抗TGF-β抗体及其用途
阅读说明：本技术 抗TGF-β抗体及其用途 (Anti-TGF-beta antibodies and application thereof ) 是由 G·夏皮罗 K·布劳恩 P·费恩 R·C·格雷戈里 R·科杜里 刘锋 N·马尔科娃 P 于 2018-01-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供了用于治疗包括自身免疫性疾病、纤维化病症和癌症在内的由TGF-β介导的病症的改进的泛-TGF-β抗体(pan-TGF-βantibody)。还提供了该抗体与其他免疫调节剂例如抗PD-1抗体联合的方法和用途。(The present invention provides improved general-TGF-β antibody (pan-TGF- β antibody) for treating the illness mediated by TGF-β including autoimmune disease, fibrotic conditions and cancer.Additionally provide the antibody and for example anti-PD-1 of other immunomodulators antibody combined method and purposes.)
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背景技术
转化生长因子β(TGF-β)是一种控制许多关键细胞功能的细胞因子，包括增殖、分化、存活、迁移和上皮间充质转化。它调节多种生物过程，如细胞外基质形成、伤口愈合、胚胎发育、骨骼发育、造血、免疫和炎症反应以及恶性转化。TGF-β的失调导致病理状况，例如出生缺陷、癌症、慢性炎症以及自身免疫和纤维化疾病。
TGF-β具有三种已知的同种型——TGF-β1、2和3。所有三种同种型最初都被翻译成前肽(pro-peptide)。切割后，成熟的C-末端保持与N-末端相结合(称为潜在性相关肽(latency associated peptide)或LAP)，形成从细胞分泌的小潜在性复合物(SLC)。SLC不能结合TGF-β受体II(TGFβRII)阻止了受体接合。通过解离N-和C-末端的活化通过几种机制之一发生，包括蛋白水解切割、酸性pH或整合蛋白结构改变(Connolly等，Int J Biol Sci(2012)8(7):964-78)。
TGF-β1、2和3在其功能上是多效性的并且在不同细胞和组织类型中以不同的模式表达。它们具有相似的体外活性，但是特定细胞类型中的单个敲除表明尽管它们具有共享的结合相同受体的能力，但它们在体内具有不同的作用(Akhurst等，Nat Rev Drug Discov(2012)11(10):790-811)。在TGF-β与TGFβRII结合后，受体的组成型激酶活性磷酸化并激活TGFβRI，其使SMAD2/3磷酸化，从而允许与SMAD4结合，定位至细胞核，以及TGF-β响应性基因的转录。见上文。除了这种典型的信号传导级联，非典型途径通过其他因子传递信号，包括p38 MAPK、PI3K、AKT、JUN、JNK和NF-κB。TGF-β信号传导也受到其他途径调控，包括WNT、Hedgehog、Notch、IFN、TNF和RAS。因此TGF-β信号传导的最终结果是所有这些整合了细胞的状态和环境的信号传导途径的串扰(crosstalk)。见上文。
鉴于TGF-β的不同功能，需要对人类患者安全的泛-TGF-β特异性治疗性抗体(Bedinger等，mAbs.(2016)8(2):389–404)。但是，TGF-β在物种间高度保守。结果，在动物例如小鼠中产生抗人TGF-β的抗体是一项具有挑战性的任务。
对于目前没有得到有效治疗的患者而言也存在医疗需求。例如，用抗PD1抗体nivolumab单一疗法治疗的III期Checkmate-067研究中超过50％的晚期黑素瘤患者对治疗不具有完全或部分的响应(Larkin等，N Engl J Med(2015)373:23–34；Redman等，BMC Med(2016)14:20-30)。
本发明提供了特异性结合人TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3(即泛-TGF-β特异性)的改进的单克隆抗体。这些抗体在制造期间不易形成半抗体(即，具有一条重链和一条轻链的二聚体复合物)。它们还具有优越的药代动力学概貌(pharmacokinetic profile)，例如增加的半衰期，并因此可以赋予患者改善的临床益处。本发明人还发现TGF-β抑制，例如由本发明的抗体和抗原结合片段实现的TGF-β抑制，减轻了肿瘤中的免疫抑制性微环境并增强了免疫疗法的功效，所述免疫疗法例如靶向程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、PD-1配体1(PD-L1)和2(PD-L2)的疗法。
一方面，本发明提供了与人TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3特异性结合的分离的单克隆抗体，其包含SEQ ID NO:1中的重链互补决定区(CDR)1-3和SEQ ID NO:2中的轻链CDR1-3，其中所述抗体包含在228位(EU编号)具有突变的人IgG4恒定区。在一些实施方案中，突变是丝氨酸成为脯氨酸的突变(S228P)。在一些实施方案中，抗体包含对应于SEQ ID NO:1的残基1-120的重链可变域(VH)氨基酸序列和对应于SEQ ID NO:2的残基1-108的轻链可变域(VL)氨基酸序列。在进一步的实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:1中所示的重链氨基酸序列(具有或不具有C-末端赖氨酸)和SEQ ID NO:2中所示的轻链氨基酸序列。本发明的特征还在于上述抗体的F(ab’)2抗原结合片段。
在优选的实施方案中，与fresolimumab治疗相比，本发明的抗体或片段具有增加的半衰期、增加的暴露、或两者兼有。例如，增加为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多增加。药物如本发明的抗体或片段的暴露是药物在体内的浓度相对于时间的函数。药物在体内的浓度通常由血液、血浆或血清中的药物水平来表示。药物的半衰期和暴露(生物暴露)可以通过众所周知的方法(如下面的实施例7所示的方法)测量。
本发明还提供了包含本发明的抗体的组合物，其中所述组合物包含小于1％的半抗体。半抗体形成可以通过对单克隆抗体制备物的纯度分析而确定，该分析通过使用例如在非还原条件下的SDS-毛细管电泳或非还原性SDS-PAGE分析，继之以密度测定法或RP-HPLC(Angal等，Mol Immunol(1993)30(1):105-8；Bloom等，Protein Science(1997)6:407-415；Schuurman等，(2001)38(1):1-8；和Solanos等，Anal Chem(2006)78:6583-94)。在一些实施方案中，这种组合物是还包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
另一方面，本发明提供了在有需要的患者(人)中抑制TGF-β信号转导的方法，其包括向患者施用治疗量的本发明的抗体或片段。在一些实施方案中，患者患有免疫介导的疾病(例如硬皮病)、纤维化病症(例如肾纤维化病症，诸如局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)，或肺纤维化病症诸如特发性肺纤维化)，或者出生或骨缺损(例如，成骨不全症)。在一些实施方案中，患者患有癌症。在一些实施方案中，该方法中使用的抗体或片段抑制CD4+ T细胞向可诱导型调节性T细胞(iTreg)的分化。所述抗体或片段可以减轻免疫抑制性肿瘤微环境。抗体或片段的这种作用有助于激活免疫系统并增强免疫疗法的功效。本文所述的治疗方法的功效可以通过例如患者中(例如患者的肿瘤组织中)的以下一项或多项来指示：(1)MIP2和/或KC/GRO水平的增加，(2)CD8+ T细胞如INF-γ阳性CD8+ T细胞的活化或浸润至肿瘤组织，以及(3)自然杀伤(NK)细胞的聚集(clustering)的增加。
本发明进一步提供了治疗患者(人)中的癌症的方法，其包括向患者施用(1)治疗有效量的本发明的抗体或片段，和(2)治疗有效量的免疫检查点蛋白抑制剂。这两种药剂可以同时施用(例如，以单一组合物或以分开的组合物)，或以任一顺序依次施用。例如，这两种药剂可以在同一天施用。在一些实施方案中，治疗剂(1)在治疗剂(2)之前(例如，之前一天或更多天)施用于患者。
在一些实施方案中，免疫检查点蛋白是PD-1、PD-L1或PD-L2。在进一步的实施方案中，免疫检查点蛋白的抑制剂是抗PD-1抗体。在进一步的实施方案中，抗PD-1抗体包含(1)SEQ ID NO:5中的重链CDR1-3和SEQ ID NO:6中的轻链CDR1-3，(2)对应于SEQ ID NO:5的残基1-117的VH氨基酸序列和对应于SEQ ID NO:6的残基1-107的VL氨基酸序列，或(3)SEQ IDNO:5中所示的重链氨基酸序列(具有或不具有C-末端赖氨酸)和SEQ ID NO:6中所示的轻链氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，所述方法包括向癌症患者施用包含SEQ ID NO:1中所示的重链氨基酸序列(具有或不具有C-末端赖氨酸)和SEQ ID NO:2中所示的轻链氨基酸序列的抗TGF-β抗体，以及包含SEQ ID NO:5中所示的重链氨基酸序列(具有或不具有C-末端赖氨酸)和SEQ ID NO:6中所示的轻链氨基酸序列的抗PD-1抗体序列。在一些实施方案中，患者对抗PD-1抗体单一疗法是难治的。患者可能有晚期或转移性黑素瘤，或皮肤鳞状细胞癌。
在一些方案中，每2周或每3周向患者施用抗TGF-β抗体和抗PD-1抗体。在一些方案中，两种药剂分别以0.01-40(例如0.02-20、0.05-15或0.05-20)mg/kg体重的剂量施用。
本发明还提供了在有需要的患者中增加免疫应答的方法，包括对患者施用免疫检查点抑制剂和本发明的抗体或片段。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体，例如包含以下的抗PD-1抗体：(1)SEQ ID NO:5中的HCDR1-3和SEQ ID NO:6中的LCDR1-3；(2)分别对应于SEQ ID NO:5中的残基1-117和SEQ ID NO:6中的残基1-107的VH和VL；或(3)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链(具有或不具有C-末端赖氨酸)和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链。
本发明的方法可用于治疗多种癌症，包括但不限于黑素瘤(例如转移性或晚期)、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、皮肤鳞状细胞癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、子宫癌、头颈癌(例如，头颈部鳞状细胞癌)、肝癌(liver cancer)(例如肝癌(hepatocarcinoma))、尿路上皮癌和肾癌(例如肾细胞癌)。在一些实施方案中，患者具有间叶性肿瘤或实体瘤的间叶性亚型。这样的实体肿瘤的实例包括结肠(例如，结肠直肠癌)、卵巢、头和颈(例如，头颈部鳞状细胞癌)、肝(例如肝细胞癌)和***中的那些肿瘤。
在一些实施方案中，包括间叶性、肿瘤在内的癌症可通过ACTA2(平滑肌α2肌动蛋白)、VIM(波形蛋白)、MGP(基质Gla蛋白)、ZWINT(ZW10相互作用着丝粒蛋白)和ZEB2(锌指E框结合同源框2)中一种或多种的过表达来表征。这样的生物标志物的表达水平可以例如在mRNA水平或蛋白质水平在来自患者的生物样品如肿瘤活组织检查或循环肿瘤细胞中测定。
本发明还提供用于治疗本文所述病症的上述抗体、片段或组合物，以及上述抗体、片段或组合物在制备用于治疗本文所述病症的药物中的用途。
本发明还包括编码本发明的抗体的重链或轻链或两者的核酸表达载体；包含抗体的重链和轻链编码序列的宿主细胞；以及使用该宿主细胞制备抗体的方法，所述方法包括在合适的培养基中培养该宿主细胞以允许表达该抗体基因和随后收获抗体的步骤。
附图说明
图1A-E是显示Ab1、fresolimumab和1D11对用1ng/ml的人TGF-β1(A)、人TGF-β2(B)、人TGFβ3(C)、鼠TGF-β1(D)或鼠TGF-β2(E)处理的貂肺(Mv 1 Lu)细胞的增殖的作用的图。抗体浓度以μg/ml计。
图2是显示50μg/ml Ab1对人可诱导型调节性T细胞(iTreg)分化的作用的条形图。提供给T细胞的刺激是抗CD3和抗CD28抗体加IL-2。
图3是显示用2ng/ml人TGF-β1处理的人CD4+ T细胞培养物中Ab1对人可诱导型调节性T细胞(iTreg)分化的作用的条形图。提供给T细胞的刺激是抗CD3和抗CD28抗体加IL-2。
图4是显示在T细胞刺激和抗PD-1处理之后，Ab1(30μg/ml)和人TGF-β1(18ng/ml)对Jurkat T细胞上NFATc-驱动的萤光素酶表达的作用的条形图。
图5是显示使用C57BL/6 MC38结肠小鼠模型在所示治疗组中的中值肿瘤体积与中值绝对偏差(MAD)的图。载体：PBS。“抗PD-1”：x-抗-mPD-1Mab(参见下面的详述)。“Ab1的同种型对照”：抗HEL hIgG4。
图6是显示使用C57BL/6 MC38结肠小鼠模型的所示治疗的第27天时距离基线的肿瘤体积变化的散点图。对照：PBS。“抗PD-1 RPM114 mIgG1”：x-抗-mPD-1 Mab。
