的氨基酸序列：

SEQ ID NOs：35和44 ；36和44 ；37和44 ；38和44 ；39和44 ；40和44 ；41和44 ；42和44 ；43和44 ；

SEQ ID NOs：35和45 ；36和45 ；37和45 ；38和45 ；39和45 ；40和45 ；41和45 ；42和45 ；43和45 ；

SEQ ID NOs：35和46 ；36和46 ；37和46 ；38和46 ；39和46 ；40和46 ；41和46 ；42和46 ；43和46 ；

在本发明的另一个实施方案中，如根据本发明的使用的结合蛋白的所述人受体构架包含在关键残基上的至少一个构架区氨基酸置换，所述关键残基选自：

与CDR相邻的残基；

糖基化位点残基；

罕见残基；

能够与RGM表位相互作用的残基；

能够与CDR相互作用的残基；

经典残基；

在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；

在Vernier区带内的残基；

能够paraglutamate形成的N末端残基和

和在Chothia定义的可变重链CDR1和Kabat定义的第一个重链构架之间重叠的区域中的残基。

所述关键残基选自

（重链序列位置）：1、5、37、48、49、88、98

（轻链序列位置）：2、4、41、51

在一个特定实施方案中，如根据本发明的另一个实施方案使用的结合蛋白是或包含共有人可变结构域。

根据如根据本发明的另一个实施方案使用的结合蛋白的另一个实施方案，所述人受体构架包含至少一个构架区氨基酸置换，其中构架的氨基酸序列与所述人受体构架的序列至少65 ％如例如至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99 ％等同，并且包含与所述人受体构架等同的至少70个氨基酸残基，如例如至少75、80或85个残基。

根据一个特定实施方案，如根据本发明的另一个实施方案使用的结合蛋白包含至少一个构架突变的可变结构域，其具有选自下述的氨基酸序列：

SEQ ID NO:47、48、49、50；（VH结构域），和/或

选自下述的氨基酸序列

SEQ ID NO：51、52、53和54（VL结构域）

特别地，所述结合蛋白包含2个任选构架突变的可变结构域，其中所述2个可变结构域具有选自下述的氨基酸序列：

SEQ ID NOs:47和44 ；47和45 ；47和46 ；47和51 ；47和52 ；47和53 ；47和54 ；

SEQ ID NOs:48和44 ；48和45 ；48和46 ；48和51 ；48和52 ；48和53 ；48和54 ；

SEQ ID NOs:49和44 ；49和45 ；49和46 ；49和51 ；49和52 ；49和53 ；49和54 ；

SEQ ID NOs:50和44 ；50和45 ；50和46 ；50和51 ；50和52 ；50和53 ；50和54 ；

如本文描述的如根据本发明的另一个实施方案使用的结合蛋白能够结合选自RGM分子的至少一种靶。它们能够结合人RGM A和任选地人起源或源于食蟹猴、大鼠、鸡、青蛙和鱼的至少一种进一步的RGM分子。例如，它们可以另外结合大鼠RGM A、人RGM C和/或大鼠RGM C。

如根据本发明的另一个实施方案使用的结合蛋白能够调整，特别是能够中和或抑制选自如上定义的RGM分子的靶的生物学功能。

特别地，如根据本发明的另一个实施方案使用的结合蛋白调整，特别是抑制RGM与其受体中的至少一种结合的能力，如例如Neogenin和BMP如BMP-2和BMP-4。例如，所述结合蛋白调整特别是减少且特别是抑制下述相互作用中的至少一种：

人RGM A与人BMP-4的结合，

hRGM A与人Neogenin的结合，

hRGM C与人Neogenin的结合，

人RGM A与人BMP-2的结合。

如本文公开的，具有功能特征的不同组合且因而显示不同功能概况的结合蛋白也在本发明的范围内。此类概况的非限制性例子在下文列出：

例如，概况1由如通过本发明提供的抗体5F9及其在本文中描述的衍生物满足。

例如，概况2由如通过本发明提供的抗体8D1及其在本文中描述的衍生物满足。

如根据本发明的另一个实施方案使用的结合蛋白能够抑制RGM特别是RGM A的至少一种生物学活性，其中所述RGM A选自人、食蟹猴、大鼠、鸡、青蛙和鱼。

如根据本发明的另一个实施方案使用的结合蛋白具有下述动力学特征中的一种或多种：

（a）如表面等离振子共振测量的，选自下述的与所述靶的结合速率常数（k_on）：至少约10²M^-1s^-1；至少约10³M^-1s^-1；至少约10⁴M^-1s^-1；至少约10⁵M^-1s^-1；至少约10⁶M^-1s^-1和至少约10⁷M^-1s^-1；

（b）如表面等离振子共振测量的，选自下述的与所述靶的离开速率常数（k_off）：至多约10^-2s^-1，至多约10^-3s^-1；至多约10^-4s^-1；至多约10^-5s^-1；和至多约10^-6s^-1；或

（c）选自下述的与所述靶的解离常数（K_D）：至多约10^-7 M；至多约10^-8 M；至多约10^-9 M；至多约10^-10 M；至多约10^-11 M；至多约10^-12 M；和至多10^-13 M。

根据一个进一步方面，本发明利用包含上述结合蛋白的抗体构建体，所述抗体构建体进一步包含接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域。

所述抗体构建体或结合蛋白可以选自：免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F（ab'）₂、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、单结构域抗体、双抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、双重可变结构域免疫球蛋白和双特异性抗体。

在如根据本发明的另一个实施方案使用的抗体构建体中，所述结合蛋白包含选自下述的重链免疫球蛋白恒定结构域：

人IgM恒定结构域，

人IgG1恒定结构域，

人IgG2恒定结构域，

人IgG3恒定结构域，

人IgG4恒定结构域，

人IgE恒定结构域，

人IgD恒定结构域，

人IgA1恒定结构域，

人IgA2恒定结构域，

人IgY恒定结构域，和

相应突变的恒定结构域。

如根据本发明的另一个实施方案使用的抗体构建体包含具有选自下述的氨基酸序列的免疫球蛋白恒定结构域：SEQ ID NO：11、12、13和14。

根据另一个方面，本发明利用包含本文描述的抗体构建体的抗体缀合物，所述抗体缀合物进一步包含选自下述的试剂：免疫粘附分子、显像剂、治疗试剂和细胞毒剂，所述试剂各自与所述结合蛋白缀合，例如共价结合。

例如，所述试剂是选自下述的显像剂：放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。特别地，所述显像剂是选自下述的放射性标记：³H、¹⁴C、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho和¹⁵³Sm。

例如，所述试剂是选自下述的治疗或细胞毒剂：抗代谢药、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环、毒素和细胞凋亡剂。

根据另一个实施方案，如根据本发明的另一个实施方案使用的所述结合蛋白具有人糖基化模式。

此外，如根据本发明的另一个实施方案使用的结合蛋白、抗体构建体和抗体缀合物可以作为特别是保留生物学活性的晶体（以晶体形式）出现。所述晶体是无载体药物控制释放的晶体。考虑到所述晶体形式，结合蛋白、抗体构建体或抗体缀合物可以具有比相应可溶性配对物在体内更大的半衰期。

在另一个方面，本发明提供了编码如本文描述的结合蛋白氨基酸序列、抗体构建体氨基酸序列和抗体缀合物氨基酸序列的分离的核酸。

本发明的另一个实施方案还涉及包含如本文描述的分离的核酸的载体。特别地，载体选自pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ。

本发明的另一个实施方案还涉及包含此类载体的宿主细胞。特别地，所述宿主细胞是原核细胞，如例如大肠杆菌；或是真核细胞，并且可以选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。特别地，所述真核细胞是选自哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞的动物细胞。所述宿主细胞选自HEK细胞、CHO细胞、COS细胞和酵母细胞。酵母细胞可以是酿酒酵母，并且所述昆虫细胞可以是Sf9细胞。

本发明的另一个实施方案还提供了产生能够结合RGM的蛋白质的方法，其包括在足以产生能够结合RGM的结合蛋白的条件下在培养基中培养如本文定义的宿主细胞。

本发明的另一个实施方案还涉及根据所述方法产生的蛋白质。

另一个实施方案提供了用于释放结合蛋白的组合物，所述组合物包含

（a）制剂，其中所述制剂包含如本文定义的晶状产物蛋白质和成分；和

（b）至少一种聚合载体。

所述聚合载体可以是选自下述中的一种或多种的聚合物：聚（丙烯酸）、聚（氰基丙烯酸酯）、聚（氨基酸）、聚（酐）、聚（缩酚酸肽）、聚（酯）、聚（乳酸）、聚（乳酸-乙醇酸共聚物）或PLGA、聚（b-羟基丁酸酯）、聚（己内酯）、聚（二氧环己酮）；聚（乙二醇）、聚（（羟丙基）甲基丙烯酰胺、聚[（有机）磷腈]、聚（原酸酯）、聚（乙烯醇）、聚（乙烯吡咯烷酮）、马来酸酐-烷基乙烯醚共聚物、复合多元醇、白蛋白、海藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、其掺和物和共聚物。

所述成分可以选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、拉克替醇（lactitol）、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。

根据另一个方面，本发明提供了用于治疗哺乳动物的方法，其包括给哺乳动物施用有效量的如本文定义的组合物的步骤。

根据另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含产物（特别是如本文上述的结合蛋白、构建体或缀合物）和药学可接受的载体。

合适的药学可接受的载体可以充当用于增加所述结合蛋白的吸收或分散的佐剂。

例如，所述佐剂是透明质酸酶。

根据另一个实施方案，所述药剂进一步包含用于治疗其中RGM活性是有害的病症的至少一种另外的治疗试剂。例如，所述试剂选自：治疗试剂、显像剂、细胞毒剂、血管生成抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻断剂；粘附分子阻断剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；氨甲蝶呤；环孢素；雷帕霉素；FK506；可检测标记或报道分子；TNF拮抗剂；抗风湿剂；肌肉松弛剂、麻醉剂、非甾体抗炎药（NSAID）、止痛剂、麻醉药、镇静剂、局部麻醉药、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药剂、抗抑郁药、抗精神病药物、刺激物、哮喘药疗法、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子和细胞因子拮抗剂。

本发明还涉及用于就与RNFL变性相关的病症治疗受试者的方法，其包括单独或与其他治疗试剂组合施用本发明的产物（特别是如本文上述的结合蛋白、构建体或缀合物）的步骤。

所述病症特别包含选自下述的疾病：包括糖尿病视网膜病、缺血性视神经病、X染色体连锁视网膜劈裂症、药物造成的视神经病、视网膜营养不良、年龄相关的黄斑变性、特征在于视神经乳头玻璃疣的眼病、特征在于光感受器变性的遗传决定子的眼病、常染色体隐性遗传视锥视杆营养不良和线粒体病症伴视神经病。

关于如本文公开的SEQ ID NO:34的任何教导或参考类推应用于SEQ ID NO：9。

3. 结合hRGM A的多肽的用途

本申请的另一个实施方案包含分离的蛋白质或多肽的上文鉴定的用途，其与RGMA蛋白质的至少一个表位特异性结合。与RGM A蛋白质的至少一个表位特异性结合的分离的蛋白质或多肽能够抑制RGM A与其受体Neogenin和/或骨形态发生蛋白2和4（BMP-2、BMP-4）的结合，特别是与RGM A或其抗原结合部分或片段结合的抗体。

本发明的抗RGM A抗体显示出例如如通过本领域已知或下文描述的几种体外和体内测定中的任何一种评估的，减少或中和RGM A活性的高能力。

本申请特别利用针对RGM A的中和单克隆抗体，其选择性阻止RGM A与其受体Neogenin以及骨形态发生蛋白2和4（BMP-2、BMP-4）的结合，以及针对RGM A的中和单克隆抗体的生成，其选择性阻止RGM A与其共同受体骨形态发生蛋白2和4（BMP-2、BMP-4）的结合。

特别地，本申请的单克隆中和抗体是人抗体或人源化抗体。术语“人抗体”指具有对应于或衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体（例如，参见Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department ofHealth and Human Services，NIH公开号91-3242，1991）。然而，本申请的人抗体可以包括例如在CDRs且特别是CDR3中，不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，在体外通过随机或定点诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变）。

在各种实施方案中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。本申请的中和抗体的例子在本文中称为mAb5F9和mAb8D1及其功能抗体片段，并且与mAb5F9和mAb8D1具有等价特性，例如以低解离动力学和高中和能力与RGM A结合的高亲和力的其他抗体和功能抗体片段，预期作为本发明的部分。本申请的抗RGM A抗体对于免疫原性RGM A多肽或其片段的结合亲和力和解离速率可以通过本领域已知的任何方法进行测定。例如，结合亲和力可以通过竞争性ELISAs、c RIAs、BIAcore或KinExA技术进行测量。解离速率也可以通过BIAcore或KinExA技术进行测量。结合亲和力和解离速率使用例如BIAcore通过表面等离振子共振进行测量。

本申请的单克隆抗体之一，mAb5F9抗体与这样的序列具有至少90％氨基酸序列同一性，所述序列包括包含SEQ ID NO:9或34的序列的重链可变区（VH区）和包含SEQ ID NO:10的序列的轻链可变区（VL区）。

还预期与本申请的RGM A相互作用的分离的单克隆抗体可以是糖基化结合蛋白，其中抗体或其抗原结合部分包含一个或多个碳水化合物残基。新生体内蛋白质生产可以经历进一步加工，称为翻译后修饰。特别地，可以酶促加入糖（糖基）残基，这是称为糖基化的过程。具有共价连接的寡糖侧链的所得到的蛋白质称为糖基化蛋白质或糖蛋白。蛋白质糖基化取决于目的蛋白质的氨基酸序列，以及蛋白质在其中表达的宿主细胞。不同生物可以产生不同的糖基化酶（例如糖基转移酶和糖苷酶），且具有可获得的不同底物（核苷酸糖）。由于此类因素，取决于特定蛋白质在其中表达的宿主系统，蛋白质糖基化模式和糖基残基的组成可以不同。在本发明中有用的糖基残基可以包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰氨基葡萄糖和唾液酸。特别地，糖基化结合蛋白包含糖基残基，从而使得糖基化模式是人的。

如根据本发明使用的抗体包含重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、IgY或IgD恒定区。此外，抗体可以包含轻链恒定区，为κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。抗体包含κ轻链恒定区。可替代地，抗体部分可以是例如Fab片段或单链Fv片段。在Fc部分中替换氨基酸残基以改变抗体的效应子功能是本领域已知的（Winter等人美国专利号5,648,260；5,624,821）。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。在某些情况下，这些效应子功能对于治疗抗体是希望的，但在其他情况下可能是不需要的或甚至有害的，这取决于治疗目的。特定人IgG同种型特别是IgG1和IgG3，分别经由与Fcγ Rs和补体C1q结合介导ADCC和CDC。新生儿Fc受体（FcRn）是决定抗体的循环半衰期的关键组分。在另外一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在抗体的恒定区例如抗体的Fc区中被替换，从而使得抗体的效应子功能被改变。

3. 抗hRGM A抗体的生成

3.1. 概述

本发明的抗体可以通过合适宿主（例如脊椎动物，包括人、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛、马、爬行类、鱼类、两栖类，以及在鸟类、爬行类和鱼类的卵中）的免疫接种生成。为了生成本申请的抗体，宿主用本发明的免疫原性RGM A多肽或其片段进行免疫接种。术语“免疫接种”在本文中指将抗原呈递给免疫储库的过程，无论储库存在于天然遗传上未改变的生物还是转基因生物中，包括修饰为展示人工人免疫储库的那些。类似地，“免疫原性制剂”是含有将增强抗原的免疫原性的佐剂或其他添加剂的抗原制剂。

动物的免疫接种可以通过本领域已知的任何方法来完成。参见例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Press，1990。用于免疫接种非人动物例如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛和马的方法是本领域众所周知的。参见例如，Harlow和Lane以及美国专利号5,994,619。在一个特定实施方案中，RGM A抗原与佐剂一起施用，以刺激免疫应答。此类佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI（胞壁酰二肽）或ISCOM（免疫刺激复合物）。此类佐剂可以通过将多肽隔离在局部沉积中保护其不受快速分散，或它们可以含有刺激宿主以分泌对于巨噬细胞和免疫系统的其他组分是趋化性的因子的物质。特别地，如果待施用多肽，那么免疫接种方案将涉及经过数周展开的多肽的2次或更多次施用。

考虑动物宿主用与完整或破裂细胞的细胞膜结合的抗原进行免疫接种，并且本申请的抗体通过与本发明的免疫原性多肽的结合得到鉴定。在用抗原免疫接种动物宿主后，可以从动物中获得抗体。通过放血或处死动物从动物中获得含抗体血清。可以使用得自动物时的血清，可以从血清中获得免疫球蛋白馏分，或可以从血清中纯化抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，从而具有特性的异质阵列。

3.2 使用杂交瘤技术的抗RGM A单克隆抗体

使用本领域已知的广泛多样的技术可以制备单克隆抗体，包括杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或其组合的使用。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术产生，包括本领域已知并且例如在Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,（Cold Spring HarborLaboratory Press，第2版1988）；Hammerling等人，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563–681（Elsevier，N.Y.，1981）（所述参考文献整体引入作为参考）中教导的那些。如本文使用的，术语“单克隆抗体”并不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指衍生自单个克隆包括任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体，并且不指通过其产生它的方法。

使用杂交瘤技术用于产生和筛选特异性抗体的方法是本领域常规和众所周知的。在一个实施方案中，本发明提供了生成单克隆抗体的方法以及通过该方法产生的抗体，所述方法包括培养分泌本发明的抗体的杂交瘤细胞，其中杂交瘤通过下述生成：使从用本发明的抗原免疫接种的小鼠中分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，且随后在杂交瘤克隆中筛选起因于融合的杂交瘤，所述杂交瘤克隆分泌能够结合本发明的多肽的抗体。简言之，小鼠可以用RGM A抗原进行免疫接种。在另一个实施方案中，RGM A抗原与佐剂一起施用，以刺激免疫应答。此类佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI（胞壁酰二肽）或ISCOM（免疫刺激复合物）。此类佐剂可以通过将多肽隔离在局部沉积中保护其不受快速分散，或它们可以含有刺激宿主以分泌对于巨噬细胞和免疫系统的其他组分是趋化性的因子的物质。如果待施用多肽，那么免疫接种方案将涉及经过数周展开的多肽的2次或更多次施用。

一旦检测到免疫应答，例如在小鼠血清中检测到对于抗原RGM A特异性的抗体，就收获小鼠脾脏且分离脾细胞。随后通过众所周知的技术使脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞融合，例如来自从ATCC可获得的细胞系SP20的细胞。通过有限稀释选择且克隆杂交瘤。随后通过本领域已知的方法就分泌能够结合RGM A的抗体的细胞测定杂交瘤克隆。通过用阳性杂交瘤克隆免疫接种小鼠可以生成一般含有高水平抗体的腹水。

在另一个实施方案中，抗体产生永生化杂交瘤可以由免疫接种的动物进行制备。如本领域众所周知的，在免疫接种后，处死动物并且使脾B细胞与永生化骨髓瘤细胞融合。参见例如，Harlow和Lane，同上。在另一个实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽（非分泌性细胞系）。在融合和抗生素选择后，使用RGM A或其部分筛选杂交瘤或表达RGM A的细胞。在另一个实施方案中，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）或放射免疫测定（RIA）执行最初筛选，ELISA。ELISA筛选的例子在引入本文作为参考的WO 00/37504中提供。

如下文进一步讨论的，对抗RGM A抗体产生杂交瘤进行选择，克隆且就希望的特征进一步筛选，包括强壮的杂交瘤生长、高抗体产生和希望的抗体特征。杂交瘤可以在体内在同基因动物中、在缺乏免疫系统的动物例如裸鼠中或在体外细胞培养中进行培养且扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法是本领域普通技术人员众所周知的。

在一个特定实施方案中，杂交瘤是如上所述的小鼠杂交瘤。在另一个特定实施方案中，杂交瘤在非人、非小鼠物种中产生，例如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤与表达抗RGM A抗体的人细胞融合。

识别特异性表位的抗体片段可以通过已知技术生成。例如，本发明的Fab和F（ab'）₂片段可以通过免疫球蛋白分子的蛋白酶解切割产生，使用酶例如木瓜蛋白酶（以产生Fab片段）或胃蛋白酶（以产生F（ab'）₂片段）。F（ab'）₂片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。

3.3 使用SLAM的抗RGM A单克隆抗体

在本发明的另一个方面，使用本领域称为选择淋巴细胞抗体法（SLAM）的程序，如美国专利号5,627,052，PCT公开WO 92/02551和Babcock，J.S.等人（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848中所述的，由单一、分离的淋巴细胞生成重组抗体。在这种方法中，使用抗原特异性溶血空斑测定筛选分泌目的抗体的单一细胞，例如衍生自上述免疫接种动物中的任何一种的淋巴细胞，其中使用接头例如生物素使抗原RGM A、RGM A的亚单位或其片段与绵羊红细胞偶联，并且用于鉴定分泌对于RGM A具有特异性的抗体的单一细胞。在鉴定分泌抗体的目的细胞后，通过逆转录酶-PCR从细胞中取得重和轻链可变区CDRs，并且随后可以在合适免疫球蛋白恒定区（例如人恒定区）的背景中，在哺乳动物宿主细胞例如COS或CHO细胞中表达这些可变区。用衍生自体内选择的淋巴细胞、扩增的免疫球蛋白序列转染的宿主细胞随后可以经历在体外的进一步分析和选择，例如通过淘选转染的细胞以分离表达针对RGM A的抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列进一步可以在体外操作，例如通过体外亲和力成熟法，例如PCT公开WO 97/29131和PCT公开WO 00/56772中所述的那些。

3.4 使用转基因动物的抗RGM A单克隆抗体

在本发明的另一个实施方案中，通过用RGM A抗原免疫接种包含某些或全部人免疫球蛋白基因座的非人动物产生抗体。在一个特定实施方案中，非人动物是XENOMOUSE转基因小鼠，包含人免疫球蛋白基因座的大片段且在小鼠抗体产生中缺陷的工程改造的小鼠品系。参见例如，Green等人Nature Genetics 7:13-21（1994）和美国专利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。还参见1991年7月25日公开的WO 91/10741，1994年2月3日公开的WO 94/02602，1996年10月31日公开的WO96/34096和WO 96/33735，1998年4月23日公开的WO 98/16654，1998年6月11日公开的WO98/24893，1998年11月12日公开的WO 98/50433，1999年9月10日公开的WO 99/45031，1999年10月21日公开的WO 99/53049，2000年2月24日公开的WO 00 09560，和2000年6月29日公开的WO 00/037504。XENOMOUSE转基因小鼠产生全人抗体的成年样人储库，并且生成抗原特异性人Mabs。通过巨碱基大小的种系配置YAC片段引入人重链基因座和x轻链基因座，XENOMOUSE转基因小鼠含有约80％人抗体储库。参见Mendez等人，Nature Genetics 15：146–156（1997），Green和Jakobovits J. Exp. Med. 188：483–495（1998），其公开内容在此引入作为参考。

3.5 使用重组抗体文库的抗RGM A单克隆抗体

体外方法也可以用于制备本发明的抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有所需结合特异性的抗体。用于重组抗体文库的此类筛选的方法是本领域众所周知的，并且包括在例如下述中所述的方法：Ladner等人美国专利号5,223,409；Kang等人PCT公开号WO 92/18619；Dower等人PCT公开号WO 91/17271；Winter等人PCT公开号WO 92/20791；Markland等人PCT公开号WO 92/15679；Breitling等人PCT公开号WO 93/01288；McCafferty等人PCT公开号WO 92/01047；Garrard等人PCT公开号WO 92/09690；Fuchs等人（1991）Bio/ Technology 9：1370–1372；Hay等人（1992）Hum Antibod Hybridomas 3：81–85；Huse等人（1989）Science 246：1275–1281；McCafferty等人，Nature（1990）348：552–554；Griffiths等人（1993）EMBO J 12：725–734；Hawkins等人（1992）J Mol Biol 226：889–896；Clackson等人（1991）Nature 352：624–628；Gram等人（1992）PNAS 89：3576–3580；Garrad等人（1991）Bio/ Technology 9：1373–1377；Hoogenboom等人（1991）Nuc Acid Res 19：4133–4137；和Barbas等人（1991）PNAS 88：7978–7982，美国专利申请公开20030186374和PCT公开号WO 97/29131，其各自的内容引入本文作为参考。

重组抗体文库可以来自用RGM A或RGM A的部分免疫接种的受试者。可替代地，重组抗体文库可以来自首次用于实验的受试者，即未用RGM A免疫接种的受试者，例如来自未用人RGM A免疫接种的人受试者的人抗体文库。本发明的抗体通过用包含人RGM A的肽筛选重组抗体文库进行选择，以从而选择识别RGM A的那些抗体。用于进行此类筛选和选择的方法是本领域众所周知的，例如在先前段落中的参考文献中所述的。为了选择对于hRGM A具有特定结合亲和力的本发明的抗体，例如以特定k_off速率常数与人RGM A解离的抗体，领域已知的表面等离振子共振法可以用于选择具有所需k_off速率常数的抗体。为了选择对于hRGM A具有特定中和活性的本发明的抗体，例如具有特定IC₅₀的抗体，可以使用本领域已知用于评估hRGM A活性抑制的标准方法。

在一个方面，本发明涉及结合人RGM A的抗体或其抗原结合部分。特别地，抗体是中和抗体。在各种实施方案中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。

例如，本发明的抗体还可以使用本领域已知的多种噬菌体展示法生成。在噬菌体展示法中，在携带编码其的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上展示功能抗体结构域。特别地，此类噬菌体可以用于展示由储库或组合抗体文库（例如人或鼠）表达的抗原结合结构域。表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原进行选择或鉴定，例如使用标记抗原或与固体表面或珠结合或捕获的抗原。在这些方法中使用的噬菌体一般是丝状噬菌体，包括由具有与噬菌体基因III或基因VIII蛋白质重组融合的Fab、Fv或二硫化物稳定的Fv抗体结构域的噬菌体表达的fd和M13结合结构域。可以用于制备本发明的抗体的噬菌体展示法的例子包括下述中公开的那些：Brinkman等人，J. Immunol. Methods 182：41–50（1995）；Ames等人，J. Immunol. Methods 184：177–186（1995）；Kettleborough等人，Eur.J. Immunol. 24：952–958（1994）；Persic等人，Gene 187 9–18（1997）；Burton等人，Advances in Immunology 57：191–280（1994）；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT 公开WO90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780，225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；其各自整体引入本文作为参考。

如上述参考文献中所述的，在噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区且用于生成完整抗体，包括人抗体或任何其他所需抗原结合片段，并且在任何所需宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如如下文详细描述的。例如，使用本领域已知的方法，还可以采用重组产生Fab、Fab'和F（ab'）₂片段的技术，例如公开于PCT公开WO 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques 12（6）：864–869（1992）；和Sawai等人，AJRI 34：26–34（1995）；和Better等人，Science 240：1041–1043（1988）中的那些（所述参考文献整体引入本文作为参考）。可以用于产生单链Fvs和抗体的技术的例子包括美国专利4,946,778和5,258，498；Huston等人，Methods in Enzymology 203：46–88（1991）；Shu等人，PNAS 90：7995–7999（1993）；和Skerra等人，Science 240：1038–1040（1988）中所述的那些。

关于通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的可替代方案，本领域已知用于筛选大型组合文库的其他方法可以应用于鉴定本发明的双重特异性抗体。一类可替代表达系统是其中重组抗体文库表示为RNA-蛋白质融合物的系统，如由Szostak和Roberts在PCT公开号WO98/31700中以及在Roberts，R.W.和Szostak，J.W.（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：12297–12302中所述的。在这个系统中，通过在其3'末端携带嘌呤霉素，肽基受体抗生素的合成mRNAs的体外翻译，产生在mRNA和其编码的肽或蛋白质之间的共价融合物。因此，基于所编码肽或蛋白质例如抗体或其部分的特性，例如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合，可以从mRNAs的复杂混合物（例如组合文库）中富集特异性mRNA。由此类文库筛选回收的编码抗体或其部分的核酸序列可以通过如上所述的重组方法进行表达（例如在哺乳动物宿主细胞中），并且此外如上所述，通过其中突变已引入最初选择的一种或多种序列内的mRNA-肽融合物的另外筛选循环，或通过用于重组抗体的体外亲和力成熟的其他方法，可以实施进一步亲和力成熟。

在另一种方法中，本发明的抗体还可以使用本领域已知的酵母展示法生成。在酵母展示法中，遗传方法用于将抗体结构域与酵母细胞壁栓系且在酵母表面上展示它们。特别地，此类酵母可以用于展示由储库或组合抗体文库（例如人或鼠）表达的抗原结合结构域。可以用于制备本发明的抗体的酵母展示法的例子包括Wittrup等人美国专利号6,699,658公开的那些，其引入本文作为参考。

4. 本发明的特定重组RGM A抗体的生产

本发明的抗体可以通过本领域已知的许多技术中的任何产生。例如，从宿主细胞表达，其中通过标准技术将编码重和轻链的一种或多种表达载体转染到宿主细胞内。多种形式的术语“转染”意欲涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但在真核细胞中表达抗体是有利的，并且在哺乳动物宿主细胞中是最有利的，因为此类真核细胞（和特别地哺乳动物细胞）比原核细胞更可能装配且分泌正确折叠和免疫活性的抗体。

用于表达本发明的重组抗体的特定哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢（CHO细胞）（包括Urlaub和Chasin,（1980）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216–4220中所述的dhfr- CHO细胞，与例如如R.J. Kaufman和P.A. Sharp（1982）Mol. Biol. 159：601–621中所述的DHFR可选标记一起使用）、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，通过将宿主细胞培养一段时间产生抗体，所述时间足以允许抗体在宿主细胞中表达，更具体而言，抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内。抗体可以使用标准蛋白质纯化法从培养基中回收。

宿主细胞还可以用于产生功能抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。应当理解关于上述程序的变动在本发明的范围内。例如，可能希望用编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可以用于去除编码轻和重链中任一或两者的某些或全部DNA，其不是与目的抗原结合所需的。由此类截短的DNA分子表达的分子也由本发明的抗体涵盖。此外，通过经由标准化学交联法交联本发明的抗体与第二种抗体可以产生双功能抗体，其中一条重和一条轻链是本发明的抗体，并且另一条重和轻链是对于除目的抗原外的抗原特异性的。

在用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的特定系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr- CHO细胞内。在重组表达载体内，抗体重和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选的转化体宿主细胞以允许抗体重和轻链的表达，并且从培养基中回收完整抗体。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞且从培养基中回收抗体。再进一步地，本发明提供了合成本发明的重组抗体的方法，其通过在合适培养基中培养本发明的宿主细胞，直至合成本发明的重组抗体。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组抗体。

4.1 抗RGM A抗体

表5是本发明的特定抗hRGM A抗体的VH和VL区的氨基酸序列列表。

表5：抗hRGM A抗体5F9和8D1的VH和VL区的氨基酸序列列表

前述分离的抗RGM A抗体CDR序列建立了依照本发明分离的RGM A结合蛋白的新家族。为了生成且选择具有就hRGM A而言的特定RGM A结合和/或中和活性的本发明CDR，可以使用本领域已知用于生成本发明的结合蛋白且评估那些结合蛋白的RGM A结合和/或中和特征的标准方法，包括但不限于本文具体描述的那些。

4.2 抗RGM A嵌合抗体

嵌合抗体是其中抗体的不同部分衍生自不同动物物种的分子，例如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison，Science 229：1202（1985）；Oi等人，BioTechniques 4：214（1986）；Gillies等人，（1989）J. Immunol. Methods 125：191–202；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397，其整体引入本文作为参考。此外，可以使用开发用于产生“嵌合抗体”的技术（Morrison等人，1984，Proc. Natl. Acad. Sci. 81：851–855；Neuberger等人，1984，Nature 312：604–608；Takeda等人，1985，Nature 314：452–454，其整体引入本文作为参考），其通过剪接来自具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因连同来自具有合适生物学活性的人抗体分子的基因进行。

在一个实施方案中，通过用人IgG1恒定区替换本文描述的鼠单克隆抗人RGM A抗体的重链恒定区，产生本发明的嵌合抗体。

4.3 抗RGM A CDR移植抗体

本发明的CDR移植抗体包含来自人抗体的重和轻链可变区序列，其中V_H和/或V_L的一个或多个CDR区由本发明的非人如例如鼠抗体的CDR序列替换。来自任何人抗体的构架序列可以充当用于CDR移植的模板。然而，在此类构架上的直链替换通常导致对于抗原的结合亲和力的某些丧失。人抗体与最初鼠抗体越同源，组合鼠CDRs与人构架在CDRs中引入可以减少亲和力的失真的可能性越小。因此，选择为替换远离CDRs的鼠可变构架的人可变构架与鼠抗体可变区构架具有至少65％序列同一性是特别有利的。远离CDRs的人和鼠可变区具有至少70％序列同一性是更特别有利的。远离CDRs的人和鼠可变区具有至少75％序列同一性是更加特别有利的。远离CDRs的人和鼠可变区具有至少80％序列同一性是最特别有利的。用于产生CDR移植抗体的方法是本领域已知的（Jones等人，Nature 321：522–525（1986）；美国专利号5,225,539）。在一个具体实施方案中，本发明提供了具有如表6中所述的V_H和/或V_L链的CDR移植抗体。

表6：CDR移植抗体

衍生自mAb 5F9的CDR序列以粗体字母陈述。还通过陈述相应SEQ ID Nos参考特异性构架序列（FR1至FR4）（还参见表3和4）

4.4 抗RGM A人源化抗体

人源化抗体是来自结合所需抗原的非人物种抗体的抗体分子，其具有来自非人物种的一个或多个互补决定区（CDRs）和来自人免疫球蛋白分子的构架区。已知人Ig序列公开于例如www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez- /query.fcgi；www.atcc.org/phage/hdb.html；www.sciquest.com/；www.abcam.com/；www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html；www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html；www.whfreeman.com/immunology/CH- 05/kuby05.htm；www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html；www.antibodyresource.com/；mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno- logy.html.www.immunologylink.com/；pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html；www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/；www.pebio.com/pa/340913/340913.html- ；www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito- /Elisa.html；www.biodesign.com/table.asp；www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html；www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html；www.isac-net.org/sites_geo.html；aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP- Start.html；baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html；www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/；www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/INTRO.html；www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；imgt.cnusc.fr:8104/；www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html；antibody.bath.ac.uk/；abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem- inar/Slide01.html；www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/；www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h- umanisation/TAHHP.html；www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html；www.jerini.de/fr roducts.htm；www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，U.S. Dept. Health（1983），其整体引入本文作为参考。此类输入序列可以用于减少免疫原性或减少、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、离开速率、亲合力、特异性、半衰期或任何其他合适特征，如本领域已知的。

在人构架区中的构架残基可以由来自CDR供体抗体的相应残基置换，以改变特别是改善抗原结合。这些构架置换通过本领域众所周知的方法进行鉴定，例如通过CDR和构架残基的相互作用的建模以鉴定对于抗原结合重要的构架残基，和序列比较以鉴定在特定位置上的罕见构架残基。（参见例如，Queen等人，美国专利号5,585,089；Riechmann等人，Nature 332：323（1988），其整体引入本文作为参考）。三维免疫球蛋白模型是通常可获得且是本领域技术人员熟悉的。举例说明且展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以选择FR残基且与共有和输入序列组合，从而使得达到所需抗体特征，例如对于一种或多种靶抗原的亲和力增加。一般而言，CDR残基直接且最基本地涉及影响抗原结合。抗体可以使用本领域已知的多种技术人源化，例如但不限于下述中所述的那些：Jones等人，Nature 321：522（1986）；Verhoeyen等人，Science 239：1534（1988）），Sims等人，J. Immunol. 151：2296（1993）；Chothia和Lesk，J. Mol. Biol. 196：901（1987），Carter等人，Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 89：4285（1992）；Presta等人，J. Immunol. 151：2623（1993），Padlan，Molecular Immunology 28（4/5）：489–498（1991）；Studnicka等人，Protein Engineering7（6）：805–814（1994）；Roguska.等人，PNAS 91：969–973（1994）；PCT公开WO 91/09967，PCT/：US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755；WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP 229246、EP 592,106；EP519,596、EP 239,400、美国专利号5,565,332、5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5814476、5763192、5723323、5,766886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539；4,816,567，其各自完全引入本文作为参考，包括其中引用的参考文献。

5. 本发明的抗体的进一步实施方案

5.1 融合抗体和免疫粘附素

本申请还描述了可以制备的融合抗体或免疫粘附素，其包含与另一种多肽连接的本申请的RGM A抗体的全部或部分。在某些实施方案中，仅RGM A抗体的可变区与多肽连接。在其他实施方案中，本申请的RGM A抗体的VH结构域与第一种多肽连接，而抗体的VL结构域与第二种多肽连接，所述第二种多肽以这样的方式与第一种多肽结合，从而使得允许VH和VL结构域彼此相互作用，以形成抗体结合位点。在其他实施方案中，VH结构域通过接头与VL结构域分开，所述接头允许VH和VL结构域彼此相互作用（参见下文在单链抗体下）。VH-接头-VL抗体随后与目的多肽连接。融合抗体用于将多肽导向表达RGM A的细胞或组织。目的多肽可以是治疗试剂例如毒素，或可以是诊断试剂例如酶；其可以是容易显现的，例如辣根过氧化物酶。此外，可以产生其中2种（或更多种）单链抗体彼此连接的融合抗体。如果希望产生在单条多肽链上的二价或多价抗体，或如果希望产生双特异性抗体，那么这是有用的。