图7A-F是显示使用C57BL/6 MC38结肠小鼠模型的各个所示治疗组随时间的肿瘤体积的图。图表中的每条线代表一只动物。“mpk”：mg/kg。“Ab1同种型Ctrl”：抗HEL hIgG4。αPD1：x-抗-mPD-1 Mab。
图8是显示LoVo肿瘤裂解物中Ab1对活性TGF-β1浓度的作用的图。
图9A是显示在给予单一剂量5mg/kg的任一抗体的五组大鼠中Ab1和fresolimumab随时间的血清浓度的图。组(Gr.)1-3被给予三种不同批次(B1、B2和B3)的fresolimumab。组4和5被给予两种不同批次(B1和B2)的Ab1。
图9B是显示在给予单一剂量1mg/kg的任一抗体的猴子中Ab1和fresolimumab随时间的血清浓度的图。
图9C是显示在给予五个每剂量1mg/kg的每周剂量的Ab1或给予每剂量1mg/kg的每两周剂量的fresolimumab达指定的研究持续时间的猴子中Ab1和fresolimumab随时间的血清浓度的图。
图9D是显示在给予单一剂量10mg/kg的任一抗体的猴子中Ab1和fresolimumab随时间的血清浓度的图。
图9E是显示在给予五个每剂量10mg/kg的每周剂量的Ab1或给予每剂量10mg/kg的每两周剂量的fresolimumab达指定的研究持续时间的猴子中Ab1和fresolimumab随时间的血清浓度的图。
图10A是显示用Ab1(+/-抗-PD1)处理后MC38肿瘤中TGF-β1水平变化的图。
图10B是显示用Ab1(+/-抗-PD1)处理后MC38肿瘤中MIP-2水平变化的图。
图10C是显示用Ab1(+/-抗-PD1)处理后MC38肿瘤中KC/GRO水平变化的图。
图11A是量化CD8pos细胞的CellTrace Violet染色和IFN-γ染色的图。
图11B是显示Ab1恢复了TGFβ处理的CD8+ T细胞中的增殖和IFN-γ产生的图。
图12A是显示在整个针对结肠癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、乳腺癌、黑素瘤、间皮瘤和肾癌的同基因小鼠肿瘤模型的概要之间CD8+ T细胞的相对丰度(经log2-转化)的图。
图12B是显示在整个针对结肠癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、乳腺癌、黑素瘤、间皮瘤和肾癌的同基因小鼠肿瘤模型的概要之间TGFβ途径活化的图。
发明详述
本发明的特征在于改进的泛-TGF-β特异性单克隆抗体，其不易形成半抗体，同时还具有优异的药代动力学概貌，例如比现有已知抗体更高的体内暴露。本发明的抗体被统称为“Ab1和相关抗体”并且共享共同的结构特征，即它们具有SEQ ID NO:1中的重链CDR(HCDR)1-3和SEQ ID NO:2中的轻链CDR(LCDR)1-3，并且具有其中铰链区中的残基228(EU编号)已经从丝氨酸突变为脯氨酸的人IgG4恒定区。P228在下面显示的SEQ ID NO:1的序列中以方框和黑体字表示。
当未糖基化时，抗体Ab1具有144KD的估算分子量。其重和轻(链)氨基酸序列分别是SEQ ID NO:1和2。这两个序列如下所示。可变域为斜体。CDR以方框显示。重链恒定域中的糖基化位点以黑体字表示(N297)。
在一些实施方案中，本发明的抗体，如抗TGFβ抗体，在重链中不具有C-末端赖氨酸。C-末端赖氨酸可以在制备期间或通过重组技术(即，重链的编码序列不包括C-末端赖氨酸的密码子)被去除。因此，在本发明内考虑的还有包含不具有C-末端赖氨酸的SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列的抗体。
Ab1和相关抗体特异性结合人TGF-β1、-β2和-β3。“特异性”意指通过例如表面等离子体共振(参见例如下文实施例1)或生物层干涉(Bio-Layer Interferometry)测定的结合具有低于10-7M的KD，例如低于10-8M(例如，1-5nM)的KD。Ab1和相关抗体还可以具有当在貂肺上皮细胞测定法中测定时(参见例如下文实施例2)的强TGF-β中和效力，或在A549细胞IL-11诱导测定法中测定的约0.05-1μg/ml的EC50(参见例如PCT公开WO 2006/086469中的实施例6，其公开内容通过引用整体并入本文)。
Ab1和相关抗体的这些抗原结合和中和特性与先前的抗TGF-β抗体fresolimumab(WO 2006/086469中描述的种系化的IgG4PET1073G12抗体)相当。fresolimumab的重链和轻链序列，包括前导序列，分别显示于SEQ ID NO:3和4中。如SEQ ID NO:3中可见，fresolimumab不具有位置228(EU编号，其对应于SEQ ID NO:3中的实际位置247)的脯氨酸。Ab1和相关抗体与fresolimumab相比具有数种改进的特征。
在制造过程中，fresolimumab可在非还原性变性条件下形成高达6-18％的半抗体(即具有一重链和一轻链的二聚体，而不是具有与两条轻链复合的两条重链的四聚体)。相反，Ab1产生大幅度减少的半抗体(<1％)。因此，Ab1和相关抗体在制造过程中产生更纯的药物产品。
此外，与fresolimumab相比，Ab1和相关抗体可具有改进的药代动力学(PK)概貌。它们可能具有线性PK表现，其比fresolimumab半衰期长得多且消除速率更低，这导致体内暴露是fresolimumab的大约1.7倍。例如，在大鼠中，已显示Ab1具有与fresolimumab的4.3天相比7.1天的平均半衰期，和与fresolimumab的0.51ml/hr/kg相比0.30ml/hr/kg的消除速率(CL)(实施例7，下文)。在食蟹猴中，已显示Ab1具有与fresolimumab的4.5天相比13天的平均半衰期，和与fresolimumab的0.66ml/hr/kg相比0.40ml/hr/kg的消除速率(CL)。同上文。这些改进的PK特性表明，Ab1和相关抗体可以以比fresolimumab更低的剂量和/或更低的频率给予患者，以实现相同或更好的临床效果，同时引起更少的不良副作用和更少的抗药物抗体反应，因此在必要时允许更长的治疗持续时间。
此外，在非人灵长类动物中fresolimumab的毒理学研究期间，观察到了药物暴露与不良事件如贫血之间的相关性。然而，在用Ab1在相当或甚至更高的暴露下进行的类似研究中，没有观察到这种事件。
不受理论束缚，我们假定Ab1和相关抗体的重链中的残基228突变导致增加的稳定性以及改进的PK和毒理学概貌。
可以根据需要进一步修饰Ab1和相关抗体的恒定结构域，例如在Kabat残基L248处(例如通过引入突变L248E)，以减少分子的任何不需要的效应功能。
如本文所用，术语“抗体”(Ab)或“免疫球蛋白”(Ig)是指包含通过二硫键相互连接的两条重(H)链(约50-70kDa)和两条轻(L)链(约25kDa)的四聚体蛋白。每条重链由重链可变域(VH)和重链恒定区(CH)组成。每条轻链由轻链可变域(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL结构域可以进一步细分成高变区，称为“互补决定区”(CDR)，其间为称为“框架区”(FR)的更保守的区域。每个VH或VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。可以根据定义(Lefranc等，Dev CompImmunol 27(1):55-77(2003)；或Kabat的定义，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD(1987and1991))；Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；或Chothia等，Nature 342:878-883(1989)将氨基酸分配到每个区域。
术语“人抗体”是指其中可变域和恒定区序列源自人序列的抗体。该术语涵盖具有衍生自人基因的序列的抗体，但是那些序列已经被修饰例如以降低免疫原性、增加亲和力和增加稳定性。该术语涵盖在非人细胞中重组产生的抗体，其可以赋予对于人细胞而言非典型的糖基化。
术语“嵌合抗体”是指包含来自两种不同动物物种的序列的抗体。例如，嵌合抗体可以含有鼠抗体(即，由鼠抗体基因编码的抗体，例如使用杂交瘤技术从经免疫的小鼠获得的抗体)的VH和VL，该VH和VL与来自另一物种(例如，人、兔子或大鼠)的抗体的恒定区连接。
术语抗体的“抗原结合片段”是指保留特异性结合抗原的能力的抗体片段。在一些实施方案中，本发明的抗原结合片段是F(ab')2片段，其是包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段(Fab是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价抗体片段)。在一些实施方案中，本发明的抗原结合片段还可以包含CH2或CH3结构域。
本文所述的抗体和抗原结合片段可以是分离的。术语“分离的蛋白质”、“分离的多肽”或“分离的抗体”是指这样的蛋白质、多肽或抗体，其由于其起源或衍生来源而(1)不与在其天然状态下伴随它的天然关联组分关联，(2)基本上不含来自相同物种的其他蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。因此，化学合成或在与其天然来源的细胞不同的细胞系统中合成的多肽会是与其天然关联组分“分离的”。通过使用本领域公知的蛋白质纯化技术分离也可使蛋白质基本上不含天然关联组分。
I.Ab1和相关抗体的用途
TGF-β受体在免疫细胞上广泛表达，这导致TGF-β在先天性和适应性免疫系统中具有广泛的作用。TGF-β与许多疾病状况有关，例如出生缺陷、癌症、慢性炎症、自身免疫和纤维化疾病。治疗量的Ab1或相关抗体可用于治疗这些病症。“治疗有效”量指的是减轻所治疗病症的一种或多种症状的Ab1、相关抗体或本文提到的另一种治疗剂的量。这个量可能会根据治疗的病症或患者而有所不同，并且可以由医疗专业人员使用完善的原则来确定。
在一些实施方案中，Ab1或相关抗体可以以40、20或15mg/kg或更少(例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1mg/kg)施用。在一些其他实施方案中，剂量可以是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4或0.5mg/kg。给药频率可以是例如每天，每两天，每三天，每四天或每五天，每周，每两周或每三周，每月或每两个月。抗体可以静脉内(例如，0.5-8小时的静脉内输注)、皮下、局部或适合于病症和药物制剂的任何其他施用途径施用。
Ab1和相关抗体源自人抗体基因，因此在人体中具有低免疫原性。Ab1的毒理学研究在下面的实施例8中详述。在大鼠中观察到某些心脏和肺部副作用。因此，在用Ab1或相关抗体治疗患者时，可监测患者的不良事件。
在一些实施方案中，本发明的抗体的功效可以由患者中下列的一项或多项指示(例如，在受影响的组织中，例如患者的肿瘤组织中)：(1)TGF-β水平或活性的减少，(2)MIP2和/或KC/GRO水平的增加，(3)CD8+ T细胞如INF-γ阳性CD8+ T细胞的活化或浸润至肿瘤组织，以及(4)自然杀伤(NK)细胞聚集的增加。
A.非肿瘤疾病状况
可以通过Ab1和相关抗体治疗的病症可以包括但不限于骨缺损(例如成骨不全症)、肾小球性肾炎、神经或皮肤瘢痕形成、肺或肺纤维化(lung or pulmonary fibrosis)(例如、特发性肺纤维化)、辐射诱发的纤维化、肝纤维化、骨髓纤维化、硬皮病、免疫介导的疾病(包括类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、干燥综合征(Sjogren’ssyndrome)、伯格氏病(Berger’s disease)和移植排斥)和Dupuytren氏挛缩。
它们也可用于治疗、预防肾功能不全和降低发生肾功能不全的风险，包括但不限于局部节段性肾小球硬化症(FSGS)、糖尿病(I型和II型)性肾病、放射性肾病、梗阻性肾病、弥漫性系统性硬化症、遗传性肾病(例如，多囊性肾病、髓质海绵肾、马蹄肾)、肾小球肾炎、肾硬化、肾钙质沉着症、系统性或肾小球性高血压、肾小管间质性肾病、肾小管酸中毒、肾结核和肾梗塞。特别地，它们与肾素-血管紧张素-醛固酮体系的拮抗剂组合时是有用的，所述肾素-血管紧张素-醛固酮体系的拮抗剂包括但不限于：肾素抑制剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、Ang II受体拮抗剂(也称为“Ang II受体阻断剂”)和醛固酮拮抗剂。参见例如WO 2004/098637，其公开内容通过引用整体并入本文。
Ab1和相关抗体可用于治疗与ECM沉积有关的疾病和病症，例如系统性硬化、术后粘连、瘢痕瘤和增生性瘢痕形成、增生性玻璃体视网膜病变、青光眼引流手术、角膜损伤、白内障、佩罗尼氏病、成人呼吸窘迫综合征、肝硬化、心肌梗塞后的瘢痕形成、血管成形术后的再狭窄、蛛网膜下腔出血后的瘢痕形成、椎板切除术后的纤维化、肌腱和其他修复后的纤维化、胆汁性肝硬化(包括硬化性胆管炎)、心包炎、胸膜炎、气管切开术、穿透性CNS损伤、嗜酸性肌炎综合征、血管再狭窄、静脉闭塞性疾病、胰腺炎和银屑病性关节病。
Ab1和相关抗体进一步用于其中促进上皮再形成是有益的病症。这些病症包括但不限于皮肤疾病如静脉性溃疡、缺血性溃疡(压疮)、糖尿病性溃疡、移植部位、移植供体部位、擦伤和烧伤，支气管上皮的疾病如哮喘、ARDS，肠上皮的疾病如与细胞毒性治疗相关的粘膜炎、食管溃疡(反射疾病)、胃食管返流疾病、胃溃疡、小肠和大肠损伤(炎性肠病)。
Ab1和相关抗体的另外的用途是在其中期望内皮细胞增殖的病症中，例如稳定动脉粥样硬化斑块，促进血管吻合的愈合，或在其中期望抑制平滑肌细胞增殖的病症中，如动脉疾病、再狭窄和哮喘。