一个实施方案提供了标记的结合蛋白，其中本申请的抗体或抗体部分与另一种功能分子（例如另一种肽或蛋白质）衍生或连接。例如，通过功能连接本申请的抗体或抗体部分（通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式）与一种或多种其他分子实体可以衍生本申请的标记的结合蛋白，所述其他分子实体例如核酸、另一种抗体（例如双特异性抗体或双抗体）、可检测试剂、细胞毒剂、药物制剂、和/或蛋白质或肽，其可以介导抗体或抗体部分与另一种分子（例如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标记）的结合。

本申请的抗体或抗体部分可以由其衍生的有用的可检测试剂包括荧光化合物。示例性荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。抗体还可以由可检测酶例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等衍生。当抗体由可检测酶衍生时，它通过加入酶用于产生可检测反应产物的另外试剂进行检测。例如，当存在可检测试剂辣根过氧化物酶时，过氧化氢和二氨基联苯胺的添加导致可检测的显色反应产物。抗体还可以由核酸、生物素衍生，并且通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的间接测量进行检测。

5.2 单链抗体

本申请包括结合本发明的免疫原性RGM A的单链抗体（scFv）。为了产生scFv，VH和V编码DNA与编码弹性接头例如编码氨基酸序列（Gly4-Ser）的DNA可操作地连接，从而使得VH和VL序列可以作为邻接单链蛋白质表达，其中VL和VH区通过弹性接头连接（参见例如，Bird等人（1988）Science 242：423–42 6；Huston等人（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA85：5879–5883；McCafferty等人，30 Nature（1990）34 8：552–554）。如果仅使用单个VH和VL，那么单链抗体可以是单价的，如果使用2个VH和VL，那么是二价的，或如果使用超过2个VH和VL，那么是多价的。经由接头偶联的所述scFv片段中的2个称为“双抗体”，所述形式也由本发明涵盖。

5.3 双特异性抗体

本申请进一步包括双特异性抗体或其抗原结合片段，其中一种特异性是对于本申请的免疫原性RGM A多肽的。例如，可以生成双特异性抗体，其通过一个结合结构域与本发明的免疫原性RGM A多肽特异性结合且通过第二个结合结构域与第二种分子结合。此外，可以生成含有超过一个VH和VL的单链抗体，其特异性与本发明的免疫原性多肽结合和与另一种分子结合，所述另一种分子与减弱髓磷脂介导的生长锥坍塌以及神经突长出和萌芽的抑制相关。此类双特异性抗体可以使用众所周知的技术生成，例如Fanger等人ImmunolMethods 4：72-81（1994）和Wright和Harris，20（同上）。

在某些实施方案中，使用来自本发明抗体的一个或多个可变区制备双特异性抗体。在另一个实施方案中，使用来自所述抗体的一个或多个CDR区制备双特异性抗体。

5.4 衍生和标记的抗体

本申请的抗体或其抗原结合片段可以与另一种分子（例如另一种肽或蛋白质）衍生或连接。一般而言，抗体或抗原结合片段这样衍生，从而使得与本发明的免疫原性多肽的结合不受衍生或标记的不利影响。

例如，本申请的抗体或抗体部分可以与一种或多种其他分子实体功能连接（通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式），所述其他分子实体例如另一种抗体（例如双特异性抗体或双抗体）、可检测试剂、细胞毒剂、药物制剂和/或蛋白质或肽，其可以介导抗体或抗原结合片段与另一种分子（例如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标记）的结合。再进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其他或不同蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的更大免疫粘附分子的部分。此类免疫粘附分子的例子包括链霉亲和素核心区的使用，以制备四聚scFv分子（Kipriyanov等人（1995）HumanAntibodies and Hybridomas 6:93-101），和半胱氨酸残基、标记肽和C末端多组氨酸标记的使用，以制备二价和生物素化的scFv分子（Kipriyanov等人（1994）MolecularImmunology 31:1047-1058）。抗体部分例如Fab和F（ab'）₂片段可以使用常规技术由完整抗体制备，例如完整抗体分别地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得。

通过交联2种或更多种抗体（具有相同类型或不同类型，例如以产生双特异性抗体）可以产生衍生化抗体。合适的交联剂包括其为具有由合适间隔物分开的2个不同反应基团的异双功能（例如间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯）或同双功能（例如二琥珀酰亚胺辛二酸酯）的那些。此类接头从Pierce Chemical Company，Rockford，Ill可获得。

衍生抗体还可以是标记抗体。例如，本发明的抗体或抗体部分可以由其衍生的检测试剂是荧光化合物，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系磷光体等。抗体还可以用对于检测有用的酶进行标记，例如辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。在由可检测酶标记的实施方案中，抗体通过加入酶用于产生可检测反应产物的另外试剂进行检测。例如，辣根过氧化物酶与过氧化氢和二氨基联苯胺。抗体还可以用生物素进行标记，并且通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的间接测量进行检测。抗体还可以用由二次报道分子（例如亮氨酸拉链对序列、关于二次抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签）识别的预定多肽表位进行标记。RGM A抗体或其抗原片段还可以用放射性标记的氨基酸进行标记。放射性标记可以用于诊断和治疗用途。放射性标记的RGM A抗体可以例如在诊断上用于测定受试者中的RGM A受体水平。进一步地，放射性标记的RGM A抗体可以在治疗上用于治疗脊髓损伤。

用于多肽的标记的例子包括但不限于下述放射性同位素或放射性核素¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、^lllIn、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho、¹⁵³Sm。RGM A抗体或其抗原片段还可以用化学基团进行衍生，所述化学基团例如聚乙二醇（PEG）、甲基或乙基、或碳水化合物基团。这些基团可以用于改善抗体的生物学特征，例如增加血清半衰期或增加组织结合。此外，用于多肽的标记可以包括核酸，例如DNA用于通过PCR检测，或增强基因表达，或siRNA以抑制在具有RGM A的细胞或组织中的基因表达。

RGM A抗体的类别和亚类可以通过本领域已知的任何方法进行测定。一般而言，抗体的类别和亚类可以使用对于抗体的特定类别和亚类特异性的抗体进行测定。此类抗体是商购可得的。类别和亚类可以通过ELISA、蛋白质印迹以及其他技术进行测定。可替代地，类别和亚类可以通过下述进行测定：测序抗体重和/或轻链的恒定结构域的全部或部分，比较其氨基酸序列与免疫球蛋白的多个类别和亚类的已知氨基酸序列，且测定抗体的类别和亚类。

5.5 双重可变结构域免疫球蛋白

如本文使用的，双重可变结构域（DVD）结合蛋白或免疫球蛋白是结合蛋白，其包含2个或更多个抗原结合位点并且是多价结合蛋白，如例如二价和四价的。术语“多价结合蛋白”在本说明书中用于指示包含2个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。多价结合蛋白特别地工程改造为具有2个或更多个抗原结合位点，并且一般不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”指能够结合2种或更多种相关或无关靶的结合蛋白。此类DVDs可以是单特异性的，即能够结合一种抗原，或多特异性的，即能够结合2种或更多种抗原。包含2条重链DVD多肽和2条轻链DVD多肽的DVD结合蛋白称为DVD Ig。每一半DVD Ig包含重链DVD多肽和轻链DVD多肽，和2个抗原结合位点。每个结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，具有涉及抗原结合的总共6个CDRs/抗原结合位点。DVD结合蛋白和制备DVD结合蛋白的方法公开于美国专利申请号11/507,050中，且引入本文作为参考。预期本发明包括包含能够结合RGMA的结合蛋白的DVD结合蛋白。特别地，DVD结合蛋白能够结合RGM A和第二种靶。第二种靶选自抗炎MAB活性（IL-1、IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-17、IL-18、IL-23、TNF α/β、IFN-β、γ、LIF、OSM、CNTF、PF-4、血小板碱性蛋白（PBP）、NAP-2、β-TG、MIP-1、MCP2/3、RANTES、淋巴趋化因子），转运介导蛋白质（胰岛素受体、转铁蛋白受体、凝血酶受体、瘦素受体、LDL受体），其他神经再生的MABs（NgR、Lingo、p75、CSPG（例如NG-2、神经粘蛋白、短蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖）、透明质酸、mAG、肌腱蛋白、NI-35、NI-250、IMP、基底膜聚糖、神经粘蛋白、磷酸粘蛋白、nogo-A、OMGP、Sema4D、Sema 3A、ephrin B3、ephrin A2、ephrin A5、MAG、EphA4、plexin B1、TROY、wnts、ryk rec.、BMP-2、BMP-4、BMP-7），神经保护MAB活性（EGF、EGFR、Sema 3），抗淀粉样蛋白βMABs（例如m266、3D6（bapineuzumab）、抗球聚体MABs 7C6），CNS定位受体和转运蛋白（血清素受体、多巴胺受体、DAT、Asc-1、GlyT1）。

5.6 双重特异性抗体

本申请还描述了“双重特异性抗体”技术。双重特异性抗体可以充当激动剂、拮抗剂或以不同组合的两者。双重特异性抗体是如WO2008082651中例示的，其中VH链与第一种抗原结合并且VL链与另一种抗原结合的抗体。

5.7 晶状抗体

本申请的另一个实施方案提供了晶状结合蛋白。如本文使用的，术语“晶状的”指以晶体形式存在的抗体或其抗原结合部分。晶体是物质的一种固态形式，这不同于其他形式例如无定形固态或液体晶态。晶体由原子、离子、分子（例如蛋白质例如抗体）或分子装配（例如抗原/抗体复合物）的常规、重复、三维阵列组成。这些三维阵列根据本领域充分了解的特定数学关系排列。在晶体中重复的基本单位或构件块称为不对称单位。符合给定、充分定义的晶体学对称性的不对称单位在排列中的重复提供晶体的“晶胞”。在所有3个尺度中晶胞通过规则平移的重复提供了晶体。参见Giege，R.和Ducruix，A. Barrett，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，a Practical Approach，第2版，第20页，1–16，Oxford University Press，New York，New York,（1999）.。

特别地，本申请描述了如本文公开的完整RGM A抗体及其片段的晶体，和包含此类晶体的制剂和组合物。在一个实施方案中，晶状结合蛋白具有比结合蛋白的可溶性配对物在体内更大的半衰期。在另一个实施方案中，结合蛋白在结晶后保留生物学活性。

本发明的晶状结合蛋白可以根据本领域已知和如引入本文作为参考的WO02072636中公开的方法产生。

5.8 糖基化抗体

本发明的另一个实施方案提供了糖基化结合蛋白，其中抗体或其抗原结合部分包含一个或多个碳水化合物残基。新生体内蛋白质生产可以经历进一步加工，称为翻译后修饰。特别地，可以酶促加入糖（糖基）残基，这是称为糖基化的过程。具有共价连接的寡糖侧链的所得到的蛋白质称为糖基化蛋白质或糖蛋白。抗体是在Fc结构域中具有一个或多个碳水化合物残基以及可变结构域的糖蛋白。在Fc结构域中的碳水化合物残基对Fc结构域的效应子功能具有重要作用，对抗体的抗原结合或半衰期具有最低限度作用（R. Jefferis，Biotechnol. Prog. 21（2005），第11–16页）。相比之下，可变结构域的糖基化可以对抗体的抗原结合活性具有作用。在可变结构域中的糖基化可以对抗原结合亲和力具有负面作用，可能是由于立体阻碍（Co，M.S.等人，Mol. Immunol.（1993）30:1361- 1367），或导致对于抗原的亲和力增加（Wallick，S.C.等人，Exp. Med.（1988）168:1099-1109；Wright，A.等人，EMBO J.（1991）10:2717 2723）。

本发明的一个方面涉及生成糖基化位点突变体，其中结合蛋白的O或N联糖基化位点已突变。本领域技术人员可以使用标准的众所周知技术生成此类突变体。保留生物学活性但具有增加或减少的结合活性的糖基化位点突变体是本发明的另一个目的。

在另外一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合部分的糖基化是修饰的。例如，可以制备无糖基化抗体（即抗体缺乏糖基化）。糖基化可以改变为例如增加抗体对于抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变在抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸置换，其导致一个或多个可变区糖基化位点的消除，以从而消除在那个位点上的糖基化。此类无糖基化可以增加抗体对于抗原的亲和力。此类方法在PCT公开WO2003016466A2以及美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述，所述专利各自整体引入本文作为参考。

另外或可替代地，可以制备本发明的修饰的抗体，其具有改变类型的糖基化，例如具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖化抗体或具有增加的二等分GlcNAc结构的抗体。此类改变的糖基化模式已证实增加抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域中描述，且可以用作在其中表达本发明的重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。参见例如，Shields，R. L.等人（2002）J. Biol. Chem. 277：26733–26740；Umana等人（1999）Nat. Biotech. 17：176–1，以及欧洲专利号：EP 1,176,195；PCT公开WO 03/035835；WO 99/54342 80，其各自整体引入本文作为参考。

蛋白质糖基化取决于目的蛋白质的氨基酸序列，以及蛋白质在其中表达的宿主细胞。不同生物可以产生不同的糖基化酶（例如糖基转移酶和糖苷酶），且具有可获得的不同底物（核苷酸糖）。由于此类因素，取决于特定蛋白质在其中表达的宿主系统，蛋白质糖基化模式和糖基残基的组成可以不同。在本发明中有用的糖基残基可以包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰氨基葡萄糖和唾液酸。特别地，糖基化结合蛋白包含糖基残基，从而使得糖基化模式是人的。

本领域技术人员已知不同蛋白质糖基化可以导致不同蛋白质特征。例如，与在哺乳动物细胞例如CHO细胞系中表达的相同蛋白质的那种比较，在微生物宿主例如酵母中产生且利用酵母内源途径糖基化的治疗蛋白质的功效可以是减少的。此类糖蛋白还可以在人中是免疫原性的且在施用后在体内显示减少的半衰期。在人和其他动物中的特异性受体可以识别特异性糖基残基且促进蛋白质从血流中的快速清除。其他不利效应可以包括在蛋白质折叠、可溶性、对蛋白酶的敏感性、运输、转运、区室化、分泌、由其他蛋白质或因子识别、抗原性或变应原性中的变化。相应地，从业者可以优选具有糖基化的特定组成和模式的治疗蛋白质，例如与在人细胞中或在预期主题动物的物种特异性细胞中产生的那种等同或至少相似的糖基化组成和模式。

表达不同于宿主细胞那种的糖基化蛋白质可以通过遗传修饰宿主细胞以表达异源糖基化酶来达到。使用本领域已知的技术，从业者可以生成显示出人蛋白质糖基化的抗体或其抗原结合部分。例如，酵母菌株已遗传修饰为表达非天然存在的糖基化酶，从而使得在这些酵母菌株中产生的糖基化蛋白质（糖蛋白）显示出与动物细胞特别是人细胞的那种等同的蛋白质糖基化（美国专利申请20040018590和20020137134以及PCT公开WO2005100584 A2）。

进一步地，本领域技术人员应当理解目的蛋白质可以使用遗传工程改造为表达多种糖基化酶的宿主细胞文库进行表达，从而使得文库的成员宿主细胞产生具有变体糖基化模式的目的蛋白质。从业者随后可以选择且分离具有特定新糖基化模式的目的蛋白质。特别地，具有特别选择的新糖基化模式的蛋白质显示出改善或改变的生物学特性。

5.9 抗独特型抗体

除结合蛋白外，本发明还涉及对于本发明的此类结合蛋白特异性的抗独特型（抗Id）抗体。抗Id抗体是这样的抗体，其识别一般与另一种抗体的抗原结合区结合的独特决定簇。抗Id可以通过用结合蛋白或其含CDR区免疫接种动物进行制备。免疫接种的动物将识别且响应免疫接种抗体的独特型决定簇且产生抗Id抗体。抗Id抗体也可以用作“免疫原”，以在另外一个动物中诱导免疫应答，产生所谓的抗抗Id抗体。

6. 药物组合物

本发明还提供了包含本发明的抗体或其抗原结合部分和药学可接受的载体的药物组合物。包含本发明的抗体的药物组合物用于在下述中使用，但不限于这些：诊断、检测或监控病症，预防、治疗、管理或改善病症或其一种或多种症状，和/或研究。在一个具体实施方案中，组合物包含本发明的一种或多种抗体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本发明的一种或多种抗体和除本发明的抗体外的一种或多种预防或治疗试剂用于治疗其中RGM A活性是有害的病症。特别地，预防或治疗试剂已知用于或已用于或目前用于病症或其一种或多种症状的预防、治疗、管理或改善。依照这些实施方案，组合物可以进一步包含载体、稀释剂或赋形剂。

本发明的抗体和抗体部分可以掺入适合于施用于受试者的药物组合物内。一般地，药物组合物包含本发明的抗体或抗体部分和药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合中的一种或多种。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂将是特别有利的，例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含微量辅助物质例如湿润或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强抗体或抗体部分的保存期限或有效性。

多种递送系统是已知的，且可以用于施用本发明的一种或多种抗体或本发明的一种或多种抗体和预防试剂或治疗试剂的组合，用于预防、管理、治疗或改善病症或其一种或多种症状，例如在脂质体中封装、微粒、微胶囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞、受体介导的胞吞作用（参见例如，Wu和Wu，J. Biol. Chem. 262:4429-4432（1987））、作为逆转录病毒或其他载体的部分的核酸构建等。施用本发明的预防或治疗试剂的方法包括但不限于肠胃外施用（例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下）、硬膜外施用、瘤内施用和粘膜施用（例如鼻内和经口途径）。此外，可以采用肺施用，例如通过使用吸入器或喷雾器，和用气溶胶化试剂配制。参见例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，所述专利各自整体引入本文作为参考。在一个实施方案中，本发明的抗体、组合疗法或本发明的组合物使用Alkermes AIR®肺药物递送技术（Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass.）进行施用。在一个具体实施方案中，本发明的预防或治疗试剂肌内、静脉内、瘤内、经口、鼻内、肺或皮下施用。预防或治疗试剂可以通过任何途径进行施用，例如通过输注或推注注射、通过经由上皮或皮肤粘膜内层（linings）（例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等）吸收，并且可以连同其他生物学活性剂一起施用。施用可以是全身性或局部的。

在一个具体实施方案中，可能希望将本发明的预防或治疗试剂局部施用于需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于局部输注、通过注射或借助于埋植剂来达到，所述埋植剂是多孔或非多孔材料，包括膜和基质，例如硅橡胶（sialastic）膜、聚合物、纤维基质（例如Tisseel®）或胶原基质。在一个实施方案中，将有效量的本发明拮抗剂的一种或多种抗体局部施用于受试者的受累区域，以预防、治疗、管理和/或改善病症或其症状。在另一个实施方案中，将有效量的本发明的一种或多种抗体与有效量的除本发明的抗体外的一种或多种治疗（例如一种或多种预防或治疗试剂）组合局部施用于受累区域，以预防、治疗、管理和/或改善病症或其一种或多种症状。

在另一个实施方案中，预防或治疗试剂可以在控制释放或持续释放系统中递送。在一个实施方案中，泵可以用于达到控制或持续释放（参见Langer，同上；Sefton，1987，CRCCrit. Ref. Biomed. Eng. 14：20；Buchwald等人，1980，Surgery 88：507；Saudek等人，1989，N. Engl. J. Med. 321：574）。在另一个实施方案中，聚合材料可以用于达到本发明的治疗的控制或持续释放（参见例如，Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise（编辑），CRC Pres.，Boca Raton，Fla.（1974）；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball（编辑），Wiley，New York（1984）；Ranger和Peppas，1983，J.，Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23：61；还参见Levy等人，1985，Science 228：190；During等人，1989，Ann. Neurol. 25：351；Howard等人，1989，J. Neurosurg. 7 1：105）；美国专利号5,679,377；美国专利号5，916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO99/15154；和PCT公开号WO 99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的例子包括但不限于聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）、聚（甲基丙烯酸甲酯）、聚（丙烯酸）、乙烯-乙酸乙酯共聚物、聚（甲基丙烯酸）、聚乙交酯（PLG）、聚酐、聚（N-乙烯吡咯烷酮）、聚（乙烯醇）、聚丙烯酰胺、聚（乙二醇）、聚丙交酯（PLA）、丙交酯-乙交酯共聚物（PLGA）、和聚原酸酯。在一个特定实施方案中，在控制释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可浸出杂质、在贮存上稳定、无菌和生物可降解的。在另外一个实施方案中，控制或持续释放系统可以置于预防或治疗靶附近，从而仅需要全身剂量的部分（参见例如，Goodson，Medical Applications of ControlledRelease，同上，第2卷，第115–138页（1984））。

控制释放系统在Langer（1990，Science 249：1527–1533）的综述中讨论。本领域技术人员已知的任何技术可以用于产生包含本发明的一种或多种治疗试剂的持续释放制剂。参见例如美国专利号4,526,938，PCT公开WO 91/05548，PCT公开WO 96/20698，Ning等人，1996，"Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer XenograftUsing a Sustained-Release Gel," Radiotherapy &Oncology 39：179–189，Song等人，1995，"Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDAJournal of Pharmaceutical Science &Technology 50：372–397，Cleek等人，1997，"Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for CardiovascularApplication," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24：853–854，和Lam等人，1997，"Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibodyfor Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24：759–760，其各自整体引入本文作为参考。

在一个具体实施方案中，当本发明的组合物是编码预防或治疗试剂的核酸时，核酸可以在体内施用，以促进其编码的预防或治疗试剂的表达，通过将其构建为合适核酸表达载体的部分且将其这样施用，从而使得它变得细胞内的，例如通过使用逆转录病毒载体（参见美国专利号4,980,286），或通过直接注射，或通过使用微粒轰击（例如，基因枪；Biolistic，Dupont），或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，或通过将其与已知进入核的同源异形框样肽连接施用（参见例如，Joliot等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA88：1864–1868）。可替代地，核酸可以通过同源重组细胞内引入且掺入宿主细胞DNA内用于表达。

本发明的药物组合物配制为与其预期施用途径相容。施用途径的例子包括但不限于肠胃外例如静脉内、皮内、皮下、经口、鼻内（例如吸入）、经皮（例如局部）、经粘膜和直肠施用。在一个具体实施方案中，组合物依照常规程序配制为适合于静脉内、皮下、肌内、经口、鼻内或局部施用于人类的药物组合物。一般地，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。当需要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉药例如利多卡因（lignocamne），以减轻在注射部位处的疼痛。

如果本发明的组合物待局部施用，那么组合物可以以软膏、乳膏、经皮贴剂、洗剂、凝胶、洗发水、喷雾剂、气溶胶、溶液、乳状液或本领域技术人员众所周知的其他形式进行配制。参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction toPharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack Pub. Co.，Easton，Pa.（1995）。对于无法喷雾的局部剂型，一般采用粘稠至半固体或固体形式，其包含与局部应用相容的且具有大于水的动态粘度的载体或一种或多种赋形剂。合适的制剂包括但不限于溶液、悬液、乳状液、乳膏、软膏、粉末、擦剂、药膏等，如果需要的话，其进行灭菌或与辅助试剂（例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲剂或盐）混合用于影响多种特性，例如渗透压。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中特别是与固体或液体惰性载体组合的活性成分包装在与增压挥发物（例如气态推进剂例如氟利昂）的混合物或挤压瓶中。如果需要的话，增湿剂或保湿剂也可以加入药物组合物和剂型中。此类另外的成分的例子是本领域众所周知的。

如果本发明的方法包括组合物的鼻内施用，那么组合物可以以气溶胶形式、喷雾剂、薄雾或滴剂的形式配制。特别地，用于根据本发明使用的预防或治疗试剂可以方便地以来自增压包或喷雾器的气溶胶喷雾呈现的形式递送，使用合适的推进剂（例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体）。在增压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀以递送测定量进行测定。用于在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药液筒（由例如明胶组成）可以配制含有化合物和合适粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。

如果本发明的方法包括经口施用，那么组合物可以以片剂、胶囊、扁囊剂、囊片（gelcaps）、溶液、悬液等的形式经口配制。片剂或胶囊可以通过常规方法用药学可接受的赋形剂进行制备，例如粘合剂（例如预明胶化玉蜀黍淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素）；填充剂（例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙）；润滑剂（例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅）；崩解剂（例如马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠）；或湿润剂（例如月桂基硫酸钠）。片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包被。用于经口施用的液体制剂可以采用溶液、糖浆剂或悬液的形式，但不限于这些，或它们可以作为干燥产物呈现用于在使用前由水或其他合适媒介物构建。此类液体制剂可以通过常规方法用药学可接受的添加剂进行制备，例如悬浮剂（例如山梨糖醇糖浆剂、纤维素衍生物或氢化食用脂肪）；乳化剂（例如卵磷脂或阿拉伯树胶）；非水媒介物（例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油）；和防腐剂（例如对羟基苯甲酸甲或丙酯或山梨酸）。合适时，制剂还可以含有缓冲盐、矫味、着色和甜味剂。用于经口施用的制剂可以适当地配制用于一种或多种预防或治疗试剂的缓慢释放、控制释放或持续释放。

本发明的方法可以包括用气溶胶化试剂配制的组合物的肺施用，例如通过使用吸入器或喷雾器。参见例如，美国专利号6,019,968、5,985、320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，其各自整体引入本文作为参考。在一个具体实施方案中，本发明的抗体、组合疗法或本发明的组合物使用Alkermes AIR®肺药物递送技术（Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass.）进行施用。

本发明的方法可以包括配制用于通过注射（例如通过推注注射或连续输注）肠胃外施用的组合物的施用。用于注射的制剂可以伴随加入的防腐剂在单位剂型中（例如在安瓿或多剂量容器中）呈现。组合物可以采用此类形式如在油或水性媒介物中的悬液、溶液或乳状液，并且可以含有配制试剂例如悬浮、稳定和/或分散剂。可替代地，活性成分可以以粉末形式用于在使用前由合适媒介物（例如灭菌无热原水）构建。本发明的方法可以另外包括配制为储库制剂的组合物的施用。此类长效制剂可以通过埋植（例如皮下或肌内）或通过肌内注射进行施用。因此，例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料（例如作为在可接受的油中的乳状液）或离子交换树脂进行配制，或配制为微溶衍生物（例如作为微溶盐）。

本发明的方法涵盖配制为中性或盐形式的组合物的施用。药学可接受的盐包括由阴离子形成的那些，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，和由阳离子形成的那些，例如衍生自氢氧化钠、钾、铵、钙、铁，异丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的那些。

一般地，组合物的成分分开供应或在单位剂型中混合在一起，例如作为在指示活性剂的数量的气密容器例如安瓿或小袋（sachette）中的干燥冻干粉末或不含水的浓缩物。当施用模式是输注时，组合物可以用含有无菌药学级别水或盐水的输液瓶分配。当施用模式是通过注射时，无菌注射用水或盐水的安瓿可以这样提供，从而使得成分可以在施用前混合。

另一个实施方案提供了本发明的一种或多种预防或治疗试剂或药物组合物包装在指示试剂的数量的气密容器例如安瓿或小袋中。在一个实施方案中，本发明的一种或多种预防或治疗试剂或药物组合物作为在气密容器中的干燥灭菌冻干粉末或不含水的浓缩物供应，并且可以重构（例如用水或盐水）至用于施用于受试者的合适浓度。特别地，本发明的一种或多种预防或治疗试剂或药物组合物作为在气密容器中的干燥灭菌冻干粉末供应，其单位剂量是至少5 mg，更特别地至少10 mg、至少15 mg、至少25 mg、至少35 mg、至少45mg、至少50 mg、至少75 mg或至少100 mg。本发明的冻干预防或治疗试剂或药物组合物应在其最初容器中贮存于2℃ - 8℃，并且本发明的预防或治疗试剂或药物组合物应在重构后1周内施用，特别是在5天内、在72小时内、在48小时内、在24小时内、在12小时内、在6小时内、在5小时内、在3小时内或在1小时内。在一个可替代实施方案中，本发明的一种或多种预防或治疗试剂或药物组合物在指示试剂的数量和浓度的气密容器中以液体形式供应。特别地，施用的组合物的液体形式在气密容器中以至少0.25 mg/ml供应，更特别地至少0.5 mg/ml、至少1 mg/ml、至少2.5 mg/ml、至少5 mg/ml、至少8 mg/ml、至少10 mg/ml、至少15 mg/kg、至少25 mg/ml、至少50 mg/ml、至少75 mg/ml或至少100 mg/ml。液体形式应在其最初容器中贮存于2℃ - 8℃。

本发明的抗体和抗体部分可以掺入适合于肠胃外施用的药物组合物内。特别地，抗体或抗体部分制备为含有0.1-250 mg/ml抗体的可注射溶液。可注射溶液可以由在燧石或琥珀小瓶、安瓿或预装注射器中的液体或冻干剂型组成。缓冲液可以是在pH 5.0 - 7.0（最佳地pH 6.0）的L-组氨酸（1-50 mM），最佳地5-10mM。其他合适的缓冲液包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠在0-300 mM浓度（对于液体剂型最佳地150 mM）可以用于修饰溶液的毒性。可以包括冷冻保护剂用于冻干剂型，主要是0-10％蔗糖（最佳地0.5-1.0％）。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。可以包括填充剂用于冻干剂型，主要是1-10 ％甘露糖醇（最佳地2-4％）。稳定剂可以用于液体和冻干剂型，主要是1-50 mML-甲硫氨酸（最佳地5-10 mM）。其他合适的填充剂包括甘氨酸、精氨酸可以作为0–0.05 ％聚山梨醇酯-80（最佳地0.005–0.01 ％）包括。另外的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。制备为用于肠胃外施用的可注射溶液的包含本发明抗体和抗体部分的药物组合物可以进一步包含作为佐剂有用的试剂，例如用于增加治疗蛋白质（例如抗体）的吸收或分散的那些。特别有用的佐剂是透明质酸酶，例如Hylenex® （重组人透明质酸酶）。在可注射溶液中透明质酸酶的添加改善在肠胃外施用特别是皮下施用后的人生物利用度。它还允许更大的注射部位体积（即大于1 ml），伴随更少的疼痛和不适，和注射部位反应的最低限度发病率。（参见引入本文作为参考的WO2004078140、US2006104968）。

本发明的组合物可以为多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液（例如可注射和可输注溶液）、分散体或悬液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。具体形式取决于预期施用模式和治疗应用。一般的具体组合物以可注射或可输注溶液的形式，例如类似于用于人用其他抗体的被动免疫接种的那些的组合物。具体施用模式是肠胃外的（例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内）。在一个特定实施方案中，抗体通过静脉内输注或注射进行施用。在另一个特定实施方案中，抗体通过肌内或皮下注射进行施用。

治疗组合物一般必须是无菌且制造和贮存条件下是稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可以通过下述进行制备：根据需要，将活性化合物（即抗体或抗体部分）以所需量与上文列举的成分之一或组合一起掺入合适溶剂中，随后过滤灭菌。一般地，分散体通过将活性化合物掺入无菌媒介物内进行制备，所述无菌媒介物含有基本分散介质和来自上文列举那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌、冻干粉末的情况下，具体制备法是真空干燥和喷雾干燥，其获得来自其先前无菌过滤溶液的活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。溶液的合适流动性可以通过下述得到维持：例如使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下所需粒径的维持，和表面活性剂的使用。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来达到。

本发明的抗体和抗体部分可以以本领域已知的多种方法进行施用，尽管对于许多治疗应用，具体施用途径/模式是皮下注射、静脉内注射或输注。如技术人员应当理解的，施用途径/模式取决于所需结果而改变。在特定实施方案中，活性化合物可以用保护化合物不受快速释放的载体进行制备，例如控制释放制剂，包括埋植剂、经皮贴剂和微胶囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚羟乙酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法是有专利权的或本领域技术人员一般已知的。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

在特定实施方案中，本发明的抗体或抗体部分可以例如与惰性稀释剂或可同化食用载体一起经口施用。化合物（如果需要的话，和其他成分）也可以封入硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接掺入受试者的饮食内。对于经口治疗施用，化合物可以与赋形剂一起掺入且以可摄取片剂、颊含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆剂、糯米纸剂（wafer）等的形式使用。为了通过除肠胃外施用外施用本发明的化合物，可能需要用防止其失活的材料包被化合物或共施用化合物与防止其失活的材料。

补充性活性化合物也可以掺入组合物内。在特定实施方案中，本发明的抗体或抗体部分与一种或多种另外的治疗试剂共配制和/或共施用，所述治疗试剂对于治疗其中RGMA活性是有害的病症是有用的。例如，本发明的抗RGM A抗体或抗体部分可以与一种或多种另外的抗体共配制和/或共施用，所述另外的抗体结合其他靶（例如结合细胞因子或结合细胞表面分子的抗体）。此外，本发明的一种或多种抗体可以与2种或更多种前述治疗试剂组合使用。此类组合疗法可以有利地利用更低剂量的施用的治疗试剂，从而避免与多种单一疗法相关的可能毒性或并发症。

在特定实施方案中，针对RGM A的抗体或其片段与本领域已知的半衰期延长媒介物连接。此类媒介物包括但不限于Fc结构域、聚乙二醇和葡聚糖。此类媒介物例如在美国申请系列号09/428,082和公开的PCT申请号WO 99/25044中描述，所述专利为了任何目的在此引入作为参考。

在一个具体实施方案中，施用包含编码本发明的抗体或本发明的另一种预防或治疗试剂的核苷酸序列的核酸序列，以通过基因治疗治疗、预防、管理或改善病症或其一种或多种症状。基因治疗指通过给受试者施用所表达或可表达的核酸执行的治疗。在本发明的这个实施方案中，核酸产生其编码的本发明的抗体或预防或治疗试剂，其介导预防或治疗效应。

本领域可用的用于基因治疗的任何方法可以根据本发明使用。关于基因治疗法的一般综述，参见Goldspiel等人，1993，Clinical Pharmacy 12：488–505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 3：87–95；Tolstoshev，1993，Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32：573–596；Mulligan，Science 260：926–932（1993）；和Morgan和Anderson，1993，Ann. Rev. Biochem.62：191–217；May，1993，TIBTECH 11（5）：155–215。可以使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法在Ausubel等人（编辑），Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，NY（1993）；和Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY（1990）中描述。基因治疗的多种方法的详细描述公开于引入本文作为参考的US20050042664 A1中。

其为抗氧化剂、自由基清除剂、抗惊厥药如苯妥英或贫血药促红细胞生成素的任何神经保护剂适合于具有促再生RGM A抗体的组合疗法，从而延长神经保护剂的通常极短的治疗性处理窗。

本发明的抗体和抗体部分可以用于治疗患有此类疾病的人。

应当理解本发明的抗体或其抗原结合部分可以单独或与另外的试剂例如治疗试剂组合使用，所述另外的试剂由技术人员就其预期目的加以选择。例如，另外的试剂可以是领域公认为用于治疗由本发明的抗体治疗的疾病或状况的治疗试剂。另外的试剂还可以是对治疗组合物赋予有利属性的试剂，例如影响组合物的粘度的试剂。

应进一步理解在本发明内待包括的组合是对于其预期用途有用的那些组合。下文阐述的试剂对于目的是举例说明性的且不预期是限制性的。其为本发明的部分的组合可以是本发明的抗体和选自下文列表的至少一种另外的试剂。如果组合是这样的，使得所形成的组合物可以执行其预期功能，组合还可以包括超过一种另外的试剂，例如2种或3种另外的试剂。

本发明的抗体或抗体部分可以与之组合用于多发性硬化的治疗试剂的非限制性例子包括下述：皮质类固醇；泼尼松龙；甲泼尼龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；氨甲蝶呤；4-氨基吡啶；替扎尼定；干扰素-β1a（Avonex；Biogen）；干扰素-β1b（Betaseron；Chiron/Berlex）；干扰素α-n3）（Interferon Sciences/Fujimoto）、干扰素-α（Alfa Wassermann/J&J）、干扰素 β1A-IF（Serono/Inhale Therapeutics）、聚乙二醇干扰素 α 2b（Enzon/Schering-Plough）、共聚物 1（Cop-1；Copaxone；Teva Pharmaceutical Industries，Inc.）；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨；针对其他人细胞因子或生长因子及其受体的抗体或拮抗剂，所述其他人细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子或其配体的抗体组合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90。本发明的抗体或其抗原结合部分也可以与试剂组合，例如氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟米特、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇例如泼尼松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓药、补体抑制剂、肾上腺素剂、干扰通过促炎细胞因子如TNFα或IL-1发信号的试剂（例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂）、IL-1β转换酶抑制剂、TACE抑制剂、T细胞发信号抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物（例如可溶性p55或p75 TNF受体、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R）和抗炎细胞因子（例如IL-4、IL-10、IL-13和TGFβ）。

其中抗体或其抗原结合部分可以组合的用于多发性硬化的治疗试剂的具体例子包括干扰素-β，例如IFNβ1a和IFNβ1b；copaxone、皮质类固醇、胱天蛋白酶抑制剂例如胱天蛋白酶-1抑制剂、IL-1抑制剂、TNF抑制剂、以及针对CD40配体和CD80的抗体。