Ab1和相关抗体也可用于增强对巨噬细胞介导的感染的免疫应答，所述感染例如由利什曼原虫属种(Leishmania spp.)、克氏锥虫(Trypanosorna cruzi)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)以及原生动物刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、真菌荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、白色念珠菌(Candida albicans)、***滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)引起的感染。它们也可用于减少例如由肿瘤、AIDS或肉芽肿性疾病引起的免疫抑制。
Ab1和相关抗体也可用于预防和/或治疗眼科病症，例如小梁切除术后的青光眼和瘢痕形成。
B.肿瘤疾病状况
TGF-β调节几种生物过程，包括细胞增殖、上皮-间充质转化(EMT)、基质重塑、血管生成和免疫功能。这些过程中的每一个都促成肿瘤进展。TGF-β在跨越适应症的癌症患者中广泛的不利作用也由其在肿瘤微环境内以及全身性的升高而提示。参见，例如，Kadam等，Mol.Biomark.Diagn.(2013)4(3)。研究表明，在恶性状态下，TGF-β可诱导EMT，并且由此产生的间充质表型导致细胞迁移和侵袭增加。
Ab1和相关抗体可用于治疗过度增殖性疾病，例如癌症，包括但不限于皮肤癌(例如，黑素瘤，包括不可切除或转移性黑素瘤、皮肤鳞状细胞癌和角化棘皮瘤)、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食道癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌(例如，肝细胞癌)、原发性腹膜癌、膀胱癌、肾癌(renal cancer)或肾癌(kidney cancer)(例如，肾细胞癌)、尿路上皮癌、乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、***、子宫癌、***癌、睾丸癌、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌)、脑癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、间皮瘤、白血病和淋巴瘤。
在一些实施方案中，Ab1和相关抗体可用于治疗基于抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2治疗剂的先前治疗失败或预期会失败的患者中的癌症，即对抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2疗法为非响应者或预期为非响应者的患者。在一些实施方案中，Ab1和相关抗体可用于治疗已经从先前的抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2疗法复发的患者中的癌症。如本文所用，术语“预期”是指医学领域的技术人员在没有施用治疗的情况下，基于他/她的一般医学知识和患者的具体情况，可以预见到患者会是响应者还是非响应者，以及该疗法是否会失败或将不会有效。
在一些实施方案中，癌症是实体瘤的间叶性亚型，包括但不限于间叶性结肠直肠癌、间叶性卵巢癌、间叶性肺癌、间叶性头癌和间叶性颈癌。上皮间充质转化(EMT)通过下调上皮细胞基因和增强间充质基因表达来促进细胞迁移和侵入性质。EMT是肿瘤进展和侵入的标志。多达四分之一的结肠直肠癌和卵巢癌是间叶性的。因此，通过抑制TGF-β及其对EMT的诱导，Ab1或相关抗体可用于治疗间叶性实体瘤。实体瘤的间叶性亚型可通过许多遗传标志物和病理学检测来鉴定。标志物包括可通过qRT-PCR或免疫组织化学检测的ACTA2、VIM、MGP、ZEB2和ZWINT。此类标志物可用于选择用于本发明的抗TGF-β单一疗法或联合疗法的患者。
在一些实施方案中，Ab1和相关抗体可用于治疗晚期实体瘤患者。
Ab1和相关抗体也可用于治疗造血功能紊乱(hematopoietic disorder)或恶性肿瘤，如多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和白血病，以及各种肉瘤如卡波西肉瘤。
Ab1和相关抗体也可用于抑制环孢菌素介导的恶性肿瘤或癌症进展(例如，转移)。
当然可以理解的是，在癌症治疗的情况下，“治疗”包括致使癌症生长减缓、癌症进展或复发延迟、或癌症转移减少以及癌症部分缓解以延长患者的预期寿命的任何医学干预。
C.肿瘤学中的联合疗法
已经观察到，癌症中细胞毒性T细胞浸润的水平与有利的临床结果相关(Fridman等，Nat Rev Cancer(2012)12(4):298–306；和Galon等，Immunity(2013)39(1):11–26)。另外，辅助细胞毒性T细胞(CD4+ TH1)的T辅助细胞和它们产生的细胞因子(例如，INF-γ)通常也与积极的患者结果相关。相反，Treg细胞的存在已被证明与不良患者预后相关(Fridman，见上文)。
TGF-β抑制抗肿瘤免疫应答的几乎所有方面。该细胞因子促进iTreg分化并降低细胞毒性(CD8+)细胞增殖和浸润。如上所述，通过Ab1或相关抗体抑制TGF-β将减轻免疫抑制性肿瘤微环境，从而为癌症患者带来积极结果。
此外，发明人已经发现通过减轻免疫抑制性肿瘤微环境，Ab1和相关抗体可以允许检查点调节剂(例如抗PD-1抗体)更好地诱导免疫应答。因此，更多的患者可以从免疫治疗如抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2治疗中受益。
在使用或不用靶向免疫检查点分子的治疗剂的情况下，Ab1和相关抗体也可以与其他癌症疗法联合使用，其它癌症疗法例如化疗(例如，基于铂或紫杉烷类的疗法)、放射疗法和靶向癌症抗原或致癌驱动者的疗法。
可以通过涉及Ab1或相关抗体以及免疫检查点抑制剂例如抗PD-1抗体的组合来治疗的癌症包括上文小节中列出的癌症。
在一些实施方案中，癌症对于先前的抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2疗法是难治的，例如晚期或转移性黑素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、头颈部鳞状细胞癌和霍奇金淋巴瘤。难治性患者是疾病进展的患者，例如在开始治疗的12周内通过放射性方法没有任何响应证据而确认的。
在一些实施方案中，Ab1或相关抗体可以与另一种癌症疗法如抗-PD-1疗法联合使用以治疗间叶性癌症，例如结肠直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌、肾细胞癌、肝细胞癌和皮肤鳞状细胞癌。另见上文的讨论。
抗PD-1抗体的例子是nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab、MEDI0608(曾为AMP-514；参见例如WO2012/145493和美国专利9,205,148)、PDR001(参见例如WO2015/112900)、PF-06801591(参见例如WO 2016/092419)和BGB-A317(参见例如WO 2015/035606)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包括在WO 2015/112800中公开的那些(如在该PCT公开的表1中称为H1M7789N、H1M7799N、H1M7800N、H2M7780N、H2M7788N、H2M7790N、H2M7791N、H2M7794N、H2M7795N、H2M7796N、H2M7798N、H4H9019P、H4xH9034P2、H4xH9035P2、H4xH9037P2、H4xH9045P2、H4xH9048P2、H4H9057P2、H4H9068P2、H4xH9119P2、H4xH9120P2、H4xH9128P2、H4xH9135P2、H4xH9145P2、H4xH8992P、H4xH8999P和H4xH9008P的那些，和在该PCT公开的表3中称为H4H7798N、H4H7795N2、H4H9008P和H4H9048P2的那些)。WO2015/112800的公开内容通过引用整体并入本文。
例如，WO 2015/112800中公开的抗体和相关抗体，包括具有该PCT公开中公开的CDR、VH和VL序列或重链和轻链序列的抗体和抗原结合片段，以及与该PCT公开中公开的抗体结合相同PD-1表位的抗体和抗原结合片段，可以与本发明的Ab1或相关抗体联合用于治疗癌症。在相关实施方案中，有用的抗PD-1抗体可包含分别如下文中作为SEQ ID NO:5和6所示的重链和轻链氨基酸序列；SEQ ID NO:5和6中的VH和VL序列(斜体显示)，或SEQ ID NO:5和6中的一个或多个(例如全部六个)CDR(显示在框中)。
在一些实施方案中，本发明的抗体如抗PD-1抗体在重链中不具有C-末端赖氨酸。C-末端赖氨酸可以在制造期间或通过重组技术(即，重链的编码序列不包括C-末端赖氨酸的密码子)去除。如此在本发明内考虑的还有包含没有C-末端赖氨酸的SEQ ID NO:5的重链氨基酸序列的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗TGF-β抗体或片段也可以与针对免疫调节性抗原如PD-L1和CTLA-4的抗体联合使用。示例性的抗PD-L1抗体是atezolizumab、avelumab、durvalumab、LY3300054和BMS-936559。示例性的抗CTLA-4抗体是ipilimumab或tremelimumab。
D.治疗功效的生物标志物
Ab1和相关抗体的功效可以通过生物标志物或靶标占有率(target occupancy)来确定。例如，在肿瘤组织中，可通过使用Meso Scale Discovery(MSD)测定法评估活检组织中活性TGF-β的水平来测定靶标占有率。在血液中，可以通过评估外周血单核细胞如淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞上循环TGF-β降低的效果来测定靶标接合。例如，可以使用CD45+RO+CCR7+CD28+Ki67+作为流式细胞术中的标志物来评估循环CD8+ T细胞增殖的增加。循环NK细胞的活化可以使用CD3-CD56high/dim CD16+或CD137+作为流式细胞术中的标志物来评估。此外，Ki-67、PD-1和ICOS可以用作与T细胞活化相关的PD标志物。
通过使用例如NeoGenomics平台等多重免疫组织化学(IHC)测定法评估浸润性免疫细胞和免疫标志物的变化，由此可以测定通过Ab1或相关抗体治疗后的免疫调节。具体而言，NeoGenomic的MultiOmyx TIL Panel染色一组免疫标志物，允许定量测定各种免疫细胞的密度和定位。免疫标志物可表明iTreg的分化；CD8+ T细胞的浸润和增殖；并通过CD8+ T细胞产生IFNγ。已显示Ab1抑制CD4+ T细胞分化成iTreg(参见例如下文实施例3)，并增加CD8+ T细胞增殖及其产生IFNγ(如混合淋巴细胞反应测定法中所示；数据未显示)。因此，可以通过对iTreg的抑制、对CD8+ T细胞增殖和向肿瘤或其他患病组织的浸润的诱导、增加的IFNγ产生和/或CD8+ T细胞与Treg细胞的比率增加来指示Ab1或相关抗体的治疗功效。还可以通过基于甲基化-PCR的CD8+ T细胞、Treg细胞、NK细胞和其他免疫细胞的定量免疫细胞计数在外周血中测定Ab1或相关抗体治疗后的免疫调节。治疗功效在临床上可表现为疾病进展如肿瘤进展的延迟或逆转。
II.制备抗体的方法
Ab1和相关抗体，以及靶向其他共同靶标如PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体可以通过本领域充分确立的方法制备。可将编码抗体重链和轻链的DNA序列***到表达载体中，使得基因可操作地连接到必需的表达控制序列，例如转录和翻译控制序列。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、植物病毒如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、YAC、EBV衍生的附加体等。抗体轻链编码序列和抗体重链编码序列可以***分开的载体中，并且可以可操作地连接至相同或不同的表达控制序列(例如启动子)。在一个实施方案中，两种编码序列被***到同一表达载体中，并且可以可操作地连接到同一表达控制序列(例如，共同的启动子)，连接到分开的相同表达控制序列(例如启动子)或连接到不同的表达控制序列(例如启动子)。可以通过标准方法(例如连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或者如果不存在限制性位点则进行平端连接)将抗体编码序列***表达载体中。
除抗体链基因外，重组表达载体可携带控制宿主细胞中抗体链基因表达的调节序列。用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列的实例包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，例如来源于如下的启动子和/或增强子：逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤病毒和强哺乳动物启动子如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。
除了抗体链基因和调节序列之外，本发明的重组表达载体可以携带额外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。例如，选择标记基因赋予载体已经导入其中的宿主细胞对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。选择标记基因可以包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)、neo基因(用于G418选择)和谷氨酸合成酶基因。