本发明的抗体或其抗原结合部分还可以与下述试剂组合：例如阿仑珠单抗、屈大麻酚、Unimed、达可珠单抗、米托蒽醌、盐酸扎利罗登、氨吡啶、乙酸格拉默、那他珠单抗、sinnabidol、a-immunokine NNSO3、ABR-215062、AnergiX.MS、趋化因子受体拮抗剂、BBR-2778、calagualine、CPI-1189、LEM（脂质体封装的米托蒽醌）、THC.CBD（大麻素激动剂）、MBP-8298、mesopram（PDE4抑制剂）、MNA-715、抗IL-6受体抗体、neurovax、吡非尼酮allotrap 1258（RDP-1258）、sTNF-R1、他仑帕奈、特立氟胺、TGF-β2、替利莫肽、VLA-4拮抗剂（例如TR-14035、VLA4 Ultrahaler、Antegran-ELAN/Biogen）、干扰素γ拮抗剂、IL-4激动剂。

本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或抗体部分。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需治疗结果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可以通过本领域技术人员决定，并且可以根据因素而改变，例如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及抗体或抗体部分在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量还是其中抗体或抗体部分的任何有毒或有害效应由治疗有利效应超过的量。“预防有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需预防结果的量。一般地，因为预防剂量在受试者中在疾病前或在疾病的早期阶段时使用，所以预防有效量将小于治疗有效量。

给药方案可以进行调整，以提供最佳所需应答（例如治疗或预防应答）。例如，可以施用单一推注，可以随着时间过去施用几个分份剂量，或可以如由治疗情况的紧急指示的按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物是特别有利的，用于易于施用和剂量的一致性。如本文使用的，剂量单位形式指作为用于待治疗的哺乳动物受试者的单位剂量合适的物理上不连续的单位；每个单位含有计算为与所需药学载体结合产生所需治疗效应的预定数量的活性化合物。关于本发明的剂量单位形式的规格由下述指示且直接取决于下述：（a）活性化合物的独特特征和待达到的具体治疗或预防效应，和（b）在用于治疗个体中的敏感性的此类活性化合物的配药法中固有的局限性。

关于本发明抗体或抗体部分的治疗或预防有效量的示例性、非限制性范围是0.1-20 mg/kg，更特别地1-10 mg/kg。应当指出剂量值可以随着待改善状况的类型和严重性而改变。应进一步理解对于任何特定受试者，根据个体需要和施用或监督组合物施用的个人的专业判断，具体给药方案应随着时间过去而调整，并且本文阐述的剂量范围仅是示例性的，并且不预期限制请求保护的组合物的范围或实践。

对于本领域技术人员显而易见的是，本文描述的本发明的方法的其他合适修饰和适应是明显的，并且可以使用合适等价物做出而不背离本发明的范围或本文公开的实施方案。已详细描述了本发明，通过参考下述实施例本发明得到更明确理解，所述实施例仅包括用于举例说明的目的，并且不预期是本发明的限制。

实施例：

方法

下述方法详细描述了在实施例节段中使用的实验程序。

（i）将直接结合ELISA板用碳酸盐缓冲液中的hRGM A（R&D）以2μg/mL的浓度进行包被。孔随后用2 ％封闭缓冲液（Bio-Rad）在室温封闭1小时。生物素化的抗体在0.1％BSA/PBS中以1:5稀释因子沿着板向下系列稀释，并且在室温温育1小时。检测试剂是链霉抗生物素蛋白-HRP在0.1％BSA/PBS中的1:10,000稀释物。检测用TMB试剂完成，其用2N H₂SO₄停止且在450nM处阅读OD。

（ii）FACS分析。对超表达hRGM A的HEK293细胞或超表达大鼠RGM A的BAF3细胞的合适转染子实施在0.1 ％BSA/PBS缓冲液中在4℃用未标记的5F9或8D1 MABs超过15分钟的染色。检测用小鼠抗大鼠IgG PE抗体执行。

（iii）在hRGM A-Neogenin结合测定中用于评估MAB 5F9的固相ELISA测定。

将ELISA板（Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC，439454）在37℃用2.5 µg/ml浓度的His标记的人Neogenin蛋白质的细胞外结构域（母液的浓度：30 µg/ml）包被1小时。在温育后，在用含有0.02 ％Tween 20的PBS的3个分开洗涤步骤中去除未结合的Neogenin。通过加入200 µl /孔的3％牛血清白蛋白、PBS、Tween 20（0.02 ％）封闭液完成Neogenin包被板的封闭。在37℃温育1小时后，去除封闭液且加入与人fc标记缀合的RGM A片段或全长蛋白质，连同或不连同抗体。在某些实验中，将抗体与fc缀合的hRGM A蛋白质在室温预温育1小时。将Neogenin包被的板与hRGM A在37℃温育1小时，连同或不连同抗体。在用PBS-Tween 20（0.02 ％）的3个洗涤步骤后，将板与生物素标记的抗人fc抗体（1mg/ml，在含有0.6 ％BSA、0.02 ％Tween 20的PBS中1:200稀释），Jackson ImmunoResearch目录号：709–065-149在37℃温育1小时。通过用PBS-Tween 20（0.02 ％）的3个洗涤步骤去除未结合的抗体。为了显现生物素标记的抗fc抗体的结合，加入由用含有0.6 ％BSA、0.02 ％Tween20的PBS稀释1:5000的链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（Roche，目录#11089153001）组成的复合物，随后在37℃温育1小时。在加入过氧化物酶底物（Immuno Pure TMB ，Pierce #34021）前，在3个后续洗涤步骤（PBS-Tween 20（0.02 ％）中去除未结合的过氧化物酶-复合物。在其加入孔中后1–30分钟通过2.5 M H₂SO₄停止底物反应。使用Anthos光度计在450 nm的波长处分析板（OD测定）。

（iv）在hRGM A – BMP-4结合测定中用于评估MAB 5F9的固相ELISA测定

将ELISA板（Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC，439454）用溶液在37℃包被1小时，所述溶液含有2.5 µg/ml浓度的重组人BMP-4蛋白质（R&D Systems，# 314-BP，批次#BEM316061）。在温育后，在用含有0.02 ％Tween 20的PBS的3个分开洗涤步骤中去除未结合的BMP-4。通过加入200 µl /孔的3％牛血清白蛋白、PBS、Tween 20（0.02 ％）封闭液完成BMP-4包被板的封闭。在37℃温育1小时后，去除封闭液且加入与人fc标记缀合的RGM A片段或全长蛋白质，连同或不连同抗体。在某些实验中，将抗体与fc缀合的hRGM A蛋白质在室温预温育1小时。将BMP-4包被的板与hRGM A在37℃温育1小时，连同或不连同抗体。在用PBS-Tween 20（0.02 ％）的3个洗涤步骤后，将板与生物素标记的抗人fc抗体（1mg/ml，在含有0.6 ％BSA、0.02 ％Tween 20的PBS中1:200稀释），Jackson ImmunoResearch目录号：709–065-149在37℃温育1小时。通过用PBS-Tween 20（0.02 ％）的3个洗涤步骤去除未结合的抗体。为了显现生物素标记的抗fc抗体的结合，加入由用含有0.6 ％BSA、0.02 ％Tween20的PBS稀释1:5000的链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（Roche，目录#11089153001）组成的复合物，随后在37℃温育1小时。在加入过氧化物酶底物（Immuno Pure TMB ，Pierce #34021）前，在3个后续洗涤步骤（PBS-Tween 20（0.02 ％）中去除未结合的过氧化物酶-复合物。在其加入孔中后1–30分钟通过2.5 M H₂SO₄停止底物反应。使用Anthos光度计在450 nm的波长处分析板（OD测定）。

（v）在hRGM A – BMP-2结合测定中用于评估MAB 5F9的固相ELISA测定

将ELISA板（Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC，439454）用溶液在37℃包被1小时，所述溶液含有2.5 µg/ml浓度的重组人BMP-2蛋白质（R&D Systems，# 355-BM，批次#MSA04）。在温育后，在用含有0.02 ％Tween 20的PBS的3个分开洗涤步骤去除未结合的BMP-2。通过加入200 µl /孔的3％牛血清白蛋白、PBS、Tween 20（0.02 ％）封闭液完成BMP-2包被板的封闭。在37℃温育1小时后，去除封闭液且加入与人fc标记缀合的RGM A片段或全长蛋白质，连同或不连同抗体。在某些实验中，将抗体与fc缀合的hRGM A蛋白质在室温预温育1小时。将BMP-2包被的板与hRGM A在37℃温育1小时，连同或不连同抗体。在用PBS-Tween 20（0.02 ％）的3个洗涤步骤后，将板与生物素标记的抗人fc抗体（1mg/ml，在含有0.6 ％BSA、0.02 ％Tween 20的PBS中1:200稀释），Jackson ImmunoResearch目录号：709–065-149在37℃温育1小时。通过用PBS-Tween 20（0.02 ％）的3个洗涤步骤去除未结合的抗体。为了显现生物素标记的抗fc抗体的结合，加入由用含有0.6 ％BSA、0.02 ％Tween 20的PBS稀释1:5000的链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（Roche，目录#11089153001）组成的复合物，随后在37℃温育1小时。在加入过氧化物酶底物（Immuno Pure TMB ，Pierce # 34021）前，在3个后续洗涤步骤（PBS-Tween 20（0.02 ％）中去除未结合的过氧化物酶-复合物。在其加入孔中后1–30分钟通过2.5 M H₂SO₄停止底物反应。使用Anthos光度计在450 nm的波长处分析板（OD测定）。

（vi）Ntera-2细胞培养

人Ntera-2细胞得自德国微生物和细胞培养物保藏中心（German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures）（DMSZ，Braunschweig）。将未分化的Ntera-2细胞的冷冻原种在含有10 ％胎牛血清（FBS；JRH Bioscience，Kansas，USA）和5 ％马血清（HS；Sigma，德国）的DMEM培养基中解冻。细胞在培养瓶（Greiner，德国）中生长直至它们达到80％的汇合。

对于神经元分化，将Ntera-2细胞以2.5 x 10⁶细胞/175 cm²的密度种植到分化培养基（含有10 ％FBS、5 ％HS、1 ％青霉素-链霉素、视黄酸10µM的DMEM培养基）中。将细胞分化3周，并且将培养基每周更换2次。

在分化后，用胰蛋白酶-EDTA解离细胞且以1:6的比分开。48小时后，通过轻敲使神经元细胞与下面的细胞分开。将逐出的细胞转移到新振荡培养瓶（Corning，USA）内的新培养基中用于聚集。在补充有B27（Gibco）、谷氨酰胺（Gibco）和青霉素-链霉素的Neurobasal培养基（Gibco）中，在37℃在平滑水平振荡条件下允许分化的Ntera-2细胞聚集24小时。将Ntera-2聚集体以约20–30个聚集体/盖玻片的密度种植到24孔板中。聚赖氨酸预包被的盖玻片用层粘连蛋白（20µg/ml，Sigma）和重组fc偶联的人RGM A片段#786（氨基酸47–168）以10 µg/ml的浓度进行包被。在种植后，将培养物用5F9 MAB处理，以3个不同浓度（0.1 µg/ml；1 µg/ml；10 µg/ml）加入培养基中，并且在37℃在Neogenin培养基中进一步温育24小时。随后在4％低聚甲醛中固定聚集体（2小时，室温），并且通过加入0.1 ％Triton X-100的PBS溶液渗透化处理（20分钟，室温）。对于荧光染色，将培养物用含有1 ％BSA的PBS在室温封闭1小时。在封闭后，将Ntera细胞与针对β-微管蛋白同种型3的小鼠单克隆抗体（克隆SDL3D10，Sigma # T8660）一起在室温温育2小时。通过3个不同洗涤步骤（各5–15分钟）去除未结合的抗体，并且使Ntera细胞与Cy-3缀合的驴抗小鼠抗体（Jackson ImmunoResearch批次62597）一起温育，在PBS/0,5 ％BSA和0,5 µg/ml双苯甲亚胺中稀释1:350倍。在1小时温育后，将培养物洗涤3次，以去除未结合的二次抗体。对于荧光显微镜检查，将盖玻片包埋在Fluoromount G（Southern Biotech，Eching）中。

使用Zeiss Axiovert 200荧光显微镜获得Ntera-2聚集体的图像，并且使用内部图像采集和分析系统自动分析培养物的长出。用Image Pro Plus 4.5完成长出的自动分析，并且用Graph Pad Prism 4执行数据的统计分析。将长出针对在不存在人RGM A片段#786的情况下生长的对照培养物标准化。

（vii）SH-SY5Y培养物。

SH-SY5Y细胞（ATCC，CRL-2266）是衍生自转移性脑瘤的人神经母细胞瘤细胞。这些细胞在由50 ％Earle’s Balanced Salt Solution（Invitrogen Life Technologies，目录#24010-043）和50 ％F12（Ham）Nutrient Mix + GlutaMAX-1（Invitrogen LifeTechnologies，目录#31765-027）组成的培养基中生长。这种培养基进一步补充有热灭活的10 ％胎牛血清（FCS，JRH Biosciences，Kansas目录#12107-1000M）、1 ％NEAA（MEM非必需氨基酸溶液（Sigma-Aldrich目录#M1745）和1 ％青霉素（10.000 U/ml）/链霉素（10.000 µg/ml）（Invitrogen Life Technologies，目录#15140-122）。为了刺激神经元分化和神经突生长，在补充有10 µM视黄酸（RA，Sigma-Aldrich目录#R2625-050MG））的培养基中培养SH-SY5Y细胞数天。分化的SH-SY5Y细胞在组织培养瓶中生长，并且通过小心的胰蛋白酶处理去除，并且在由RGM A蛋白质或其片段和胶原I的条纹模式包被的玻璃盖玻片上铺平板。

（viii）条纹玻璃盖玻片的制备

以与先前所述（Knoell等人Nature Protocols 2：1216–1224，2007）略微不同的方式执行在玻璃盖玻片上的修饰形式的条纹测定并且在下文概括。

用于产生由纯化蛋白质组成的条纹的无菌硅基质在培养皿表面上挤压，其中基质的粗糙面指向上。乙醇洗涤，将干净的盖玻片放在基质上，并且在盖玻片的背面上用油墨签字笔标记基质的角。将携带盖玻片的基质小心地颠倒，其中盖玻片面向培养皿的底部。Fc缀合的全长抑制性RGM A或其fc-片段或重组人RGM A（R&D Systems目录#2459 RM）与10 µlFITC标记的抗小鼠抗体（Fab-特异性山羊抗小鼠IgG，Sigma-Aldrich目录#F-4018）混合，以显现RGM A条纹。使用Hamilton注射器，将50 µl RGM A–FITC抗体溶液小心地注射通过入口通道。过量液体通过出口通道离开基质，并且用Kleenex布去除。基质-盖玻片在37℃温育2小时后，用100 µl PBS洗掉第一层包被液（含有RGM A）。在接下来的步骤中，将具有RGM A条纹的盖玻片转移至24孔板，用500 µl胶原I（大鼠尾胶原I，Becton Dickinson Biosciences目录#354236）包被，以填充在RGM A条纹之间的空隙，并且在37℃温育2小时。在结束时，在盖玻片上产生RGM A和胶原I的交替条纹模式。在温育后，通过用PBS的3个分开洗涤步骤洗掉非结合的胶原I，并且将分化的SH-SY5Y细胞铺平板到盖玻片上。在针对人RGM A的单克隆抗体的存在或不存在下，在形成图案的底物上SH-SY5Y细胞的温育在37℃继续20–24小时。

对于免疫荧光分析，将细胞在4％低聚甲醛中在室温固定2小时或在4℃固定过夜，并且通过用含有0.1 ％Triton X-100的PBS在室温温育10-20分钟进行渗透化处理。在用3％BSA封闭60分钟后，将细胞与初次抗体（单克隆抗β-微管蛋白同种型3克隆SDL 3D10，Sigma-Aldrich目录#T8660）在室温温育2小时，并且在用二次抗体（Cy-3驴抗小鼠JacksonImmuno Research批次:62597）的几个洗涤步骤后，在具有0.1 ％BSA的PBS中稀释1小时。使用双苯甲亚胺H33258（Riedel-De-Haen，目录#A-0207）将核复染色。最后将细胞包埋在Fluoromount G （Southern Biotechnology Associates Inc.:目录#010001）中。使用Axioplan2荧光显微镜（Zeiss）分析细胞。

（ix）重组抗RGM A抗体的构建和表达

在细菌中通过同源重组将编码大鼠抗人RGMA单克隆抗体5F9和8D1的重链可变区的cDNA片段的DNA克隆到含有人IgG1恒定区的pHybE表达载体内，所述人IgG1恒定区含有2个铰链区氨基酸突变。这些突变是在位置234和235（EU编号，Lund等人，1991，J. Immunol.，147：2657）上的亮氨酸至丙氨酸改变。将5F9和8D1单克隆抗体的轻链可变区克隆到含有人κ恒定区的pHybE载体内。示例性pHyb-E载体包括pHybE-hCk和pHybE-hCg1,z,non-a（参见美国专利申请系列号61/021,282）。通过连接到pHybE表达质粒内的嵌合重和轻链cDNAs的共转染，在293E细胞中瞬时表达全长抗体。通过蛋白A琼脂糖层析纯化含有重组抗体的细胞上清液，并且通过加入酸缓冲液洗脱结合的抗体。将抗体中和且透析到PBS内。随后通过如实施例1中所述的ELISA和如实施例7中所述的竞争性ELISA，就其结合RGMA的能力测试纯化的抗人RGMA单克隆抗体。

实施例1:抗人RGMA单克隆抗体的生产

抗人RGMA大鼠单克隆抗体如下获得：

实施例1A:用人RGMA抗原免疫接种大鼠

在第1天时，将与完全弗氏佐剂（Sigma）混合的25微克重组纯化的人RGMA（R&DSystems目录#2459-RM批次MRH02511A）皮下注射到4只6–8周龄Harlan Sprague Dawley大鼠内。在第21、42和63天时，将与不完全弗氏佐剂（Sigma）混合的25微克重组纯化的人RGMA皮下注射到同样4只Harlan Sprague Dawley大鼠内。在第144天或第165天时，用10 µg重组纯化的人RGMA静脉内注射大鼠。

实施例1B:杂交瘤的生成

根据Kohler，G.和Milstein 1975，Nature，256：495中所述的确定方法，将得自实施例1.2.A中所述的免疫接种大鼠的脾细胞与SP2/O-细胞以2:1的比融合，以生成杂交瘤。将融合产物在含有偶氮丝氨酸和次黄嘌呤的选择培养基中在96孔板中以1.5x10⁵脾细胞/孔的密度铺平板。融合后7 – 10天，观察到肉眼可见的杂交瘤集落。就针对人RGMA的抗体的存在，通过直接ELISA（参见实施例2）测试来自含有杂交瘤克隆的每个孔的上清液。在FACS中针对表达人和/或大鼠RGMA的稳定转染的HEK293细胞测试ELISA阳性细胞系。随后就与大鼠RGMA的交叉反应性和与HuRGMA 47-168融合蛋白的ELISA结合，在直接ELISA中测试这些大鼠杂交瘤细胞系。

表7：抗RGMA大鼠单克隆抗体的结合

实施例2：mABs 5F9和8D1的直接ELISA结合。

如图1A中所示，如上文节段（i）中所述，MABs 5F9和8D1以相似滴度与hRGM A结合。MAB 5F9也显示在ELISA中与大鼠RGM A结合，而8D1不能与大鼠RGM A结合（数据未显示）。图1B显示MABs 5F9和8D1在FACS中与超表达hRGM A的HEK293细胞结合。图1C显示5F9而不是8D1能够在FACS中结合超表达大鼠RGM A的BAF3细胞。FACS如节段（ii）中所述执行。

固相ELISA测定用于在竞争性hRGM A-neogenin结合测定中评估MAB 5F9结合。如本申请的节段（iii）中所述制备且使用ELISA板。hRGM A与5F9抗体一起以0.5 µg/ml的浓度在37℃加入1小时。MAB 5F9以下述浓度使用：1.25 µg/ml；0.63 µg/ml；0.32 µg/ml；0.16 µg/ml；0.08 µg/ml；0.04 µg/ml；0.02 µg/ml；0.01 µg/ml。使用生物素标记的抗fc抗体和链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物显现hRGM A的结合。使用Anthos光度计在450 nm的波长处分析（OD测定）板。如图2中所示，3个最高抗体浓度剂量依赖性抑制全长人RGM A与Neogenin的结合。

固相ELISA测定也用于在竞争性hRGM A-BMP-4结合测定中评估MAB 5F9。如本申请的节段（iv）中所述制备且使用ELISA板。hRGM A与5F9抗体一起以0.5 µg/ml的浓度在37℃加入1小时。MAB 5F9以下述浓度使用：1.25 µg/ml；0.63 µg/ml；0.32 µg/ml；0.16 µg/ml；0.08 µg/ml；0.04 µg/ml；0.02 µg/ml；0.01 µg/ml。使用生物素标记的抗fc抗体和链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物显现hRGM A的结合。使用Anthos光度计在450 nm的波长处分析（OD测定）板。如图3中所示，4个最高抗体浓度剂量依赖性抑制全长人RGM A与BMP-4的结合。

固相ELISA测定也用于评估片段0（47–168）hRGM A与BMP-4的MAB 5F9结合抑制。将ELISA板在37℃用2.5 µg/ml浓度的人重组BMP-4蛋白质包被1小时。hRGM A轻链（片段0，47-168）与5F9抗体一起以0.5 µg/ml的浓度在37℃加入1小时。MAB 5F9以下述浓度使用：1.25µg/ml；0.63 µg/ml；0.32 µg/ml；0.16 µg/ml；0.08 µg/ml；0.04 µg/ml；0.02 µg/ml；0.01µg/ml。使用生物素标记的抗fc抗体和链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物显现hRGM A的结合。使用Anthos光度计在450 nm的波长处分析（OD测定）板。图4描述了1.25 µg/ml、0.63µg/ml和0.32 µg/ml的抗体浓度剂量依赖性抑制人RGM A轻链与BMP-4的结合。

固相ELISA测定也用于在竞争性hRGM A-BMP-2结合测定中评估MAB 5F9结合。如本申请的节段（v）中所述制备且使用ELISA板。全长hRGM A与5F9抗体一起以0.5 µg/ml的浓度在37℃加入1小时。MAB 5F9以下述浓度使用：5 µg/ml；2.5 µg/ml；1.25 µg/ml；0.63 µg/ml；0.32 µg/ml；0.16 µg/ml。使用生物素标记的抗fc抗体和链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物显现hRGM A的结合。使用Anthos光度计在450 nm的波长处分析（OD测定）板。图5描述了抗体浓度5 µg/ml、2.5 µg/ml、1.25 µg/ml、0.63 µg/ml抑制全长人RGM A与BMP-2的结合。

固相ELISA测定也用于在hRGM A–Neogenin、hRGM A–BMP-2和hRGM A-BMP-4结合测定中评估MABs 5F9和8D1。（图9）如所述的，将ELISA板在37℃用2.5 µg/ml浓度的His标记的人Neogenin蛋白质的细胞外结构域或用2.5 µg/ml Bmp-2或BMP-4包被1小时。全长fc缀合的hRGM A与抗体一起以0.5 µg/ml的浓度在37℃加入1小时。MABs 5F9和8D1以下述浓度使用：5 µg/ml；2.5 µg/ml；1.25 µg/ml；0.63 µg/ml；0.32 µg/ml；0.16 µg/ml；0.08 µg/ml。使用生物素标记的抗fc抗体和链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物显现hRGM A的结合。使用Anthos光度计在450 nm的波长处分析（OD测定）板。如图9中所示，大鼠单克隆抗体8D1抑制或减少人RGM A与BMP-2和BMP-4的结合，但不能抑制其与Neogenin的结合。

实施例3：在具有分化的人NTera神经元的聚集体的神经突生长测定中的mAb 5F9 活性

如本申请的方法节段（vi）中所述获得且培养Ntera细胞。在具有分化的人NTera神经元的聚集体的神经突生长测定中，mAb 5F9中和人RGM A蛋白质的有力fc缀合的轻链（氨基酸47 – 168）的神经突长出抑制活性。如图6中所示，在不存在抑制性RGM A蛋白质或片段的情况下和在长出刺激基底层粘连蛋白的存在下，神经元NTera聚集体显示长出神经突的广泛和密集网络（A）。还如图6中所示，hRGM A轻链的存在极大地减少NTera神经突的数目、密度和长度，证明hRGM A片段的有力抑制活性。离开聚集体的少数神经突是短和紧密成束的（B）。图6的部分C-E显示加入培养物中的增加浓度的MAB 5F9剂量依赖性中和或去抑制hRGM A轻链片段的神经突生长抑制活性。伴随增加的MAB浓度，NTera神经元聚集体的长出完全恢复，尽管RGM A抑制剂存在（C：0.1 µg/ml MAB 5F9；D：1 µg/ml MAB 5F9；E：10 µg/mlMAB 5F9）。

执行在具有人NTera聚集体的神经突生长测定中MAB 5F9的中和活性的定量分析，以测试人RGM A蛋白质的有力fc缀合的轻链抑制片段（氨基酸47–168）。通过用双苯甲乙胺染色聚集体并且随后拍照自动分析培养物的长出。染色仅标记聚集体而不是长出的神经突。然而，这些用针对β3-微管蛋白的抗体和荧光体标记的二次抗体进行染色。通过计算神经突长出指数自动测定神经突长出，其为通过从聚集体及其突起的β3-微管蛋白染色面积中扣除细胞体的面积测定的指数。随后如Lingor等人J. Neurochem. 103：181–189，2007中所述，将这个因子除以细胞体的面积。图7显示在具有人Ntera聚集体的神经突长出测定中，MAB 5F9剂量依赖性（0.1-10.0 µg）中和fc缀合的、有力hRGM A抑制剂片段（片段0，47–168；10 µg）的长出抑制活性。

实施例4：在hRGM A/胶原I条纹中的mAb 5F9活性。

如本申请的节段（vii）中所述培养且使用SH-SY5Y细胞。如本申请的节段（viii）中所述制备具有RGM A和胶原I的条纹玻璃盖玻片。根据文献中所述的方案（Knoell等人Nature Protocols 2：1216–1224，2007），产生具有hRGM A/胶原I和胶原I的交替条纹的毯状物（carpet）用于实验。在不存在5F9 MAB（A）的情况下，神经元SH-SY5Y细胞显示关于胶原I条纹的明确优选，其中超过90％的细胞优选胶原I条纹超过hRGM A条纹。伴随增加浓度的MAB 5F9，神经元SH-SY5Y细胞优选hRGM A条纹超过胶原I条纹（B-E）。在使用最高MAB浓度时（E）），与胶原I条纹比较，SH-SY5Y神经元显示关于hRGM A条纹的强烈优选（参见图8）。这可以解释为5F9 MAB的独特特征，因为它以吸引活性转化RGM A的抑制性质。在增加浓度的5F9的存在下，神经元细胞优选迁移且在RGM A基底上生长，而不是在允许基底如胶原I上。此类独特特征对于单克隆抗体先前从未描述过。

实施例5：CDR移植抗体的构建

通过应用本领域众所周知的标准方法，将单克隆抗体5F9的VH和VL链的CDR序列（参见上表5）移植到不同的人重和轻链受体序列内。基于与本发明的单克隆抗体5F9的VH和VL序列的序列VH和VL比对，选择下述已知人序列：

a）VH3-48、VH3-33和VH3-23以及连接序列hJH3、hJH4和hJH6用于构建重链受体序列（根据上表3）；

b）A17和A18以及hJK2用于构建轻链受体序列（根据上表4）。

通过将5F9的相应VH和VL CDRs移植到所述受体序列内，制备下述CDR移植、人源化、修饰的VH和VL序列（还参见上表6）：VH 5F9.1-GL、VH 5F9.2-GL、VH 5F9.3-GL、VH5F9.4-GL、VH 5F9.5-GL、VH 5F9.6-GL、VH 5F9.7-GL和VH 5F9.8-GL；VL 5F9.1-GL、VL5F9.2-GL和VL 5F9.3-GL。

实施例6：在CDR移植抗体中构架回复突变的构建

为了生成人源化抗体构架回复突变，通过可变结构域的从头合成和/或使用诱变引物和PCR，和本领域众所周知的方法，将突变引入如根据实施例5制备的CDR移植抗体序列内。如下对于每个CDR移植物构建回复突变和其他突变的不同组合。

对于重链VH 5F9.1-GL、VH 5F9.2-GL和VH 5F9.3-GL，下述Vernier和VH/VL界面连接残基中的一个或多个如下进行回复突变：V37→I、V48→I、S49→G和/或R98→K

对于重链VH 5F9.4-GL、VH 5F9.5-GL和VH 5F9.6-GL，下述Vernier和VH/VL界面连接残基中的一个或多个如下进行回复突变：V37→I、V48→I、A49→G、R98→K。

对于重链VH 5F9.7-GL、VH 5F9.8-GL和VH 5F9.9-GL，下述Vernier和VH/VL界面连接残基中的一个或多个如下进行回复突变：V37→I、V48→I、S49→G。

另外的突变包括下述：

对于重链VH 5F9.1-GL、VH 5F9.2-GL和VH 5F9.3-GL：D88→A，

对于重链VH 5F9.4-GL、VH 5F9.5-GL和VH 5F9.6-GL：Q1→E和

对于重链VH 5F9.7-GL、VH 5F9.8-GL和VH 5F9.9-GL：L5→V。

对于轻链VL 5F9.1-GL，下述Vernier和VH/VL界面连接残基中的一个或多个如下进行回复突变：I2→V、M4→L、Y41→F。

对于轻链VL 5F9.2-GL，下述Vernier和VH/VL界面连接残基中的一个或多个如下进行回复突变：M4→L、R51→L。

对于轻链VL 5F9.3-GL，下述Vernier和VH/VL界面连接残基中的一个或多个如下进行回复突变：M4→L、Y41→F。

实施例7：重组人源化抗RGMA抗体的构建和表达

如上文节段ix中所述，将具有含构架回复突变的重和轻链的pHybE表达载体共转染到293-6E细胞内，以瞬时产生全长人源化抗体。通过可变结构域的从头合成和/或使用诱变引物和PCR，和本领域众所周知的方法，将突变引入如根据实施例5制备的CDR移植抗体序列内。人源化抗体的VH和VL区的氨基酸序列公开于表8中。

具体地，对于重链：

VH 5F9.1、VH 5F9.5和VH 5F9.9含有VH 5F9.4-GL伴随Q1→E突变。

VH 5F9.2、VH 5F9.6、VH 5F9.10、VH 5F9.19、VH 5F9.20、VH 5F9.21和VH 5F9.22含有VH 5F9.4-GL伴随Q1→E突变和下述Vernier和VH/VL界面连接残基回复突变：V37→I、V48→I、A49→G、R98→K。

VH 5F9.3、VH 5F9.7和VH 5F9.11含有VH 5F9.7-GL伴随L5→V突变。VH 5F9.4、VH5F9.8、VH 5F9.12、VH 5F9.23、VH 5F9.24、VH 5F9.25和VH 5F9.26含有VH 5F9.7-GL伴随L5→V突变和下述Vernier和VH/VL界面连接残基回复突变：V37→I、V48→I、S49→G。

对于轻链：

VL 5F9.1、VL 5F9.2、VL 5F9.3和VL 5F9.4等同于VL 5F9.1-GL。

VL 5F9.5、VL 5F9.6、VL 5F9.7和VL 5F9.8等同于VL 5F9.2-GL。

VL 5F9.9、VL 5F9.10、VL 5F9.11和VL 5F9.12等同于VL 5F9.3-GL。

VL 5F9.19和VL 5F9.23含有VL 5F9.2-GL伴随下述Vernier和VH/VL界面连接残基回复突变：M4→L、R51→L。VL 5F9.20和VL 5F9.24含有VL 5F9.2-GL伴随下述Vernier和VH/VL界面连接残基回复突变：M4→L。

VL 5F9.21和VL 5F9.25含有VL 5F9.3-GL伴随下述Vernier和VH/VL界面连接残基回复突变：M4→L、Y41→F。VL 5F9.22和VL 5F9.26含有VL 5F9.3-GL伴随下述Vernier和VH/VL界面连接残基回复突变：M4→L。

表8：人源化抗体的表达

实施例8：使用竞争性ELISA表征人源化5F9抗体

将ELISA板（Costar 3369）用50 μl/孔溶于0.2 M碳酸钠碳酸氢盐缓冲液，pH 9.4的0.25 μg/ml hRGMA在4℃包被过夜，用洗涤缓冲液（含有0.1 ％Tween 20的PBS）洗涤，并且用200 μl/孔2％脱脂奶粉的PBS溶液在室温封闭1小时。在用洗涤缓冲液洗涤后，一式两份地加入生物素化的嵌合5F9（0.1 μg/ml终浓度）和未标记的竞争者测试抗体的混合物，所述竞争者测试抗体以50 μg/ml终浓度起始且在50 μl/孔ELISA缓冲液中系列稀释。将板在室温温育1小时且用洗涤缓冲液洗涤后，使用100 μl/孔HRP缀合的链霉抗生物素蛋白（Fitzgerald）在ELISA缓冲液中的1:10,000稀释物检测结合的抗体。在室温温育1小时和用洗涤缓冲液洗涤后，通过加入100 μl/孔TMB缓冲液（Zymed）执行显色。在室温温育15分钟后，通过加入50 μl/孔1N盐酸停止显色。吸光度在490 nm处读取。

表9显示了使用计算机软件GraphPad Prism（GraphPad Software Inc.，SanDiego，CA）获得的人源化5F9抗体的IC₅₀值。

表9：在竞争性ELISA中人源化5F9抗体的IC50值

实施例9：使用BIACORE技术的嵌合和人源化抗体的亲和力测定

BIACORE测定（Biacore，Inc，Piscataway，NJ）测定抗体的亲和力伴随结合、离开速率常数的动力学测量。使用Biacore® 3000仪器（Biacore® AB，Uppsala，瑞典），在25℃使用运行的HBS-EP（10 mM HEPES [pH 7.4]、150 mM NaCl、3 mM EDTA和0.005 ％表面活性剂P20），通过基于表面等离振子共振的测量测定抗体与重组纯化的人RGMA的结合。所有化学制品都得自Biacore® AB（Uppsala，瑞典）。根据制造商的说明书和以25 μg/ml的程序，使用标准胺偶联试剂盒，将在10 mM乙酸钠（pH 4.5）中稀释的约5000 RU山羊抗人IgG,（Fcγ）片段特异性多克隆抗体（Pierce Biotechnology Inc，Rockford，IL）直接固定在CM5研究级别生物传感器芯片上。用乙醇胺封闭在生物传感器表面上的未反应的部分。在流动池2和4中修饰的羧甲基葡聚糖表面用作反应表面。在流动池1和3中不含山羊抗人IgG的未修饰的羧甲基葡聚糖用作参考表面。纯化的抗体在HEPES缓冲盐水中稀释用于跨越山羊抗人IgG特异性反应表面捕获。待作为配体捕获的人抗体（25 μg/ml）以5 μl/分钟的流速注射经过反应基质。在25 μl/分钟的恒定流速下测定结合和解离速率常数k_on（单位M^-1s^-1）和k_off（单位s^-1）。通过在范围为0.39–50 nM的10个不同抗原浓度做出动力学结合测量衍生速率常数。对于动力学分析，使用Bioevaluation 4.0.1软件，对于所有8次注射的结合和解离相同时拟合衍生自1:1兰米尔（Langmuir）结合模型的速率方程（使用总体拟合分析）。随后通过下式由动力学速率常数计算在人源化抗体和重组纯化的人RGMA之间的反应的平衡解离常数（单位M）：K_D = k_off/k_on。

表9：嵌合和人源化抗RGMA单克隆抗体的亲和力

实施例10：在神经元SH-SY5Y趋化现象测定中，人源化5F9抗体中和人RGM A的化学 排斥活性

趋化现象测定测量细胞响应可扩散因子的趋化性行为，所述可扩散因子可以发挥化学吸引或化学排斥活性。RGM A已描述为以膜结合（接触依赖性排斥）和可溶、可扩散形式（化学排斥性）起作用的蛋白质，并且因此已在hRGM A趋化现象测定中评估。为此，使用携带RGM受体Neogenin的RGM A敏感性人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y（Schaffar等人J.Neurochemistry：107：418–431，2008）。SH-SY5Y细胞在补充有10％胎牛血清和1％非必需氨基酸（MEM-NEAA）的Earle’s Balanced Salt Solution/F12（EBSS/F12）培养基中生长。对于神经突长出的诱导，在补充有10 µM视黄酸（RA）的培养基中培养细胞。5-6小时后，将细胞胰蛋白酶处理且计数用于在24孔Boyden室（BD Falcon 351185，HTS Multiwell System）中铺平板。将500 µl细胞悬液（对应于1x10⁵细胞）加入每个孔的内圈。这个内圈通过具有8 µm孔径的PET膜与每个孔的更大外圈分开。将600 µl培养基+/- RGM A +/-抗体吸取到外圈内，并且将细胞在多孔Boyden室中在37℃培养过夜。在温育后，抽吸培养基并且替换为固定剂（2％低聚甲醛。固定在室温继续2小时，并且在用PBS的几个洗涤步骤后，使用含有0,1％Triton-X-100的PBS执行PBS渗透化处理（15分钟，RT）。通过将其在黑暗中在Alexa Fluor488鬼笔环肽1:100（Invitrogen A12379）和双苯甲亚胺（H332456）1：100的溶液中温育1小时完成细胞的染色。在用PBS的2个洗涤步骤后，通过PBS填充培养物，通过石蜡密封且贮存于黑暗中用于用荧光显微镜（Zeiss Axiovert）分析。