将编码本发明抗体的表达载体导入宿主细胞中进行表达。宿主细胞在适合表达该抗体的条件下培养，然后将抗体收获并分离。宿主细胞包括哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。可用作表达宿主的哺乳动物细胞系在本领域中是公知的，并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系。这些中包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、293Freestyle细胞(Invitrogen)、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞和许多其他细胞系。可以基于它们的表达水平选择细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系，例如Sf9或Sf21细胞。
此外，使用许多已知技术可以增强抗体的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些条件下增强表达的常用方法。
用于宿主细胞的组织培养基可包含或不含动物衍生组分(ADC)，例如牛血清白蛋白。在一些实施方案中，无ADC的培养基对人的安全性是优选的。组织培养可以使用补料分批方法、连续灌注方法或任何其他适合宿主细胞和所需产率的方法进行。
III.药物组合物
本发明的抗体可以针对合适的储存稳定性配制。例如，可以使用药学上可接受的赋形剂将抗体冻干或保存或重构以供使用。对于联合疗法，可以将两种或更多种治疗剂例如抗体共同配制，例如混合并以单一组合物提供。
本文使用术语“赋形剂”来描述除本发明化合物之外的任何成分。赋形剂的选择在很大程度上取决于诸如特定施用模式、赋形剂对溶解性和稳定性的影响以及剂型的性质等因素。“药学上可接受的赋形剂”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的赋形剂的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合。在一些情况下，会在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药学上可接受的物质的另外的实例是润湿剂或少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加抗体的保质期或功效。
本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量制备、包装或散装销售(sold in bulk)。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用于受试者的活性成分的剂量或该剂量的方便的一部分，例如该剂量的一半或三分之一。
本发明的药物组合物通常适用于肠胃外施用。如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括任何特征如下的施用途径，其特征在于物理破坏受试者组织并通过组织中的所述破裂施用药物组合物，因此通常导致直接施用到血液中、肌肉中或进入内部器官。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物、通过手术切口施用组合物、通过组织穿透性非手术伤口施用组合物等来施用药物组合物。特别地，考虑的肠胃外给药包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、肿瘤内和滑膜内注射或输注；以及肾透析输注技术。也考虑区域灌注。优选的实施方案可包括静脉内和皮下途径。
适用于胃肠外施用的药物组合物的制剂通常包含与药学上可接受的载体(例如无菌水或无菌等渗盐水)组合的活性成分。这样的制剂可以适合于推注施用(bolusadministration)或连续施用的形式制备、包装或出售。注射制剂可以以单位剂量形式制备、包装或销售，例如在安瓿或含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于混悬液、溶液、油性或水性载体中的乳剂、糊剂等。这样的制剂可以进一步包含一种或多种另外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一个实施方案中，活性成分以干燥(即粉末或颗粒)形式提供，用于在肠胃外施用重构组合物之前用合适的载体(例如无菌无热原水)重构。胃肠外制剂还包括可含有赋形剂例如盐、碳水化合物和缓冲剂(例如，具有pH 3-9)的水溶液，但是对于一些应用，它们可以更合适地配制成无菌非水溶液或作为干燥形式与适宜的载体如无菌无热原水一起使用。示例性肠胃外施用形式包括在无菌水溶液中的溶液或混悬液，例如丙二醇水溶液或右旋糖水溶液。如果需要，可以适当缓冲这种剂型。可用的其它可以肠胃外施用的制剂包括含有微晶形式的活性成分或脂质制备物的那些制剂。用于肠胃外施用的制剂可以配制成立即和/或调节释放(modified release)。调节释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序释放。
IV.示例性实施方案
本发明的进一步具体的实施方案在下文中描述。
1.一种分离的单克隆抗体，其特异性结合人TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，所述抗体包含SEQ ID NO：1中的重链互补决定区(CDR)1-3和SEQ ID NO：2中的轻链CDR1-3，其中所述抗体包含在第228位(EU编号)具有脯氨酸的人IgG4恒定区。
2.如实施方案1的抗体，其中所述抗体包含对应于SEQ ID NO：1的残基1-120的重链可变结构域(VH)氨基酸序列和对应于SEQ ID NO：2的残基1-108的轻链可变结构域(VL)。
3.如实施方案2的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1中所示的重链氨基酸序列(具有或不具有C-末端赖氨酸)和SEQ ID NO：2中所示的轻链氨基酸序列。
4.如实施方案3的抗体的抗原结合片段，其中所述片段是F(ab’)2。
5.如实施方案1-4中任一项的抗体或片段，其中所述抗体或片段与fresolimumab相比具有增加的半衰期或增加的暴露。
6.如实施方案1-5中任一项的抗体或片段，其中所述抗体或片段具有以下性质中的一个或多个：
a)抑制CD4+ T细胞向可诱导型调节性T细胞(iTreg)的分化，
b)增加CD8+ T细胞增殖，
c)增加自然杀伤(NK)细胞的聚集，
d)增加MIP2的水平，和
e)增加KC/GRO的水平。
7.一种组合物，其包含实施方案1-6中任一项的抗体或片段，其中所述组合物包含少于1％的半抗体
8.如实施方案1-6中任一项的抗体或片段作为药物。
9.一种在有需要的患者中抑制TGF-β信号转导的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的如实施方案1-6中任一项的抗体或片段。
10.如实施方案9的方法，其中所述患者患有癌症。
11.如实施方案10的方法，其中所述癌症选自下组：黑素瘤、肺癌、皮肤鳞状细胞癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、肝细胞癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
12.如实施方案10或11的方法，其中所述癌症的特征在于ACTA2、VIM、MGP和ZWINT中的一种或多种的过表达。
13.如实施方案10-12中任一项的方法，其中所述癌症是间叶性肿瘤。
14.如实施方案10-13中任一项的方法，其中所述抗体或片段减轻免疫抑制性肿瘤微环境。
15.一种治疗患者中的癌症的方法，其包括向所述患者施用(1)如实施方案1-6中任一项的抗体或片段，和(2)免疫检查点蛋白的抑制剂。
16.如实施方案15的方法，其中所述免疫检查点蛋白是PD-1、PD-L1或PD-L2。
17.如实施方案16的方法，其中所述免疫检查点蛋白的抑制剂是抗PD-1抗体。
18.如实施方案17的方法，其中所述抗PD-1抗体包含SEQ ID NO:5中的重链CDR1-3和SEQ ID NO:6中的轻链CDR1-3。
19.如实施方案17的方法，其中所述抗PD-1抗体包含对应于SEQ ID NO:5的残基1-117的VH氨基酸序列和对应于SEQ ID NO:6的残基1-107的VL氨基酸序列。
20.如实施方案17的方法，其中所述抗PD-1抗体包含SEQ ID NO:5中所示的重链氨基酸序列(具有或不具有C-末端赖氨酸)和SEQ ID NO:6中所示的轻链氨基酸序列。
21.如实施方案15-20中任一项的方法，其中所述抗TGF-β抗体包含SEQ ID NO:1中所示的重链氨基酸序列(具有或不具有C-末端赖氨酸)和SEQ ID NO:2中所示的轻链氨基酸序列。
22.如实施方案15-21中任一项的方法，其中所述癌症对于抗PD-1抗体治疗是难治的。
23.如实施方案15-22中任一项的方法，其中所述癌症是晚期或转移性黑素瘤或皮肤鳞状细胞癌。
24.如实施方案15-23中任一项的方法，其中所述癌症是实体瘤的间叶性亚型。
25.如实施方案15-24中任一项的方法，其中所述癌症的特征在于ACTA2、VIM、MGP和ZWINT中的一种或多种的过表达。
26.如实施方案15-25中任一项的方法，其中所述癌症选自下组：黑素瘤、肺癌、皮肤鳞状细胞癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、肝细胞癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
27.如实施方案15-26中任一项的方法，其中所述抗体或片段减轻免疫抑制性肿瘤微环境。
28.如实施方案17-27中任一项的方法，其中所述抗TGF-β抗体和所述抗PD-1抗体在同一天向所述患者施用。
29.如实施方案17-28中任一项的用途，其中所述抗TGF-β抗体和所述抗PD-1抗体每两周向所述患者施用。
30.如实施方案17-29中任一项的用途，其中所述抗TGF-β抗体和所述抗PD-1抗体分别以0.05-20mg/kg体重的剂量施用。
31.一种在有需要的受试者中增加免疫应答的方法，包括向所述患者施用免疫检查点抑制剂和如实施方案1-6中任一项的抗体或片段。
32.如实施方案31的方法，其中所述检查点抑制剂是抗PD-1抗体。
33.如实施方案32的方法，其中所述抗PD-1抗体包含：
a)SEQ ID NO:5中的HCDR1-3和SEQ ID NO:6中的LCDR1-3；
b)分别对应于SEQ ID NO:5中的残基1-117和SEQ ID NO:6中的残基1-107的VH和VL；或
c)具有SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的重链(具有或不具有C-末端赖氨酸)和具有SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的轻链。
34.如实施方案31-33中任一项的方法，其中所述抗TGF-β抗体包含SEQ ID NO:1中所示的重链氨基酸序列(具有或不具有C-末端赖氨酸)和SEQ ID NO:2中所示的轻链氨基酸序列。
35.如实施方案31-34中任一项的方法，其中所述患者患有癌症。
36.如实施方案35的方法，其中所述患者对于先前的用所述免疫检查点抑制剂的治疗是难治的，和/或具有实体肿瘤的间叶性亚型。
37.如实施方案35或36的方法，其中所述癌症选自下组：黑素瘤、肺癌、皮肤鳞状细胞癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、肝细胞癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
38.如实施方案35-37中任一项的方法，其中所述癌症的特征在于ACTA2、VIM、MGP和ZWINT中的一种或多种的过表达。
39.如实施方案35-38中任一项的方法，其中所述抗体或片段减轻免疫抑制性肿瘤环境。
40.如实施方案1-6中任一项的抗体或片段供在上述方法的任一项中治疗患者中使用。
41.如实施方案1-6中任一项的抗体或片段用于制备用于在上述方法的任一项中治疗患者的药物的用途。
42.一种分离的核酸分子，其包含编码实施方案1-6中任一项的抗体或片段的重链、轻链或二者的核苷酸序列。
43.一种表达载体，其包含实施方案42的分离的核酸分子。
44.一种宿主细胞，其包含实施方案43的表达载体。
45.一种产生实施方案1-6中任一项的抗体或抗原结合片段的方法，所述方案包括：
提供宿主细胞，所述宿主细胞包含分别编码所述抗体或抗原结合片段的重链和轻链的第一和第二核苷酸序列，
使所述宿主细胞在允许所述抗体或抗原结合片段产生的条件下生长，和
回收所述抗体或抗原结合片段。
46.一种产生药物组合物的方法，其包括：
提供实施方案1-6中任一项的抗体或抗原结合片段，和
将所述抗体或抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂混合。
47.一种制品或试剂盒，其包含实施方案1-6中任一项的抗体或抗原结合片段以及另一治疗剂。
48.如实施方案47的制品或试剂盒，其中所述另一治疗剂是本文所述的免疫检查点抑制剂。
将在以下实施例中进一步描述本发明，其不会限制权利要求书中所述的本发明的范围。
实施例
为了更好地理解本发明，阐述了以下实施例。这些实施例仅用于说明，而不应被理解为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：Ab1的TGF-β-结合性质