在不存在hRGM A的情况下，细胞通过膜孔迁移，并且可以在固定和染色后计数。仅计数附着至膜底部的那些细胞，因为这些细胞已迁移通过PET膜。在固定程序前，小心地去除在膜的上侧上的细胞。这个趋化现象测定证明hRGM A的存在使迁移通过膜的SH-SY5Y细胞数目显著减少超过80％。大鼠单克隆5F9、嵌合人-大鼠5F9和人源化5F9而不是同种型对照大鼠单克隆抗体（p21）以10 µg/ml部分或完全中和hRGM A的化学排斥活性，表现为在膜底部上发现的更多数目的细胞（图10）。

实施例11：在视神经损伤的大鼠模型中，5F9诱导压伤、损害的有髓视神经轴突的 再生

视神经压伤（或视神经损伤）模型提供了测试多种物质的动物模型，所述物质刺激视神经纤维的再生且减少视网膜神经节细胞的大量细胞死亡。

实验在得自Charles River（D）Laboratories（德国）的成年雄性Sprague Dawley和雄性Wistar大鼠中执行。将动物维持在单个笼中，12 ：12小时光/暗周期，食物和水随意。视神经压伤通过最低限度前路手术始终仅在左眼上执行。这是视神经损伤的最低限度侵入性方法，并且根据人前路视力手术法由我们开发。在操作程序前和过程中，使用七氟烷（Abbott GmbH Co. & KG，Delkenheim，德国）通过吸入麻醉使动物麻醉，并且通过对于四肢使用爪夹（jawclamp）和胶带固定在手术台上。通过将动物固定在加热垫上预防体温的下降。对于大鼠视神经的前路压伤手术，小心地使左眼脱离韧带和结缔组织。作为第一个步骤，执行在眼外角中的邻近组织的显微手术切口（2–3 mm）。随后通过使用一对钳子暴露视神经，以将眼肌和泪腺移到一旁，从而不伤害它们。在接下来的步骤，通过使用显微手术剪纵向打开脑膜以暴露视神经。

这导致眼的更高活动性且使得眼的横向转动和对其左侧视神经的接近成为可能。使用设为提供固定最大压力20-30秒的一对钳子，将视神经在眼后损伤约1–3 mm。特别小心不损害对于眼的血管供应。

a）抗体和缓冲溶液的局部施用

在视神经的压伤损伤后，雄性Sprague Dawley大鼠用5F9抗体（n = 10只动物）、8D1对照抗体（n = 10只动物）或媒介物对照PBS（n = 10只动物）进行局部处理。实验者对于不同治疗组是不知情的。对于局部抗体应用，将小明胶海绵小片（长：2,5 mm，宽：2,5 mm，高：2,5 mm）用20 µl 10 mg/ml抗体溶液或20 µl PBS浸湿，并且直接置于视神经病损部位附近。在最低限度侵入性手术和抗体应用后，将动物置于在固定在加热器上的干净笼中的纸巾上，以控制体温直至它们开始移动。将含有抗生素（Gentamytrex，Dr. Mann Pharma）的软膏应用于眼上，以避免细菌感染和巩膜的干燥。在手术后直接和随后每天2次共3天时期，将卡洛芬（Rimadyl，5 mg/kg，Pfizer GmbH，Karlsruhe）腹膜内应用于手术后疼痛治疗。在手术后直接数小时和在接下来数天中定期观察且控制动物，以确保所有动物都存活且从麻醉和手术中恢复。手术和抗体/媒介物应用后5周，将动物用剂量过多的戊巴比妥（40–60mg/kg）麻醉，并且通过4％低聚甲醛溶液注射到心脏内进行灌注。将视神经分离且转移到4％低聚甲醛溶液内，在室温1小时，以确保组织的合适固定。在固定后，将大鼠视神经贮存于30％蔗糖溶液中过夜（4℃）。在第二天，将视神经包埋在Tissue Tek中，冷冻且使用Cryostat进行具有16 µm厚度的纵向切片。

对于免疫染色，将视神经切片用冷（-20℃）丙酮固定（10分钟），用Tris缓冲盐水（TBS，Fluka 93312）洗涤3x（5分钟），并且封闭且用含有5％牛血清白蛋白和1％Triton-X-100（30分钟）的TBS在室温渗透化处理。通过用TBS的2个分开洗涤步骤（各5分钟）去除残留BSA和去垢剂。将切片与在5 ％BSA/TBS溶液中1:100稀释的多克隆兔抗GAP-43抗体（Abcam，ab 7562）一起在室温温育1小时。在用TBS、0,1 ％Tween的3个洗涤步骤后，将切片与AlexaFluor 488-缀合的山羊抗兔二次抗体（Molecular Probes A11034）一起在室温温育1小时，所述山羊抗兔二次抗体在含有双苯甲亚胺（H33258，50 µg/ml）的1:100稀释物的5 ％BSA/TBS中1：1000稀释，以显现细胞核。在包埋前，将染色的切片用TBS 0,1 ％Tween（每个步骤5分钟）和蒸馏水洗涤3次。将切片包埋在Fluoromount G中，通过盖玻片覆盖，并且贮存于黑暗中用于显微镜记录。

使用Zeiss荧光显微镜，使用Zeiss Axiovison软件贮存染色的纵向切片的图像（图11）。使用Photoshop Image Analysis软件（Adobe），将每根神经的单个照片固定用于分析。使用视神经的复合图像，以2种不同方式完成定量分析。使用Axiovision软件测量在病损部位处的GAP-43阳性面积（图12B）。不依赖于这个第一次定量分析，在4个不同区域中计数单根再生纤维（GAP-43阳性的）：超过压伤部位0-200 µm、200–400 µm、400–600 µm和600–1200 µm。借助于Graphpad Prism软件完成数据分析和数据的统计评估（图12A）。

b）抗体和缓冲溶液的全身性施用

对于全身性抗体递送，雄性Wistar大鼠用5F9抗体（n = 10只动物）或媒介物对照PBS（n = 10只动物）进行全身性（腹膜内，ip）或静脉内，iv）处理。将动物注射2次，并且注射在第0天时在诱导神经压伤后不久和在压伤后第21天时完成。给予的抗体剂量是在第0天时2 mg/kg和在第21天时10 mg/kg。在压伤损伤和组织分离后5周杀死动物，如上所述完成切片的制备、染色和定量分析。如前，实验者对于2个不同处理组是不知情的。大鼠视神经的复合图像显示于图13中。在5F9处理的动物中（A），与用PBS处理的对照动物（B）比较，许多GAP-43阳性纤维延伸超过压伤部位。压伤部位定位于左侧边缘处，并且再生纤维用针对GAP-43的抗体染色。在5F9处理的动物而不是PBS动物中在视神经的上和下边上观察到许多纤维。

5F9而不是媒介物对照PBS显著增加再生GAP-43阳性纤维的数目。与在媒介物处理的动物中比较，在距离300 µm至1800 µm处在用5F9处理的动物中发现显著更多的纤维（p <0.001）。动物在第0天和第21天时分别用5F9以2 mg/kg和10 mg/kg进行处理。抗体或媒介物腹膜内或静脉内给予。数据来自9只动物/组的分析。分析每只动物3个系列的冷冻切片。（图14A）。

在第二个实验中，雄性Wistar大鼠在视神经损伤后用5F9抗体（n = 10只动物）、8D1对照抗体（n = 10只动物）或媒介物对照PBS（n = 10只动物）进行全身性（静脉内）处理。大鼠用静脉内给予的2 mg/kg抗体每周注射1次，并且注射在视神经压伤后立即开始。所有大鼠接受4次注射，并且动物在压伤损伤后5周实施安乐死。实验者是不知情的，并且如上所述完成组织加工和定量分析。5F9而不是媒介物对照PBS显著增加再生GAP-43阳性纤维的数目。与在媒介物或对照抗体处理的动物中比较，在距离200 µm至1400 µm处在用5F9处理的动物中发现显著更多的纤维（p < 0.001）。在第0天时起始，动物用5F9（2 mg/kg/剂量）、对照抗体8D1（2 mg/kg/剂量）或PBS每周静脉内处理一次，共4周。（图14B）。

实施例12：在视神经损伤的大鼠模型中，5F9诱导压伤、损害的视神经轴突的髓鞘 再生

关于少突胶质细胞和髓磷脂的标记是髓磷脂碱蛋白（MBP）。针对MBP的抗体用于回答在不同治疗组中在髓鞘再生中是否存在差异的问题。为了显现髓鞘再生的过程，将全身性处理的动物的视神经切片用冷（-20℃）丙酮固定（10分钟），用Tris缓冲盐水（TBS，Fluka93312）洗涤3x（5分钟），并且封闭且用含有5％牛血清白蛋白和1％Triton-X-100（30分钟）的TBS在室温渗透化处理。通过用TBS的2个分开洗涤步骤（各5分钟）去除残留BSA和去垢剂。将切片与在5 ％BSA/TBS溶液中1:50稀释的多克隆兔抗MBP抗体（Abcam，ab 2404）一起在4℃温育3小时或过夜。在用TBS、0,1 ％Tween的3个洗涤步骤后，将切片与Alexa Fluor 488-缀合的山羊抗兔二次抗体（Molecular Probes A11034）一起在室温温育1小时，所述山羊抗兔二次抗体在含有双苯甲亚胺（H33258，50 µg/ml）的1:100稀释物的5 ％BSA/TBS中1：1000稀释，以显现细胞核。在包埋前，将染色的切片用TBS 0,1 ％Tween（每个步骤5分钟）和蒸馏水洗涤3次。将切片包埋在Fluoromount G中，通过盖玻片覆盖，并且贮存于黑暗中用于显微镜记录。

使用Zeiss荧光显微镜，使用Zeiss Axiovison软件贮存染色的纵向切片的图像。使用Photoshop Image Analysis软件（Adobe），将每根神经的单个照片固定用于分析。使用视神经的复合图像，以2种不同方式完成定量分析。使用Axiovision软件测量在病损部位处的MBP阳性面积。借助于Graphpad Prism软件完成数据分析和数据的统计评估。

动物在第0天和第21天时分别用5F9以2 mg/kg和10 mg/kg进行处理。抗体或媒介物腹膜内或静脉内给予。大鼠视神经的复合图像。

使用针对髓磷脂标记髓磷脂碱蛋白MBP的抗体显现髓鞘形成。压伤部位定位于复合神经的中间，并且该区域在媒介物处理的对照动物中是空的（A和B）。在5F9处理的动物中（C和D），在视神经的中间区域（压伤中心）观察到许多MBP阳性结构。（图15）。

使用针对髓磷脂标记髓磷脂碱蛋白MBP的抗体显现髓鞘形成。使用ZeissAxiovison软件测量MBP面积。M1和M2是2次独立测量，并且M是平均测量的MPB阳性面积。5F9使视神经压伤部位的MBP面积显著增加（与媒介物对照比较，p < 0.001）3,5倍。（图16）。

实施例13：5F9保护视网膜神经纤维层（RNLF）不受变性且在变性RNFL中诱导视网 膜神经元的萌芽

为了观察RNFL变性的保护和视网膜神经元萌芽的诱导，建立了新实验室测定法。所述方法基于外植且分析来自大鼠眼的成年大鼠视网膜，所述大鼠具有视神经压伤（如上文实施例11中所述）且用抗体5F9、对照抗体p21（大鼠IgG1单克隆抗体）或PBS媒介物全身性处理。为了执行这个实验，在诱导视神经压伤后立即且随后以1周间隔（共5次；以2 mg/kg或10 mg/kg剂量的抗体），具有视神经压伤的大鼠用Abs或PBS进行处理。

a）视网膜制备和免疫荧光染色：

将动物用七氟烷（8 ％；Abbott）进行深度麻醉，随后通过打开胸廓且用4％低聚甲醛（PFA）溶液灌注通过左心室立即处死。将眼切断结缔组织，调整且置于4 ％PFA中，直至发生视网膜的制备。

视网膜的制备在Hank’s Balanced Salt Solution（HBSS，无镁和钙；Invitrogen，#14170070）中执行。通过镊子将眼固定在结缔组织上，并且在恰在角膜周围的巩膜中做出圆形切口。

通过开口小心地取出晶状体和睫状体，在大多数情况下连同视网膜一起取出。在视网膜仍附着至巩膜的情况下 – 将它轻轻分离且拔出。

将视网膜的半球在4个点中切割，打开且在灰色硝酸纤维素膜（Sartorius，#13006-50-N）上展开。如果需要，在其上具有视网膜的膜允许风干5-10秒。

其后，将在膜上的视网膜在+4℃置于10％中性磷酸盐缓冲甲醛溶液（pH 7.3；Fisher Scientific，#F/1520/21）中，直至执行免疫荧光染色。

根据下述方案执行染色：

将视网膜制备物用TBS洗涤，随后为封闭和用5 ％BSA、1 ％Triton X-100的TBS溶液渗透化处理30分钟，并且再次用TBS洗涤。在室温在黑暗中加入初次抗体（在TBS、5 ％BSA中的单克隆Ab TUJ-1，小鼠抗βIII微管蛋白Ab，AbCam，# ab14545；1:500稀释度）1小时，随后用TBS、0.1 ％Tween 20洗涤。随后在室温在黑暗中加入二次抗体（驴抗小鼠Cy3；JacksonImmunoResearch（Dianova）715-165-151，1:1000稀释度）和双苯甲亚胺（50 µg/ml 1:100稀释度）（在TBS、5 ％BSA中）1小时，随后用TBS、0.1 ％Tween 20洗涤，且用脱盐H₂O洗涤。随后将制备物用Fluoromount G固定且贮存于+4℃在黑暗中。

b）研究5F9对眼中的视网膜纤维（RNFL）的保护作用

使用Axiovision软件，选择每个视网膜的随机选择的图像（n = 12），并且对于每个图像测定神经纤维的数目。

对于实验，具有压伤视神经的3个视网膜用于每个组：5F9 mab组、p21对照mab组和PBS媒介物组。使用GraphPad prism程序执行数据分析和统计分析。

结果在图17中举例说明。在用本发明的5F9抗体全身性处理的动物的视网膜中观察到显著更高密度的神经纤维束。

c）研究5F9对眼中的视网膜神经元萌芽的作用

使用Axiovision软件，选择每个外植视网膜的随机选择的图像（n = 12），并且对于每个图像测定萌芽神经元的数目。

对于实验，具有压伤视神经的3个视网膜用于每个组：5F9 mab组、p21对照mab组和PBS媒介物组。使用GraphPad prism程序执行数据分析和统计分析。

结果在图18中举例说明。在用本发明的5F9抗体全身性处理的动物的视网膜中观察到显著更高数目的萌芽视网膜内神经元。

序列表

<110> ABBVIE德国有限责任两合公司

<120> 用于在视网膜神经纤维层变性治疗中使用的针对RGM A蛋白质的单克隆抗体

<130> M/50237

<160> 68

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1353

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1353)

<400> 1

atg cag ccg cca agg gag agg cta gtg gta aca ggc cga gct gga tgg 48

Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp

1 5 10 15

atg ggt atg ggg aga ggg gca gga cgt tca gcc ctg gga ttc tgg ccg 96

Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro

20 25 30

acc ctc gcc ttc ctt ctc tgc agc ttc ccc gca gcc acc tcc ccg tgc 144

Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys

35 40 45

aag atc ctc aag tgc aac tct gag ttc tgg agc gcc acg tcg ggc agc 192

Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser

50 55 60

cac gcc cca gcc tca gac gac acc ccc gag ttc tgt gca gcc ttg cgc 240

His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg

65 70 75 80

agc tac gcc ctg tgc acg cgg cgg acg gcc cgc acc tgc cgg ggt gac 288

Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp

85 90 95

ctg gcc tac cac tcg gcc gtc cat ggc ata gag gac ctc atg agc cag 336

Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln

100 105 110

cac aac tgc tcc aag gat ggc ccc acc tcg cag cca cgc ctg cgc acg 384

His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Leu Arg Thr

115 120 125

ctc cca ccg gcc gga gac agc cag gag cgc tcg gac agc ccc gag atc 432

Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile

130 135 140

tgc cat tac gag aag agc ttt cac aag cac tcg gcc acc ccc aac tac 480

Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr

145 150 155 160

acg cac tgt ggc ctc ttc ggg gac cca cac ctc agg act ttc acc gac 528

Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp

165 170 175

cgc ttc cag acc tgc aag gtg cag ggc gcc tgg ccg ctc atc gac aat 576

Arg Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn

180 185 190

aat tac ctg aac gtg cag gcc acc aac acg cct gtg ctg ccc ggc tca 624

Asn Tyr Leu Asn Val Gln Ala Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser

195 200 205

gcg gcc act gcc acc agc aag ctc acc atc atc ttc aag aac ttc cag 672

Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln

210 215 220

gag tgt gtg gac cag aag gtg tac cag gct gag atg gac gag ctc ccg 720

Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro

225 230 235 240

gcc gcc ttc gtg gat ggc tct aag aac ggt ggg gac aag cac ggg gcc 768

Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala

245 250 255

aac agc ctg aag atc act gag aag gtg tca ggc cag cac gtg gag atc 816

Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile

260 265 270

cag gcc aag tac atc ggc acc acc atc gtg gtg cgc cag gtg ggc cgc 864

Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg

275 280 285

tac ctg acc ttt gcc gtc cgc atg cca gag gaa gtg gtc aat gct gtg 912

Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val

290 295 300

gag gac tgg gac agc cag ggt ctc tac ctc tgc ctg cgg ggc tgc ccc 960

Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro

305 310 315 320

ctc aac cag cag atc gac ttc cag gcc ttc cac acc aat gct gag ggc 1008

Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr Asn Ala Glu Gly

325 330 335

acc ggt gcc cgc agg ctg gca gcc gcc agc cct gca ccc aca gcc ccc 1056

Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro

340 345 350

gag acc ttc cca tac gag aca gcc gtg gcc aag tgc aag gag aag ctg 1104

Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu

355 360 365

ccg gtg gag gac ctg tac tac cag gcc tgc gtc ttc gac ctc ctc acc 1152

Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr

370 375 380

acg ggc gac gtg aac ttc aca ctg gcc gcc tac tac gcg ttg gag gat 1200

Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp

385 390 395 400

gtc aag atg ctc cac tcc aac aaa gac aaa ctg cac ctg tat gag agg 1248

Val Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Tyr Glu Arg

405 410 415

act cgg gac ctg cca ggc agg gcg gct gcg ggg ctg ccc ctg gcc ccc 1296

Thr Arg Asp Leu Pro Gly Arg Ala Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ala Pro

420 425 430

cgg ccc ctc ctg ggc gcc ctc gtc ccg ctc ctg gcc ctg ctc cct gtg 1344

Arg Pro Leu Leu Gly Ala Leu Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Pro Val