使用葡聚糖包被的(dextran-coated)羧甲基化(CM5)系列S芯片，通过在BiacoreT200生物传感器仪器(GE Healthcare)上的表面等离子体共振测定了Ab1对所有人和鼠类TGF-β同种型的亲和力。将Ab1以一系列浓度(1.11、3.33、10和30nM)注射到固定的重组TGF-β上以实时测量结合相互作用。将TGF-β同源二聚体以低密度固定以降低亲合力效应。一式三份进行注射，并重复三次结合测定。使用Biacore T200 Biaevaluation v2.0软件处理来自动力学实验的数据。使用1:1结合模型将由此得到的传感图归零、比对、进行双重参照并修剪(cropped)以供曲线拟合分析，从而确定结合速率常数(ka)，解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)。
重组蛋白是内部产生的(人TGF-β1、2和3)或从R&D Systems获得的(鼠TGF-β1和2)。下表1显示恒河猴、小鼠或大鼠与人之间三种活性TGF-β同种型的氨基酸序列同源性(同源性作为保守氨基酸相对于总氨基酸的百分比报道)。
表1 TGF-β活性同种型与人的同源性
*大鼠和小鼠TGFβ1彼此100％同源，并且大鼠和小鼠TGFβ2彼此100％同源
由于人TGF-β3和鼠(murine)TGF-β3在氨基酸序列上是相同的，因此未计算这两种蛋白质的单独亲和力测量结果。同样，鼠和大鼠TGF-β1和2在氨基酸序列上是相同的，并且未计算单独的亲和力测量结果。
通过上述方法测定的Ab1的ka、kd和KD值列于下表2中。测定了Ab1对于人TGF-β1、2和3的KD值分别为1.48、3.00和1.65nM。测定了Ab1对鼠/大鼠TGF-β1和2的KD值分别为2.80和1.88nM。这些结合性质与fresolimumab的相似。
表2 Ab1对于TGF-β的平衡常数和亲和力
上述数据表明，Ab1是强力且具有选择性的泛-TGF-β抑制剂。使用表面等离子体共振的测量表明，Ab1对于所有人和鼠类TGF-β同种型具有1至5nM的亲和力。通过使用正常大鼠、食蟹猴和人组织的GLP免疫组织化学(IHC)组织交叉反应性研究确认了高水平的特异性。
实施例2:Ab1的TGF-β中和效力
在基于细胞的测定中测量了Ab1在中和TGF-β活性方面的体外效力。该测定法测量TGF-β抑制未转化的貂肺上皮细胞(Mv 1 Lu细胞)增殖的能力。参见，例如，WO 2006/086469和Mazzieri等编辑，“Methods in Molecular Biology”，第142卷，“Transforming GrowthFactor-βProtocols”。评价了Ab1、fresolimumab和1D11(一种鼠类抗TGF-β抗体，其重链和轻链序列在本文中公开为SEQ ID NO:9和10)中和人TGF-β1、2、3和鼠TGF-β1和2的能力。重组TGF-β蛋白在内部产生(人TGF-β1、2和3)或从R&D Systems获得(鼠TGF-β1和2)。
所有人和鼠TGF-β同种型在0.02pg/ml至10ng/ml范围内以剂量依赖性的方式抑制了貂肺细胞的增殖。为了量化Ab1、fresolimumab和1D11的效力，将1ng/ml指定的TGF-β和连续稀释的抗体与貂肺细胞一起温育。温育三天后，通过在与DNA结合时发荧光的CyQUANT染料定量细胞增殖(图1A-E)。数据显示Ab1、fresolimumab及其鼠类替代物1D11以相似的程度抑制了所有人和鼠类TGF-β同种型。
实施例3：Ab1对诱导型T调节性细胞分化的抑制
调节性T细胞(Treg)是免疫抑制性的，并且已经与癌症患者的负面结果相关。在下述研究中，我们研究了Ab1是否能够抑制TGF-β诱导的人CD4+ T细胞向可诱导型调节性T细胞(iTreg)的分化。原代人CD4+ T细胞从健康的正常供体分离。人TGF-β1购自R&D Systems。
为了研究Ab1对由培养的细胞内源性产生的TGF-β的拮抗剂活性，用50μg/ml的同种型对照(人IgG4，κ抗鸡卵溶菌酶(HEL)抗体，Crown Biosience)、Ab1或fresolimumab，在存在或不存在刺激(抗CD3、抗CD28和IL-2)的条件下，在不添加外源性TGF-β的情况下处理总体CD4+ T细胞达6天，然后进行流式细胞术分析。从亲本群体(淋巴细胞/活的/单个细胞/CD4+CD127-)一式三份计算CD25+FOXP3+群体的平均百分比和标准偏差。用抗CD3、抗CD28和IL-2刺激总体人CD4+ T细胞将培养物中FOXP3+CD25+(iTreg)的百分比从0％增加到15％。用50μg/ml Ab1或50μg/ml fresolimumab治疗以相似的程度降低了iTreg的百分比(分别为8％和7％；图2)。相反，用同种型人IgG4(hIgG4)对照的处理对iTreg分化的影响最小(20％iTreg)(图2)。从第二位健康的正常志愿者分离的CD4+ T细胞产生了相似的结果。
为了研究Ab1对外源性TGF-β的拮抗剂活性，将与2ng/ml人TGF-β1一起温育的总体CD4+ T细胞用同种型对照、Ab1或fresolimumab在不同抗体浓度下，在存在或不存在刺激(抗CD3、抗CD28和IL-2)的条件下处理6天，然后进行流式细胞术分析。除非另有说明，否则从亲本群体(淋巴细胞/活的/单细胞/CD4+CD127-)一式三份计算CD25+FOXP3+群体的平均百分比和标准偏差。向经刺激的总体人CD4+ T细胞中添加外源性TGF-β1(2ng/ml)将培养物中iTreg的百分比从15％增加至55％。用浓度渐增的Ab1的处理使iTreg的百分比以伴随的方式从55％降低至200μg/ml下的15％和6.25μg/ml下的43％。用fresolimumab处理使iTreg的百分比降低至与Ab1类似的程度(在200μg/ml时从55％至16％，而在6.25μg/ml时从55％至32％)。用不同浓度的同种型对照抗体处理对于iTreg的百分比没有影响，在200μg/ml和6.25μg/ml为60％。参见图3。从第二位健康的正常志愿者分离的CD4+ T细胞产生了相似的结果。
这项研究表明，Ab1抑制TGF-β诱导的iTreg分化，并因此可通过减轻免疫抑制性肿瘤微环境而带来临床益处。
实施例4：Ab1和抗PD-1抗体组合在体外的作用
在这项研究中，我们研究了抗PD-1治疗后TGF-β是否会阻止体外T细胞的最大刺激，并且如果是这样，那么Ab1是否可以抵消这种阻止。使用在来自NFATc(活化T细胞的核因子，细胞质1)调节序列的转录控制下的表达构建体的萤光素酶表达来测量T细胞活化的水平。
我们使用了购自Promega的细胞测定系统进行这项研究。该系统包含两种细胞类型：1)表达由NFAT应答元件驱动的人PD-1和萤光素酶报告基因的Jurkat T细胞，和2)表达人PD-L1和经设计以抗原非依赖性方式激活同源的T细胞受体的工程化细胞表面蛋白的CHO-K1细胞。在共培养时，Jurkat T细胞与CHO-K1细胞相互作用，引起T细胞受体刺激和NFATc易位至细胞核中，在那里其驱动萤光素酶表达。然而，PD-1/PD-L1的参与将酪氨酸蛋白磷酸酶非受体11(SHP2)募集至T细胞受体复合物，抑制NFATc核易位和随后的萤光素酶表达。PD-1信号传导的阻断缓解了SHP2依赖性抑制，并因此允许最大的萤光素酶表达。因此该系统提供了用于确定TGF-β对T细胞信号传导的作用以及Ab1对T细胞的抗PD-1治疗的影响的功能性方法。
由于与TGF-β依赖性作用相关的缓慢动力学，在T细胞受体刺激之前用TGF-β预处理Jurkat T细胞。人TGF-β1购自R&D Systems。用于Ab1的同种型对照抗体(抗HEL hIgG4)购自Crown Bioscience(目录号C0004-5)。小鼠抗hPD-1 IgG及其同种型对照抗体购自BioLegend(目录号329912)。针对每种样品分析了十四个重复。
结果显示将抗hPD-1抗体添加至与CHO-K1细胞共培养24小时的Jurkat T细胞诱导了萤光素酶活性(865794相对发光单位[RLU])的程度大于添加同种型对照(234963 RLU，倍数变化＝3.685，p值<0.0001)或者仅仅不存在抗体(206043RLU，倍数变化＝4.202，p值<0.0001)。用18ng/ml TGF-β1预处理Jurkat T细胞12天在存在抗hPD-1抗体的CHO-K1细胞共培养物中，与未用TGF-β1处理的Jurkat T细胞相比(865794 RLU，倍数变化＝-1.355，p值<0.0001)，诱导了更少的萤光素酶活性(638866 RLU)(图4)。
为了评估Ab1的拮抗效力，将Jurkat T细胞在存在Ab1、同种型对照Ab或无Ab的情况下用18ng/ml TGF-β1预处理12天，然后与CHO-K1细胞在抗PD-1存在下共培养24小时。与同种型对照Ab(639440RLU，倍数变化＝1.445，p值<0.0001)和无Ab对照(638866 RLU，倍数变化＝1.447，p值<0.0001)相比，Ab1(924186 RLU)的存在缓和了萤光素酶活性的TGF-β-依赖性抑制。将使用Ab1(975654 RLU)或同种型对照(955717 RLU)的对照组加入未用TGF-β1预处理的Jurkat T细胞中，并在抗-PD-1 Ab存在下与CHO-K1细胞共培养物共培养，与无Ab对照相比具有统计学上升高的萤光素酶活性，但是具有最小的倍数变化(865794 RLU，倍数变化＝1.127和1.104，p值分别为0.0023和0.001284)(图4)。RLU值也列在下面的表3中。
表3 T细胞活化测定中的相对发光单位
为了排除对Jurkat T细胞的TGF-β1预处理可能导致降低的增殖或存活力，并因此在与CHO-K1细胞共培养24小时期间导致了降低的萤光素酶活性的可能性，我们将Jurkat T细胞与18ng/ml TGF-β1或PBS在Ab1、抗HEL hIgG4或无抗体(载体)的存在下温育7天。每2至3天用等体积的各个组接种新的培养瓶，此时TGF-β1和抗体二者都被刷新(总共发生两次再接种事件)。最终培养物的评估表明，所有处理组的存活力未变(范围从94％至96％)。此外，每个处理组的最终培养物中的Jurkat T细胞总数非常相似(范围从2500至2900万)。
上述研究表明，抗PD-1治疗后T细胞受体下游的信号传导的增加被TGF-β抑制，导致次最佳(sub-optimal)T细胞刺激。我们的数据表明，抑制TGF-β减轻了免疫抑制肿瘤微环境，并允许检查点调节剂如抗PD-1剂更好地诱导免疫应答，从而增加受益于免疫肿瘤治疗的患者比例。
实施例5：Ab1和抗PD1抗体组合在体内的作用
接下来我们研究了在C57BL/6小鼠癌症模型中抗TGF-β和抗PD-1联合治疗的作用。
耐受性/初步安全性
材料和方法
在C57BL/6雌性小鼠中评估了Ab1和抗小鼠PD-1(mPD-1)单克隆抗体(mAb)作为单一药剂和组合的耐受性。Ab1(10、20和50mg/kg)或同种型对照Ab(购自Crown Bioscience的抗HEL hIgG4；以10和20mg/kg使用)每三天IV施用(Q3D)，作为单一药剂或与每周两次5mg/kg IV的抗PD1 Mab组合。本研究中使用的抗PD1 Ab被命名为“antimPD1_hyb_RMP114_mIgG1LCfullrat”(或x抗mPD-1 Mab)。它是通过用小鼠IgG1Fc区替代大鼠IgG2a克隆RMP1-14(BioXcell，目录号BE0146)的大鼠Fc区产生的嵌合大鼠抗mPD-1抗体。这种嵌合抗体的重链和轻链氨基酸序列示于SEQ ID NO:7和8中。通过测量动物体重和临床观察结果来评估耐受性。在三周治疗结束时，在最后一次治疗后4小时，进行终末采样，并将组织(心脏、肾脏、肝脏、肺脏和脾脏)固定在甲醛中并送去进行组织病理学分析。
如果剂量在单个小鼠中在连续三天期间产生了15％体重减轻，在一天期间产生了20％体重减轻，或10％或更多的药物相关死亡，则该剂量被认为是过度毒性的，除非在对照运载体处理组观察到导致体重下降的肿瘤诱导的恶病质。动物体重包括了肿瘤重量。
毒性/安全性结果
在C57BL/6小鼠中的耐受性研究显示，所有测试的剂量水平的单一药剂以及Ab1与x-抗mPD-1 Mab的组合都是良好耐受的。在所有测试剂量的任何治疗组中都没有观察到体重的重大变化。研究期间未观察到严重或主要的临床观察结果。组织病理学分析鉴定了所有处理组(包括同种型对照抗体处理的组)的脾脏(白髓)中淋巴细胞的数量增加，无论组合并且没有任何剂量关系。没有观察到其他显著的显微发现。在研究的最后一天最后一次施用后，来自联用组(同种型对照Ab(10mg/kg)和抗PD-1 Mab(5mg/kg))的两只小鼠被发现死亡。组织病理学分析没有发现任何与药物有关的死亡原因。
功效研究
评估了在携带皮下MC38同基因结肠肿瘤的C57BL/6小鼠中组合抗TGF-β和抗PD-1治疗的效果。给予小鼠25mg/kg的Ab1、5mg/kg的x-抗mPD-1Mab或两者，Q3D，持续三周。这项研究证明，Ab1和抗mPD-1 Mab联用比仅单一药剂具有显著更高的抗肿瘤活性。下面详细描述这项研究的材料和方法以及数据。
材料和方法
动物
雌性C57BL/6小鼠获自Charles River Labs(Wilmington，MA，USA)。在研究登记前让动物适应环境至少3天。在研究开始时，小鼠为11周龄，体重在17.0至20.9g之间。它们可以自由获得食物(Harlan 2916啮齿动物饮食，美国马萨诸塞州)和无菌水，并且在12小时光照/黑暗周期中饲养。
肿瘤细胞
MC38是结肠腺癌细胞系。细胞从国立癌症研究所(National Cancer Institute)(Bethesda，MD，USA)获得并且在37℃下5％CO2中在完全培养基(CM)中培养，所述培养基包括具有L-谷氨酰胺的Roswell Park Memorial Institute培养基(RPMI)-1640(Gibco，目录号11875)，补充有10％热灭活胎牛血清(HI FBS)(Gibco，目录号10438026)。将细胞收获并重悬于Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(Gibco，目录号14190)中，并将每小鼠1x 106个细胞/200μl皮下(SC)植入雌性C57BL/6小鼠的右侧。
化合物
Ab1在水溶液中施用至动物。其通过PES进行0.22μm过滤，并以无菌等分试样储存在2-10℃。将抗体以10ml/kg腹膜内(IP)，25mg/kg给予动物。
使用抗HEL hIgG4(Crown Bioscience)作为Ab1的同种型对照。这种抗体以10ml/kg通过IP，25mg/kg给予对照动物。
x-抗mPD-1 Mab(同上)在DPBS(Gibco，目录号14190-094)中提供，并以10ml/kg，5mg/kg通过IP给予动物。
研究设计
在第0天，为60只动物植入MC38肿瘤细胞。植入后第8天，将平均肿瘤大小为50-75mm3的小鼠合并并随机分配至对照组和治疗组(每组10只小鼠)。在第9天开始用上述剂量的运载体(PBS，pH7.2)、抗HEL hIgG4、Ab1和抗mPD-1 Mab处理，并在第12、15、18、21和27天重复。将用运载体和抗HEL hIgG4处理的动物用作对照。每天检查小鼠并记录不良临床反应。一周将各个小鼠称重三至四次直至实验结束。
当观察到病态或体重减轻≥20％时，使小鼠安乐死。用卡尺每周两次测量肿瘤直至最终处死。当肿瘤大小达到约2000mm3或存在动物健康问题(肿瘤面积的20％溃疡)时，动物将被安乐死并记录死亡日期。从二维肿瘤测量结果估计实体肿瘤体积并根据以下等式进行计算：
肿瘤体积(mm3)＝[长度(mm)x宽度2(mm2)]/2
然后给定日的组的百分比中值消退(regression)通过取得针对该组中每只动物在该日计算的个体百分比消退的中值来获得。计算的日期是在计算ΔT/ΔC(即，治疗组和对照组之间的肿瘤体积从基线变化的中值的比例)的那天确定的，除非中值百分比消退不代表该组的活性。在那种情况下，当中值百分比消退最大时的第一天确定为这一天。如果肿瘤体积降至在治疗开始时肿瘤体积的50％，则将消退定义为部分的(PR)。当肿瘤体积低于14mm3或无法记录时，认为已经实现了完全消退(CR)。
功效
主要功效终点是由ΔT/ΔC、中值百分比消退、部分消退和完全消退指示的与基线相比的肿瘤体积变化。通过从在指定观察日肿瘤体积中减去第一次治疗当天(分期日(staging day))的肿瘤体积，每天对每只动物计算每个治疗组(T)和对照组(C)的肿瘤体积变化。计算治疗组的中值ΔT，并计算对照组的中值ΔC。计算比率ΔT/ΔC并以百分比表示：
ΔT/ΔC＝(中值ΔT/中值ΔC)x 100
ΔT/ΔC比率≤40％被认为有治疗活性。ΔT/ΔC比率为0％被认为是肿瘤停滞。ΔT/ΔC比率<0％被认为是肿瘤消退。
将肿瘤消退百分比定义为与在研究开始时(t0)的肿瘤体积相比，在指定观察日治疗组中肿瘤体积减少的百分比。在特定时间点(t)并且对于每只动物，使用以下公式计算百分比消退：
％消退(在t时)＝[(体积t0–体积t)/体积t0]x 100
然后通过取得为组中每只动物计算的个体％消退值的中值来计算在给定日组的中值百分比消退。计算的日期由计算ΔT/ΔC的日期决定，除非中值百分比消退不代表该组的活性。在那种情况下，通过中值百分比消退最大时的第一天确定这一天。
统计学分析
对与基线相比的肿瘤体积变化进行具有因子治疗和天数(重复)的双向ANOVA类型。在显著治疗*天数相互作用或治疗效果的情况下，随后进行带有Bonferroni-Holm校正多重性的对比分析以在第8天至第27天的每一天比较所有的治疗组与对照组。针对每只动物并且在每天计算肿瘤体积相对于基线的变化，其通过从指定的观察日的肿瘤体积中减去第一次治疗当天(第8天)的肿瘤体积计算。
因为在组之间观察到差异的异质性，所以对于ANOVA类型模型(SAS InstituteInc.(2008)SAS/STAT 9.2用户指南，Cary NC)选择了具有组＝选项的复合对称(CS)协方差结构。在图5和图6中，对于每个测量日呈现每组的中值和中值绝对偏差(MAD)。在下面的表4-6中，为每个测量日报告每组的中值和归一化MAD(nMAD＝1.4826*MAD)。所有统计分析均使用SAS版本v9.2软件进行。小于5％的概率(p<0.05)被认为是显著的。
功效结果
用Ab1、抗PD-1 Mab或两者的组合处理带有肿瘤的C57BL/6小鼠也具有良好耐受性且无毒性，如动物的一般健康和活动以及没有体重的显著变化所表明的。作为单一药剂，25mg/kg Q3D的Ab1和5mg/kg Q3D的抗PD-1 Mab分别导致最低点仅3.4％(第9天)和2.1％(第9天)的体重损失值。Ab1(25mg/kg Q3D)和抗PD-1 Mab(5mg/kg Q3D)的组合也是良好耐受的，显示最低点1.3％(第9天)的体重损失值(表4)。
作为单一药剂，与用Ab1同种型对照(抗HEL hIgG4)处理的动物相比，Ab1(25mg/kgQ3D)和抗PD-1 Mab(5mg/kg Q3D)显示对肿瘤生长没有扰动。治疗第27天的ΔT/ΔC比率分别为93％和109％(表4)。抗PD-1 Mab和抗HEL hIgG4的组合显示最小的抗肿瘤活性，在治疗的第27天ΔT/ΔC为31％(与对照组没有统计学差异)，并且在10只小鼠中只有2只观察到完全消退。然而，抗PD-1 Mab和Ab1的组合在第15天至第27天表现出优异的抗肿瘤活性，在治疗的第27天具有-1ΔT/ΔC(统计学上不同于对照组)，并且在10只小鼠中的6只中观察到完全消退(表4)。
表4 Abl和X抗mPD-1 Mab在C57BL/6 MC38癌症模型中的活性
*ΔW表示最低点处每组的平均体重变化％。
**在对距离基线的肿瘤体积变化进行重复测量的双向ANOVA-Type之后，使用Bonferroni-Holm调整多重性，使用比较各治疗组与对照的对比分析获得p值。小于5％的概率(p<0.05)被认为是显著的。
表5和6以及图5-7提供了另外的数据，其显示了单独或组合的抗体对小鼠模型中肿瘤体积的活性。
表5处理组与对照组的比较
*在对距离基线的肿瘤体积变化的双向Anova-Type之后，使用Bonferroni-Holm调整多重性，使用每天相对于对照的对比分析获得p值。
表6 Ab1和X-抗mPD-1 Mab作为单一药剂与组合的对比
*在对距离基线的肿瘤体积变化进行双向Anova-Type之后，使用Bonferroni-Holm调整多重性，使用比较每天Ab1、抗HEL hIgG4和x-抗mPD-1的组合相对于组合中涉及的剂量的每种单一药剂的对比分析获得p值。
表格和附图中的数据显示，25mg/kg Q3D的Ab1和5mg/kg Q3D的x-抗mPD-1 Mab的组合比那些剂量下的任一抗体具有更高的抗肿瘤效果。当将组合与作为单一药剂的Ab1比较时，在第19、23和27天的p值分别为0.0007、<0.0001和<0.0001，这种差异是统计学显著的。当将组合与作为单一药剂的x-抗mPD-1 Mab比较时，在第19、23和27天的p值分别为0.0276、0.0004和0.0024，这种差异也是统计学显著的(表6)。对于25mg/kg Q3D的抗HELhIgG4和5mg/kg Q3D的x-抗mPD-1 Mab的联用组，在测量任何一天在从基线的肿瘤体积变化上的治疗效果与单独使用任一种药剂的效果没有显著差异。
总之，从第15天至第27天，25mg/kg Q3D的Ab1和5mg/kg Q3D的抗mPD-1 Mab的组合具有比单独使用的任一种药剂显著更大的抗肿瘤效果。
在另一项研究中，我们评估了剂量为1、10或25mg/kg的Ab1与剂量为5mg/kg的小鼠PD-1抗体对C57BL/6J小鼠中皮下MC38小鼠结肠癌模型的抗肿瘤活性。将指数生长的MC38结肠腺癌细胞(NCI，Frederick，MD)在补充有10％FBS的RPMI-1640中在湿润的5％CO2培养箱中培养，然后皮下植入(1X106个细胞)到雌性C57/Bl6J小鼠侧腹(Jackson Laboratory,BarHarbor,ME)。一旦肿瘤达到50-75mm3的平均大小，则将小鼠合并并随机分配至对照组和治疗组(每组10只小鼠)。然后用PBS、IgG4同种型对照抗体(25mg/kg)或Ab1(1、10和25mg/kg)腹膜内处理带有肿瘤的小鼠，每周三次，直到每只动物接受总共6至7个剂量。用数字卡尺每周测量肿瘤2次并计算肿瘤体积(mm3＝L x W x H)并用GraphPad Prism绘图。如果肿瘤生长至>2000mm3，或肿瘤展现出溃疡>20％的肿瘤面积，则在研究结束时将小鼠用CO2安乐死。
作为单一药剂，剂量为25mg/kg Q3D的Ab1和剂量为5mg/kg的小鼠α-PD-1抗体分别在携带MC38肿瘤的小鼠中表现出2/8和4/8完全消退的部分活性。1、10或25mg/kg Q3D的Ab1与5mg/kg Q3D的小鼠α-PD-1抗体的组合具有治疗活性。在植入后第24天，当比较相对于基线的肿瘤体积变化时，所有测试剂量的Ab1和5mg/kg Q3D的小鼠α-PD-1抗体的组合的效果大于每种单一药剂的效果，其中对于1、10和25mg/kg的Ab1分别为5/8、6/8和7/8完全消退。表6A提供了对结果的总结。
表6A Ab1+抗mPD-1 mAb组合的抗肿瘤效果
总之，这些临床前数据表明，PD-1抑制与TGF-β抑制的组合能够比仅是单独的检查点抑制剂更大程度地抑制肿瘤生长。
实施例6：肿瘤内TGF-β1水平
在LoVo结肠直肠癌皮下异种移植物移植的BALB/c小鼠模型中研究了肿瘤内TGF-β1水平。在肿瘤体积小于100mm3时开始，为小鼠每3天静脉内注射10、25或50mg/kg的Ab1或同种型对照Mab，共8次IV施用。
将在-80℃下储存在具有2.8mm陶瓷球(MoBio 13114-50)的2ml塑料管中的肿瘤样品在室温下解冻。向组织添加1毫升(ml)冷的Meso Scale Diagnostic(MSD)Tris Lysis缓冲液(R60TX-2)(补充有1x HaltTM蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo 78440))，然后使用24 Dual匀浆器(Bertin Instruments)在2个循环中以6500rpm在4℃进行匀浆，每个循环20s。通过在4℃下在Eppendorf 5417C离心机中以20,000xg离心10分钟来澄清裂解物。如上所述，将上清液转移至干净的冷冻Eppendorf管中并通过再离心20分钟进一步使之澄清。之后，将上清液转移至塑料96-孔储存块中，在液氮中快速冷冻，并在-80℃下储存。
第二天将样品在室温下解冻并置于冰上。根据制造商的说明使用BicinchoninicAcid(BCA)Protein Assay试剂盒(Thermo 23225)测量裂解物中的蛋白质浓度。通过使用具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的MSD Tris Lysis缓冲液(参见上文)将裂解物标准化至约8mg/ml的蛋白质浓度，并等分在塑料微型管中。
使用电化学发光测定法使用人TGF-β1试剂盒(MSD，K151IUC-2)根据制造商的说明测量了标准化肿瘤裂解物中的TGF-β1浓度。使用在MSD Lysis Buffer中连续稀释的重组小鼠TGF-β1(R&D Systems,目录号7666-MB-005)作为校准物。将样品一式两份加载在平板上。使用MESO SECTOR S 600读板器(MSD)测量了电化学发光信号，并且基于标准曲线使用MSDDiscovery Workbench软件v4.0定量了样品中的TGF-β1浓度。
通过软件计算了样品一式两份重复的平均浓度。由软件确定为“低于拟合曲线范围(Below Fit Curve Range)”或“低于检测范围(Below Detection Range)”的浓度值用零值代替。为了计算每mg总蛋白质的TGF-β1浓度，用测定中测得的浓度(pg/ml)除以样品中的蛋白质浓度(mg/ml)。
结果显示，注射了同种型对照的小鼠的肿瘤内TGF-β1水平具有21.4pg/mg总蛋白的中值，在注射了Ab1的小鼠中的相应水平是检测不到的(图8)。
为了证明上述发现在人类中的相关性，我们使用上述方法如上所述测试了10份人结肠直肠肿瘤样品和10份人黑素瘤肿瘤样品的肿瘤内TGF-β1水平。对于人CRC样品，TGF-β1水平在约7至25pg/mg范围内。对于人黑素瘤样品，TGF-β1水平在约1pg/mg至高达43pg/mg的范围。这些数据进一步支持了抗TGF-β1治疗剂如Ab1在单独或与其他免疫检查点抑制剂如抗PD-1抗体联合的情况下在***方面的用途。
实施例7：Ab1的药代动力学研究
本实施例描述了表征Ab1的药代动力学(PK)概貌并将其与fresolimumab药代动力学(PK)概貌相比较的研究。在一项研究中，为5组空肠Sprague-Dawley大鼠静脉内给予5mg/kg单剂量的Ab1或fresolimumab。每组有五只雌性和五只雄性。在给药后0.25、6、24、48、72、144、192和240小时收集来自大鼠的血液。通过ELISA确定了Ab1和fresolimumab血清浓度。如果(测试物质与参考物的)AUC比率的90％置信区间在80％至125％的范围内，则确定了可比性。
图9A中显示了来自五组大鼠的抗体血清浓度随时间的变化。来自组2、4和5的PK参数(参见图9A的图例)显示在下表7中。此项研究显示，Ab1具有线性PK表现，具有比fresolimumab长得多的半衰期(平均T1/2为7.1天，相对于4.3天)和较低的消除速率(CL为0.30ml/hr/kg，相对于0.51ml/hr/kg)。数据显示Ab1在大鼠中具有fresolimumab的1.7倍高的暴露。
表7 Fresolimumab和Ab1之间的PK比较
*组平均值±SD与“fresolimumab(B2)”组有统计学差异(图9A中的组2).