435 440 445

ttc tgc tag 1353

Phe Cys

450

<210> 2

<211> 450

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp

1 5 10 15

Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro

20 25 30

Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys

35 40 45

Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser

50 55 60

His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg

65 70 75 80

Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp

85 90 95

Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln

100 105 110

His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Leu Arg Thr

115 120 125

Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile

130 135 140

Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr

145 150 155 160

Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp

165 170 175

Arg Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn

180 185 190

Asn Tyr Leu Asn Val Gln Ala Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser

195 200 205

Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln

210 215 220

Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro

225 230 235 240

Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala

245 250 255

Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile

260 265 270

Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg

275 280 285

Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val

290 295 300

Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro

305 310 315 320

Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr Asn Ala Glu Gly

325 330 335

Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro

340 345 350

Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu

355 360 365

Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr

370 375 380

Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp

385 390 395 400

Val Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Tyr Glu Arg

405 410 415

Thr Arg Asp Leu Pro Gly Arg Ala Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ala Pro

420 425 430

Arg Pro Leu Leu Gly Ala Leu Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Pro Val

435 440 445

Phe Cys

450

<210> 3

<211> 1929

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> hRGMA fc

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1929)

<220>

<221> sig_peptide

<222> (1)..(102)

<220>

<221> misc_feature

<222> (103)..(1230)

<223> hRGMA片段47-422

<220>

<221> misc_feature

<222> (1231)..(1929)

<223> fc部分

<400> 3

atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca 48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

ggt tcc act ggt gac gcg gcc cag ccg gcc agg cgc gcg cgc cgt acg 96

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr

20 25 30

aag ctt ccg tgc aag atc ctc aag tgc aac tct gag ttc tgg agc gcc 144

Lys Leu Pro Cys Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala

35 40 45

acg tcg ggc agc cac gcc cca gcc tca gac gac acc ccc gag ttc tgt 192

Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys

50 55 60

gca gcc ttg cgc agc tac gcc ctg tgc acg cgg cgg acg gcc cgc acc 240

Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr

65 70 75 80

tgc cgg ggt gac ctg gcc tac cac tcg gcc gtc cat ggc ata gag gac 288

Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp

85 90 95

ctc atg agc cag cac aac tgc tcc aag gat ggc ccc acc tcg cag cca 336

Leu Met Ser Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro

100 105 110

cgc ctg cgc acg ctc cca ccg gcc gga gac agc cag gag cgc tcg gac 384

Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp

115 120 125

agc ccc gag atc tgc cat tac gag aag agc ttt cac aag cac tcg gcc 432

Ser Pro Glu Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala

130 135 140

acc ccc aac tac acg cac tgt ggc ctc ttc ggg gac cca cac ctc agg 480

Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg

145 150 155 160

act ttc acc gac cgc ttc cag acc tgc aag gtg cag ggc gcc tgg ccg 528

Thr Phe Thr Asp Arg Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro

165 170 175

ctc atc gac aat aat tac ctg aac gtg cag gtc acc aac acg cct gtg 576

Leu Ile Asp Asn Asn Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val

180 185 190

ctg ccc ggc tca gcg gcc act gcc acc agc aag ctc acc atc atc ttc 624

Leu Pro Gly Ser Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe

195 200 205

aag aac ttc cag gag tgt gtg gac cag aag gtg tac cag gct gag atg 672

Lys Asn Phe Gln Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met

210 215 220

gac gag ctc ccg gcc gcc ttc gtg gat ggc tct aag aac ggt ggg gac 720

Asp Glu Leu Pro Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp

225 230 235 240

aag cac ggg gcc aac agc ctg aag atc act gag aag gtg tca ggc cag 768

Lys His Gly Ala Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln

245 250 255

cac gtg gag atc cag gcc aag tac atc ggc acc acc atc gtg gtg cgc 816

His Val Glu Ile Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg

260 265 270

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275 280 285

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Val Asn Ala Val Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu

290 295 300

cgg ggc tgc ccc ctc aac cag cag atc gac ttc cag gcc ttc cac acc 960

Arg Gly Cys Pro Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr

305 310 315 320

aat gct gag ggc acc ggt gcc cgc agg ctg gca gcc gcc agc cct gca 1008

Asn Ala Glu Gly Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala

325 330 335

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340 345 350

aag gag aag ctg ccg gtg gag gac ctg tac tac cag gcc tgc gtc ttc 1104

Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe

355 360 365

gac ctc ctc acc acg ggc gac gtg aac ttc aca ctg gcc gcc tac tac 1152

Asp Leu Leu Thr Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr

370 375 380

gcg ttg gag gat gtc aag atg ctc cac tcc aac aaa gac aaa ctg cac 1200

Ala Leu Glu Asp Val Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His

385 390 395 400

ctg tat gag agg act cgg gac ctg cca ggc ttg aat tct gca gat atc 1248

Leu Tyr Glu Arg Thr Arg Asp Leu Pro Gly Leu Asn Ser Ala Asp Ile

405 410 415

gag gga cga atg gat cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga 1296

Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

420 425 430

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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

435 440 445

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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

450 455 460

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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

465 470 475 480

aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt 1488

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

485 490 495

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500 505 510

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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

515 520 525

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530 535 540

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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

545 550 555 560

acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg 1728

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

565 570 575

gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg 1776

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

580 585 590

ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac 1824

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

595 600 605

aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 1872

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

610 615 620

gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg 1920

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

625 630 635 640

ggt aaa tga 1929

Gly Lys

<210> 4

<211> 642

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr

20 25 30

Lys Leu Pro Cys Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala

35 40 45

Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys

50 55 60

Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr

65 70 75 80

Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp

85 90 95

Leu Met Ser Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro

100 105 110

Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp

115 120 125

Ser Pro Glu Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala

130 135 140

Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg

145 150 155 160

Thr Phe Thr Asp Arg Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro

165 170 175

Leu Ile Asp Asn Asn Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val

180 185 190

Leu Pro Gly Ser Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe

195 200 205

Lys Asn Phe Gln Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met

210 215 220

Asp Glu Leu Pro Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp

225 230 235 240

Lys His Gly Ala Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln

245 250 255

His Val Glu Ile Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg

260 265 270

Gln Val Gly Arg Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val

275 280 285

Val Asn Ala Val Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu

290 295 300

Arg Gly Cys Pro Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr

305 310 315 320

Asn Ala Glu Gly Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala

325 330 335

Pro Thr Ala Pro Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys

340 345 350

Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe

355 360 365

Asp Leu Leu Thr Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr

370 375 380

Ala Leu Glu Asp Val Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His

385 390 395 400

Leu Tyr Glu Arg Thr Arg Asp Leu Pro Gly Leu Asn Ser Ala Asp Ile

405 410 415

Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

420 425 430

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

435 440 445

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

450 455 460

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

465 470 475 480

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

485 490 495

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

500 505 510

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

515 520 525

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

530 535 540

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

545 550 555 560

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

565 570 575

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

580 585 590

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

595 600 605

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

610 615 620

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

625 630 635 640

Gly Lys

<210> 5

<211> 1167

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> hRGMA LC fc

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1167)

<220>

<221> sig_peptide

<222> (1)..(102)

<220>

<221> misc_feature

<222> (103)..(468)

<223> hRGMA片段47-168

<220>

<221> misc_feature

<222> (469)..(1167)

<223> fc部分

<400> 5

atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca 48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

ggt tcc act ggt gac gcg gcc cag ccg gcc agg cgc gcg cgc cgt acg 96

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr

20 25 30

aag ctt ccg tgc aag atc ctc aag tgc aac tct gag ttc tgg agc gcc 144

Lys Leu Pro Cys Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala

35 40 45

acg tcg ggc agc cac gcc cca gcc tca gac gac acc ccc gag ttc tgt 192

Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys

50 55 60

gca gcc ttg cgc agc tac gcc ctg tgc acg cgg cgg acg gcc cgc acc 240

Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr

65 70 75 80

tgc cgg ggt gac ctg gcc tac cac tcg gcc gtc cat ggc ata gag gac 288

Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp

85 90 95

ctc atg agc cag cac aac tgc tcc aag gat ggc ccc acc tcg cag cca 336

Leu Met Ser Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro

100 105 110

cgc ctg cgc acg ctc cca ccg gcc gga gac agc cag gag cgc tcg gac 384

Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp

115 120 125

agc ccc gag atc tgc cat tac gag aag agc ttt cac aag cac tcg gcc 432

Ser Pro Glu Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala

130 135 140

acc ccc aac tac acg cac tgt ggc ctc ttc ggg gac ttg aat tct gca 480

Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Leu Asn Ser Ala

145 150 155 160

gat atc gag gga cga atg gat cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg 528

Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

165 170 175

ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc 576

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

180 185 190

atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc 624

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

195 200 205

cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 672

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

210 215 220

gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg 720

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

225 230 235 240

tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 768

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

245 250 255

ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 816

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

260 265 270

atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 864

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

275 280 285

gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc 912

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

290 295 300

agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 960

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

305 310 315 320

gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 1008

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

325 330 335

ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc 1056

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

340 345 350

gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 1104

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

355 360 365

atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg 1152

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

370 375 380

tct ccg ggt aaa tga 1167

Ser Pro Gly Lys

385

<210> 6

<211> 388

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成构建体

<400> 6

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr

20 25 30

Lys Leu Pro Cys Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala

35 40 45

Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys

50 55 60

Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr

65 70 75 80

Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp

85 90 95

Leu Met Ser Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro

100 105 110

Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp

115 120 125

Ser Pro Glu Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala

130 135 140

Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Leu Asn Ser Ala

145 150 155 160

Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

165 170 175

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

180 185 190

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

195 200 205

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

210 215 220

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

225 230 235 240

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

245 250 255

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

260 265 270

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

275 280 285

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

290 295 300

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

305 310 315 320

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

325 330 335

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

340 345 350

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

355 360 365

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

370 375 380

Ser Pro Gly Lys

385

<210> 7

<211> 1431

<212> DNA

<213> 鼠属物种

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1431)

<400> 7

atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca 48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

ggt tcc act ggt gac gcg gcc cag ccg gcc agg cgc gcg cgc cgt acg 96

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr

20 25 30

aag ctt ggt acc gag ctc gga tcc act agt cca gtg tgg tgg aat tct 144

Lys Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ser Thr Ser Pro Val Trp Trp Asn Ser

35 40 45

gca gat atc aca agt ttg tac aaa aaa gca ggc tcc ccg tgc aag atc 192

Ala Asp Ile Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Ser Pro Cys Lys Ile

50 55 60

ctc aag tgc aac tct gag ttc tgg agc gcc acg tcg tca ggc agc cac 240

Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly Ser His

65 70 75 80

gcc cct gcc tct gac gac gtg ccc gag ttc tgt gct gcc ctg cgc acc 288

Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg Thr

85 90 95

tac gcc ctg tgc acg cga cgg aca gcc cgc acc tgc cgg ggc gac ctg 336

Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp Leu

100 105 110

gct tac cac tcg gct gtc cat ggc ata gag gac ctc atg agc cag cac 384

Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln His

115 120 125

aac tgc tcc aag gat ggc ccc acc tca cag cct cga gtg cgc acg ctc 432

Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Val Arg Thr Leu

130 135 140

ccg cca gct ggg gac agc cag gag cgc tca gat agc ccc gag atc tgc 480

Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile Cys

145 150 155 160

cac tat gag aag agt ttc cac aag cac tca gct gcc ccc aac tac act 528

His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn Tyr Thr

165 170 175

cac tgc ggc ctc ttt ggg gac cca cac ctc agg act ttc aca gac cac 576

His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp His

180 185 190

ttc cag aca tgt aag gtg caa ggc gct tgg cct ctc atc gac aat aat 624

Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn Asn

195 200 205

tac ctg aac gtg cag gtc acc aat aca cct gtg ctg ccc ggc tct gcc 672

Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser Ala

210 215 220

gcc act gcc acc agc aag ctc acc atc atc ttc aag aac ttc caa gag 720

Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln Glu

225 230 235 240

tgt gtg gac cag aaa gta tac caa gcc gag atg gac gag ctt ccg tcc 768

Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro Ser

245 250 255

gcc ttt gcc gat ggc tcc aaa aac ggt gga gat aaa cac gga gcc aac 816

Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala Asn

260 265 270

agc ctg aag atc aca gag aag gtg tca ggc cag cac gtg gag atc cag 864

Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile Gln

275 280 285

gcc aag tac atc ggc acc acc atc gtg gtg aga cag gtg ggc cgc tac 912

Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg Tyr

290 295 300

ctg acc ttc gcc gtc cgg atg ccc gag gag gta gtc aac gcc gtg gag 960

Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val Glu

305 310 315 320

gac cgt gac agc caa ggc ctc tac ctc tgc ctg cgg ggc tgc ccg ctc 1008

Asp Arg Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro Leu

325 330 335

aac cag cag atc gac ttc cag gct ttc cgt gcc aac gcc gag agc cct 1056

Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu Ser Pro

340 345 350

cgc agg cca gca gct gcc agc ccc tct cct gtg gtc ccc gag aca ttt 1104

Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu Thr Phe

355 360 365

ccg tac gag aca gct gtg gcc aag tgc aaa gag aag ctg cct gta gaa 1152

Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu

370 375 380

gac ttg tac tac cag gcc tgt gtc ttc gac ctc ctc acg act ggc gac 1200

Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly Asp

385 390 395 400

gtg aac ttc acg ctg gcc gcc tac tat gct ttg gag gat ggc aag atg 1248

Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly Lys Met

405 410 415

ctc cac tcc aac aag gac aag cta cac ctg ttt gaa agg act cgg gag 1296

Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr Arg Glu

420 425 430

ctg cct gac cca gct ttc ttg tac aaa gtg gtg ata tcc agc aca gtg 1344

Leu Pro Asp Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val Ile Ser Ser Thr Val

435 440 445

gcg gcc gct cga gga ggg ccc gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat 1392

Ala Ala Ala Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp

450 455 460

ctg aat agc gcc gtc gac cat cat cat cat cat cat tga 1431

Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His

465 470 475

<210> 8

<211> 476

<212> PRT

<213> 鼠属物种

<400> 8

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr

20 25 30

Lys Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ser Thr Ser Pro Val Trp Trp Asn Ser

35 40 45

Ala Asp Ile Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Ser Pro Cys Lys Ile

50 55 60

Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly Ser His

65 70 75 80

Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg Thr

85 90 95

Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp Leu

100 105 110

Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln His

115 120 125

Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Val Arg Thr Leu

130 135 140

Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile Cys

145 150 155 160

His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn Tyr Thr

165 170 175

His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp His

180 185 190

Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn Asn

195 200 205

Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser Ala

210 215 220

Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln Glu

225 230 235 240

Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro Ser

245 250 255

Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala Asn

260 265 270

Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile Gln

275 280 285

Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg Tyr

290 295 300

Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val Glu

305 310 315 320

Asp Arg Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro Leu

325 330 335

Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu Ser Pro

340 345 350

Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu Thr Phe

355 360 365

Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu

370 375 380

Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly Asp

385 390 395 400

Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly Lys Met

405 410 415

Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr Arg Glu

420 425 430

Leu Pro Asp Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val Ile Ser Ser Thr Val

435 440 445

Ala Ala Ala Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp

450 455 460

Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His

465 470 475

<210> 9

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 5F9

<220>

<221> misc_feature

<222> (62)..(62)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Xaa Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VL 5F9

<400> 10

Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Met Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 11

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> Ig γ-1恒定区

<400> 11

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Phe Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 12

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> Ig γ-1恒定区突变体

<400> 12

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 13

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> Ig κ恒定区

<400> 13

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 14

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> lg λ恒定区

<400> 14

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 15

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH3-48/JH3 FR1

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH3-48/JH3 FR2

<400> 16

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 17

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH3-48/JH3 FR3

<400> 17

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH3-49/JH3 FR4

<400> 18

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH3-48/JH4 FR4

<400> 19

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH3-48/JH6 FR4

<400> 20

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 21

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH3-33/JH6 FR!

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 22

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH3-33/JH6 FR2

<400> 22

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10

<210> 23

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH3-33/JH6 FR3

<400> 23

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 24

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH3-23/JH3 FR1

<400> 24

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 25

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH3-23/JH3 FR2

<400> 25

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH3-23/JH3 FR3

<400> 26

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

<210> 27

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> A18/JK2 FR1

<400> 27

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys

20

<210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> A18/JK2 FR2

<400> 28

Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 29

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> A18/JK2 FR3

<400> 29

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> A18/JK2 FR4

<400> 30

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210> 31

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> A17/JK2 FR1

<400> 31

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys

20

<210> 32

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> A17/JK2 FR2

<400> 32

Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 33

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> A17/JK2 FR3

<400> 33

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 34

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 5F9

<400> 34

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 35

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 5F9.1-GL

<400> 35

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 5F9.2-GL

<400> 36

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 37

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 5F9.3-GL

<400> 37

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 38

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 5F9.4-GL

<400> 38

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 39

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 5F9.5-GL

<400> 39

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 40

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 5F9.6-GL

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 41

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 5F9.7-GL

<400> 41

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 42

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 5F9.8-GL

<400> 42

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 43

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 5F9.9-GL

<400> 43

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 44

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VL 5F9.1-GL

<400> 44

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 45

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VL 5F9.2-GL

<400> 45

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 46

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VL 5F9.3-GL

<400> 46

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 47

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH h5F9.1

<400> 47

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 48

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH h5F9.2

<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 49

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH h5F9.3

<400> 49

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 50

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH h5F9.4

<400> 50

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 51

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VL h5F9.19

<400> 51

Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 52

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VL h5F9.20

<400> 52

Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 53

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VL h5F9.21

<400> 53

Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 54

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VL h5F9.22

<400> 54

Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 55

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 8D1

<400> 55

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asn Glu Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 56

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VL 8D1

<400> 56

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu

1 5 10 15

Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Arg Leu Gln Ile

65 70 75 80

Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Tyr Ile Pro Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 5F9 CDR H1

<400> 57

Asn Tyr Gly Met Asn

1 5

<210> 58

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 5F9 CDR-H2

<400> 58

Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 59

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 5F9 CDR-H3

<400> 59

Gly Thr Thr Pro Asp Tyr

1 5

<210> 60

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VL 5F9 CDR-L1

<400> 60

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu

1 5 10 15

<210> 61

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VL 5F9 CDR-L2

<400> 61

Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 62

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VL 5F9 CDR-L3

<400> 62

Phe Gln Ala Thr His Asp Pro Leu Thr

1 5

<210> 63

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 8D1 CDR-H1

<400> 63

Ser Tyr Val Met His

1 5

<210> 64

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 8D1 CDR-H2

<400> 64

Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 65

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VH 8D1 CDR-H3

<400> 65

Ala Arg Arg Asn Glu Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 66

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VL 8D1 CDR-L1

<400> 66

Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 67

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VL 8D1 CDR-L2

<400> 67

Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp

1 5

<210> 68

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> VL 8D1 CDR-L3

<400> 68

Leu Gln Gly Tyr Ile Pro Pro Arg Thr

1 5