在食蟹猴组中进行了关于Ab1的另外一项PK研究(研究2)。每组有五只雌性和五只雄性，并且给予静脉内输注1mg/kg(图9B)或10mg/kg(图9D)的单剂量的Ab1，或者每剂量1mg/kg(图9C)或10mg/kg(图9E)的5次每周剂量的Ab1。图9B-E中显示了猴中Ab1的血清浓度随时间的变化。在以前的研究中以单次或重复Q2W(双周)剂量给予猴子的fresoliumamb随着时间的血清浓度也显示在图中用于比较。这些数据显示，在单次和重复给药后，Ab1在猴子中也具有线性PK表现，并且显示出比每剂量1mg/kg和10mg/kg两种剂量的fresolimumab更高的暴露。在10mg/kg的单次给药下，Ab1具有13天的半衰期，而fresolimumab具有4.5天的半衰期；Ab1具有约0.40ml/hr/kg的CL，而fresolimumab具有0.66ml/hr/kg的CL。与大鼠研究一样，猴子研究也显示Ab1比fresolimumab具有约1.7倍的更高的暴露。
上述研究表明，Ab1与fresolimumab相比在体内具有统计学显著更长的半衰期，更长的清除时间和更高的生物暴露。
此外，在携带Ab12肿瘤的Balb/C小鼠中的研究显示，Ab1具有类似的PK概貌，无论其是静脉内还是腹膜内施用。
在双室模型(two-compartment model)上使用异速定标(allometric scaling)，我们根据猴子数据预测了70kg男性中的以下PK参数(表8)：
表8 PK参数的异速建模
PK参数
猴子中的Ab1
人中的Ab1
T<sub>1/2</sub>(天数)
13.1
20.9
CL(ml/hr/kg)
0.392
5.7
V1(中央室)(L)
0.104
2.43
Q(ml/hr)
3.18
46
V2(周边室)(L)
0.0693
1.62
在人类中Ab1的预测PK参数也比fresolimumab的预测PK参数更有利。例如，在人体中fresolimumab的CL为12.3ml/hr/kg，比Ab1的清除速率快。
实施例8：Ab1的毒理学研究
Ab1的毒理学研究在大鼠和食蟹猴中进行。在重复剂量的GLP(良好的实验室操作)中每周评估安全药理学终点达5周。在猴子中高达10mg/kg/剂量(浓度为2mg/ml)的剂量和在大鼠中高达30mg/kg/剂量(浓度为6mg/ml)的剂量下，在注射部位没有观察到Ab1相关的组织病理学发现。在这项研究中，在神经系统检查、体温、呼吸率、血压和ECG参数方面测试的任何剂量水平都没有注意到Ab1相关的影响。
发现大鼠的NOAEL(没有观察到的不良反应的水平)为每周重复给药5周3mg/kg/剂量，且发现大鼠的STD10(导致10％的动物死亡或不可逆的严重毒性的严重毒性剂量)为3至10mg/kg/剂量。毒性包括以多个增厚的结节为特征的心脏瓣膜增殖；和异常肺部状况，如混合细胞肺泡渗出液、混合细胞血管周围浸润、肌肉动脉肥大、出血和/或肺重增加。
发现每周重复给药5周的猴子的NOAEL和HNSTD(即，最高非严重毒性剂量，在其之上发生致死性、危及生命的毒性或不可逆的毒性)为10mg/kg/剂量(参考fresolimumab，当其每两周施用达7或13次剂量或Q3D施用达4周时，其猴子中的NOAEL显示为1mg/kg)。另见下表9中的数据。
表9大鼠和猴子的毒理学研究总结
基于上述毒理学数据，预期Ab1可以以约0.05mg/kg至0.5mg/kg每周或者更低频率例如每两周的剂量水平安全地施用于人类患者。
实施例9：抗TGF-β单一疗法的体内功效
在此项研究中，我们研究了1D11(一种与人和小鼠TGF-β1、2和3交叉反应的小鼠IgG1抗牛TGF-β抗体)对转移性同基因(syngeneic)肿瘤模型的影响。在该模型中，通过IV将B16-F10小鼠黑素瘤细胞引入C57BL/6小鼠的足垫中，并在小鼠的引流***中形成转移。虽然用对照抗体13C4处理没有效果，但在肿瘤接种后一天开始每周三次用50mg/kg 1D11处理完全消除了转移。
为了研究免疫应答的作用，将B16-F10植入β2-微球蛋白基因中有缺陷并因此缺乏CD8+细胞毒性T细胞应答的小鼠的足垫中并如前处理。与有免疫活性的小鼠(immunecompetent mice)中所见到的结果相反，1D11对这些小鼠中引流***中转移的数量没有影响。这些结果表明TGF-β抑制作用的机制依赖于适应性细胞免疫。
实施例10：癌症中的TGF-β签名标记(Signatures)
先前的研究已经表明，对抗PD-1疗法没有应答的黑素瘤患者具有转录签名标记IPRES(Hugo等，Cell(2016)165:35-44)。为了研究对抗PD-1单一疗法的先天性抗性的机制，我们研究了无应答者相对于应答者的转录签名标记。我们发现，使用基因组富集分析(GeneSet Enrichment Analyses)将这些概貌(profile)与具有超过1M个概貌的数据库比较，揭示了抗PD-1应答与肿瘤中TGF-β信号传导的活化之间的强相关性。这些数据表明，在黑素瘤中在基线时，TGF-β与抗PD-1单一疗法的先天性抗性相关。
此外，我们不仅发现抗PD-1应答与TGF-β信号传导活化之间存在相关性，而且还发现相关性很强(R＝0.59，t检验的p值<9E-4)。因此，我们得到了我们的关口指征(gatewayindication)1：黑素瘤(例如，转移性黑素瘤)中TGF-β介导的免疫抑制可能导致先天性抗性。此外，我们发现TGF-β诱导的基因表达变化可通过1D11处理淬灭，证实了TGF-β活化签名标记的特异性。这些结果为联合使用抗TGF-β和抗PD-1治疗剂治疗对抗PD-1单一疗法无应答的癌症患者提供了支持。
对黑素瘤之外的其他肿瘤类型之中这种相关性的分析揭示了间充质肿瘤(例如，CRC、HCC、头颈部鳞状细胞癌和卵巢癌)也富含TGF-β活化和预测的抗PD-1抗性二者。这一发现与TGF-β信号传导在EMT中的作用一致。因此，我们到达了我们的关口指征2：间充质肿瘤，尤其是那些带有免疫浸润的肿瘤，可能受益于抗TGF-β和抗PD-1联合治疗。使用机器学习方法从30多个EMT标志物基因中鉴定出可用于选择间充质肿瘤的较少数量的基因，例如ACTA2、VIM、MGP、ZEB2和ZWINT。例如，ACTA2和VIM被发现可跨越肿瘤类型转运。因此，TGF-β活化转录签名标记和签名标记内的基因可作为在基线时为抗TGF-β和抗PD-1抗体联合疗法进行癌症患者选择的有用生物标志物。
为了研究肿瘤微环境中的生物标志物，使用MultiOmyx(一种针对CRC和黑素瘤的多重IHC测定法)评估了患者肿瘤的免疫情况。在来自每个肿瘤样品的单个FFPE切片上用12种生物标志物(在一起描述了22种免疫细胞类型)进行复合(multiplexing)。该研究包括了一系列炎症以评估分析物评价每种肿瘤类型以及与可能的治疗效果相关联的情况有多好。开发了统计方法来评价在细胞群体水平上的差异，包括重复一致性、方差分析的火山图和相关性矩阵。MultiOmyx测定法显示出卓越的技术可重复性和精确性、有利的动态范围、在选择免疫细胞和感兴趣区域中的炎症状态差异，并且包括细胞群体之间的正相关性和负相关性二者。
实施例11：在使用或不用抗PD1的条件下用Ab1处理后MC38肿瘤中的TGF-β1、MIP2和KC/GRO的变化
为了证明TGF-β的中和，评估了Ab1(使用或不使用抗PD-1)影响肿瘤中细胞因子表达的能力。
当肿瘤体积为61-110mm3时，用单剂量的PBS或单独的抗PD-1(5mg/kg)或与抗PD-1(5mg/kg)联合的增加剂量的Ab1(10、25或50mg/kg，腹膜内)处理MC38携带肿瘤的小鼠。在指在治疗后1小时、6小时、10小时、24小时、72小时和168小时收获肿瘤并快速冷冻在具有2.8mm陶瓷球的2ml塑料管(Precyllys KT3961-1007.2)中，并保存在-80℃。为了制备裂解物，在室温下融化肿瘤。将1ml的补充有1x HaltTM蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo78440)的冷Meso Scale Diagnostics(MSD)Tris裂解缓冲液(R60TX-2)添加至组织，然后使用24 Dual匀浆器(Bertin Instruments)在2个循环中以6500rpm在4℃进行匀浆，每个循环20s。通过在4℃下在Eppendorf 5417C离心机中以20,000xg离心10分钟来澄清裂解物。如上所述，将上清液转移至干净的冷冻Eppendorf管中并通过再离心30分钟进一步使之澄清。之后，将上清液转移至塑料96-孔储存块中，并防止在冰上。据制造商的说明使用Bicinchoninic Acid(BCA)Protein Assay试剂盒(Thermo 23225)测量裂解物中的蛋白质浓度。通过使用具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的MSD Tris Lysis缓冲液(参见上文)将裂解物标准化至约5mg/ml的蛋白质浓度，并等分在塑料微型管中，在液氮中快速冷冻，并保存在-80℃。
使用电化学发光测定法使用人TGF-β1试剂盒(MSD，K151IUC-2)测量了肿瘤裂解物中的活性TGF-β1的浓度。融化如上所述制备的标准化的肿瘤裂解物，并根据制造商的说明进行测定。为了用数量表示肿瘤中存在的仅TGF-β1的活性形式而不是总TGF-β1(其包括与潜在性相关肽形成复合物的TGFβ-1)，不进行样品的酸处理。将样品一式两份加载在平板上。使用MESO SECTOR S 600读板器(MSD)测量了电化学发光信号，并且基于标准曲线使用MSD Discovery Workbench软件v4.0定量了样品中的TGF-β1浓度。
与单独使用PBS或抗PD-1治疗的动物相比，与抗PD-1(5mg/kg)一起用Ab1以所有给药水平(10、25或50mg/kg)处理的动物显示了肿瘤中具有降低水平的活性TGF-β1，这表明体内Ab1与其靶标的接合(图10A)。1小时内观察到活性TGF-β1水平降低并持续至少168小时。
MIP-2(CXCL2)和KC/GRO(CXCL1)是对于包括中性粒细胞在内的粒细胞的趋化现象的趋化因子。还在这些相同的样品中评估了MIP2和KC/GRO的水平。在Ab1与抗PD-1一起处理后，与单独使用PBS或抗PD-1处理的动物相比，在用Ab1与抗PD-1一起处理的动物中显示MIP2的肿瘤内水平增加了至少4倍；并且显示MIP-2水平的升高持续至少168小时(图10B)。类似地，与MIP-2的KC/GRO的水平相比，显示KC/GRO的水平增加，但是是在72和168小时的更晚的时间点(图10C)。因此，与MIP2和KC/GRO水平的增加相比，Ab1和抗mPD-1 mAb组合更早地引起活性TGF-β1水平的降低。这些结果表明Ab1可以降低肿瘤微环境中TGF-β的水平和抑制肿瘤微环境中的TGF-β。此外，观察到的MIP2和KC/GRO水平的增加表明，它们是被TGF-β的中和所影响的细胞因子，并因此可充当用Ab1治疗的患者中的潜在生物标志物。
实施例12：用Ab1处理恢复NK细胞聚集
已知TGF-β通过抑制不同免疫细胞类型的活性来影响免疫系统。已经报道了TGF-β抑制自然杀伤(NK)细胞活性和NK细胞介导的ADCC(Trotta等，Journal of immunology(2008)181:3784-3792)。最近报道了NK细胞形成密集的簇作为通过IL-2定位在这些密集包装的簇内来增强NK细胞的活性和活化的机制(Kim等，Scientific Reports(2017)7:40623)。显示在IL2存在下体外培养的纯化人NK细胞形成了这些密集包装的簇。
在本研究中，我们评估了在Ab1缺失或存在的情况下TGF-β对NK细胞“聚集”的作用。通过用NK细胞RosetteSep试剂的负选择(negative selection)根据制造商的方案(Stem Cell Technologies)从健康供体的血液中新鲜分离NK细胞。将NK细胞以1.2x105个细胞/孔在圆底测定板(Costar)中补充了Myelocult(Stem Cell Technologies)的IL-2(100IU/mL)中培养。如所示，在存在100μg/mL的无关IgG4或Ab1的情况下，加入TGF-β1至终浓度为0.1、1或10ng/mL。将细胞培养72小时，并通过在尼康显微镜上捕获图像来显现NK细胞聚集。
显示渐增剂量的TGF-β1的添加抑制了NK细胞聚集。当将Ab1而不是IgG4对照抗体加入到NK细胞培养物中时，显示了NK细胞簇的形成。该结果表明，TGF-β中和影响NK细胞活化，导致NK细胞的活性和增殖增加以支持免疫系统的抗肿瘤应答。
实施例13：Ab1处理对增殖性CD8+T细胞中TGF-β介导的对IFN-γ产生的抑制的逆转
除了先天性免疫系统之外，已经报道了TGF-β抑制CD8+ T细胞的活性(Flavell等，Nature Reviews Immunology(2010)10:554-567)。为了探索TGF-β和Ab1对CD8+ T细胞活性的作用，建立了MLR(混合淋巴细胞反应)测定系统，其中将纯化的人CD3+细胞与BLCL细胞混合。首先在TGF-β存在下评估了CD8+细胞增殖和IFN-γ产生。具体而言，在Ficoll梯度分离后，使用EasySep T细胞富集试剂盒(StemCell Technologies)从由正常健康供体分级的PBMC分离CD3+细胞。然后根据制造商的方案(ThermoFisher)用CellTrace Violet标记CD3+细胞。通过将标记的CD3+细胞(2X105个细胞)与经辐照的BLCL细胞(Astarte Bio)(2X104个细胞；2分钟)在补充有10％FBS的RPMI中混合来进行MLR测定。如所示，将TGF-β1、IgG4对照抗体和/或Ab1加入到培养物中，并将培养物在37℃、5％CO2下温育4天。接下来在存在PMA细胞刺激混合物(eBioscience)和蛋白质转运蛋白抑制剂混合物(eBioscience)的情况下刺激细胞4小时。通过在冰上用Zombie NIR存活力染料(BioLegend)染色来区分活细胞并用FAC缓冲液洗涤。将细胞用True-Nuclear缓冲液(BioLegend)固定、洗涤、沉淀(pelleted)并重悬于FAC缓冲液中。通过用BV650抗huCD4、PERCP/Cy5.5抗huCD8、FITC抗huCD3和PE抗huIFNγ(BioLegend)染色来制备细胞用于流式细胞术。在BD Canto上运行流式细胞术，并在FlowJo软件中分析结果并对活细胞、单个细胞(singlet)和CD3+细胞进行门控。通过对CD8+细胞的门控来定量IFNγ+CD8+ T细胞的百分比，所述CD8+细胞基于减少的CellTraceViolet染色已经增殖并且对于IFN-γ染色为阳性。运行FMO作为所有抗体染色的对照。
显示在MLR测定中包含TGF-β使得IFN-γ阳性的CD8+ T细胞的百分比降低了约4倍(图11A)。在不存在TGF-β的情况下，包含Ab1或对照Ab对这些IFNγ+增殖性CD8+细胞的发育没有影响(图11B)。然而，包含Ab1而不是对照抗体能够以剂量依赖性方式恢复IFNγ+CD8+细胞的增殖。这些结果表明，通过阻断TGF-β对表达IFN-γ的效应CD8+细胞的增殖的免疫抑制作用，TGF-β中和能够影响适应性免疫系统。已经提示这些IFNγ+CD8+ T细胞在抗肿瘤免疫中发挥重要作用(Ikeda等，Cytokine Growth Factor Rev(2002)13:95-109)。
实施例14：同基因小鼠模型对抗TGF-β疗法的响应
在此项研究中，我们调查了哪些同基因小鼠模型可用于预测对使用抗TGF-β抗体Ab1和抗PD-1的治疗的应答。为了对小鼠模型进行分层，我们评估了CD8+ T细胞向小鼠肿瘤中的浸润和TGF-β途径活化。基于来自从RNASeq获得的数据的CD8+ T细胞签名标记，来分析CD8+ T细胞浸润。使用全转录组RNAseq对具有从几种适应症(如图12A和12B中x轴下所示)产生的肿瘤细胞的17种不同小鼠同基因模型进行了转录描绘轮廓。同基因模型的这种“概要(compendium)”建立在常见的背景品系C57/BL6上，每种模型使用了5至7个生物学重复。在Illumina2000测序后，使用STAR比对器(aligner)和Cufflinks转录本丰度估计量(transcript abundance estimators)，通过对原始序列读数的标准处理产生了表示为每百万转录物(TPM)中表达的基因表达谱。最终将得到的多样本数据矩阵分位归一化(quantile normalized)。
图12A显示了在概要中CD8+ T细胞的相对丰度(log2-转化的)。使用独特的标志物基因CD8B估计了相对CD8+ T细胞丰度，其已经显示为CD8T细胞存在的高度特异性指示物(Becht等，Curr Opin Immunol(2016)39:7-13；和Becht等，Genome Biol(2016)17:218)。每个方块图总结了生物学重复中的数值的范围。与EMT6模型相比，MC38模型显示约2倍更多的CD8+ T细胞浸润(分别为左框和右框)。A20和EL4淋巴瘤模型分别显示出CD8+ T细胞浸润的总体最高和最低水平，而EL4中的CD8+ T细胞可忽略不计。
MC38、MC38.ova、CT26和L1210鼠类细胞系表现出最高水平的CD8基因签名标记。另外，EMT-6乳腺癌细胞系显示出具有接近基线的T细胞浸润，这与近来有关EMT6肿瘤具有免疫排除表型(immune-excluded phenotype)的报道一致(S.Mariathasan et al.2017,ESMOImmuno-Oncology Congress,Geneva,Geneva Switzerland)。
图12B显示整个概要中的TGF-β途径活化。通过TGF-β体外刺激MCF7细胞衍生出并通过与几种其他TGF-β签名标记比较验证的TGFβ途径活化的170个基因的转录签名标记，用于为概要中的每个概貌指定途径活化评分。使用“受调控的基因集富集分析”(rGSEA，Theilhaber等，2014)计算得分，并将其表示为针对基因背景的签名标记基因的富集log2。虽然MC38模型显示了平均活化，但EMT6模型显示出非常高的TGF-β途径活化(分别为左框和右框)。
实施例15：Ab1和抗PD1抗体组合对小鼠乳腺癌模型的影响
在本项研究中，我们研究了Ab1在有或没有抗PD-1的情况下的治疗效果。将指数生长的EMT-6乳腺细胞(CRL-2755，ATCC)在补充有10％FBS的RPMI-1640中在潮湿的5％CO2培养箱中培养，然后皮下植入(0.5X106个细胞/小鼠)到雌性BALB/c小鼠(上海灵昌生物技术有限公司，中国上海)的侧腹。一旦肿瘤达到68-116mm3的平均大小，将小鼠合并并随机分配至对照和治疗组(每组10只小鼠)。然后对每只动物用PBS、Ab1(10和25mg/kg)每周三次腹膜内处理携带肿瘤的小鼠，总共6次剂量。用数字卡尺每周测量肿瘤2次并计算肿瘤体积(mm3＝L x W x H)，并使用GraphPad Prism绘图。如果肿瘤生长至>3000mm3或肿瘤展现出溃疡>20％的肿瘤面积，则在研究结束时将小鼠用CO2安乐死。
作为单一药剂，剂量为10或25mg/kg Q3D的Ab1和剂量为5mg/kg的小鼠α-PD-1抗体在携带EMT-6肿瘤的小鼠中分别显示出具有1/10、2/10和2/10完全消退的部分活性。剂量为10或25mg/kg Q3D的Ab1与5mg/kg Q3D的小鼠α-PD-1抗体的组合具有治疗活性。在植入后第31天，当比较距离基线的肿瘤体积变化时，所有测试剂量的Ab1与5mg/kg Q3D的小鼠α-PD-1抗体的组合的效果大于每种单一药剂的效果，其中对于10和25mg/kg的Ab1分别为7/10和4/10完全消退。表10是对结果的总结。
表10 Ab1/抗mPD-1组合对EMT-6小鼠模型的作用
除非在此另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。以下描述示例性方法和材料，尽管与本文所述相似或等同的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物和其他参考文献的全部内容通过引用并入。如有冲突，以本包括定义在内的本说明书为准。虽然本文引用了许多文献，但是这种引用不构成承认这些文献中的任何文献构成本领域公知常识的一部分。此外，除非上下文另有要求，否则单数形式的词语应包括复数形式，复数形式的词语应包括单数形式。通常，与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、合成有机化学、药物和药物化学以及蛋白质和核酸化学和杂交有关的命名法和技术是那些熟知并且在本领域中通常使用者。根据制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术，如本领域通常完成的或如本文所述。在整个说明书和实施例中，词语“具有(have)”和“包含(comprise)”或诸如“具有(has)”，“具有(having)”，“包含(comprises)”或“包含(comprising)”这样的变化将被理解为暗示包含所述整数或组整数，但不排除任何其他整数或整数组。
序列表
<110> SANOFI
<120> 抗TGF-β抗体及其用途
<130> 022548.WO011
<140>
<141>
<150> EP 17305061.8
<151> 2017-01-20
<150> 62/448,800
<151> 2017-01-20
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
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<212> PRT
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽
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Gly Lys
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65 70 75 80
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85 90 95
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Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
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Tyr Arg Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp
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Lys Arg Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
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Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro
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Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
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Glu Ser Val Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ser
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Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser
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Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly
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Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln
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Pro Arg Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg
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Asp Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
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Val Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
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具体实施方式
图1A-E是显示Ab1、fresolimumab和1D11对用1ng/ml的人TGF-β1(A)、人TGF-β2(B)、人TGFβ3(C)、鼠TGF-β1(D)或鼠TGF-β2(E)处理的貂肺(Mv 1 Lu)细胞的增殖的作用的图。抗体浓度以μg/ml计。
图2是显示50μg/ml Ab1对人可诱导型调节性T细胞(iTreg)分化的作用的条形图。提供给T细胞的刺激是抗CD3和抗CD28抗体加IL-2。
图3是显示用2ng/ml人TGF-β1处理的人CD4+ T细胞培养物中Ab1对人可诱导型调节性T细胞(iTreg)分化的作用的条形图。提供给T细胞的刺激是抗CD3和抗CD28抗体加IL-2。
图4是显示在T细胞刺激和抗PD-1处理之后，Ab1(30μg/ml)和人TGF-β1(18ng/ml)对Jurkat T细胞上NFATc-驱动的萤光素酶表达的作用的条形图。
图5是显示使用C57BL/6 MC38结肠小鼠模型在所示治疗组中的中值肿瘤体积与中值绝对偏差(MAD)的图。载体：PBS。“抗PD-1”：x-抗-mPD-1Mab(参见下面的详述)。“Ab1的同种型对照”：抗HEL hIgG4。
图6是显示使用C57BL/6 MC38结肠小鼠模型的所示治疗的第27天时距离基线的肿瘤体积变化的散点图。对照：PBS。“抗PD-1 RPM114 mIgG1”：x-抗-mPD-1 Mab。
图7A-F是显示使用C57BL/6 MC38结肠小鼠模型的各个所示治疗组随时间的肿瘤体积的图。图表中的每条线代表一只动物。“mpk”：mg/kg。“Ab1同种型Ctrl”：抗HEL hIgG4。αPD1：x-抗-mPD-1 Mab。
图8是显示LoVo肿瘤裂解物中Ab1对活性TGF-β1浓度的作用的图。
图9A是显示在给予单一剂量5mg/kg的任一抗体的五组大鼠中Ab1和fresolimumab随时间的血清浓度的图。组(Gr.)1-3被给予三种不同批次(B1、B2和B3)的fresolimumab。组4和5被给予两种不同批次(B1和B2)的Ab1。
图9B是显示在给予单一剂量1mg/kg的任一抗体的猴子中Ab1和fresolimumab随时间的血清浓度的图。
图9C是显示在给予五个每剂量1mg/kg的每周剂量的Ab1或给予每剂量1mg/kg的每两周剂量的fresolimumab达指定的研究持续时间的猴子中Ab1和fresolimumab随时间的血清浓度的图。
图9D是显示在给予单一剂量10mg/kg的任一抗体的猴子中Ab1和fresolimumab随时间的血清浓度的图。
图9E是显示在给予五个每剂量10mg/kg的每周剂量的Ab1或给予每剂量10mg/kg的每两周剂量的fresolimumab达指定的研究持续时间的猴子中Ab1和fresolimumab随时间的血清浓度的图。
图10A是显示用Ab1(+/-抗-PD1)处理后MC38肿瘤中TGF-β1水平变化的图。
图10B是显示用Ab1(+/-抗-PD1)处理后MC38肿瘤中MIP-2水平变化的图。
图10C是显示用Ab1(+/-抗-PD1)处理后MC38肿瘤中KC/GRO水平变化的图。
图11A是量化CD8pos细胞的CellTrace Violet染色和IFN-γ染色的图。
图11B是显示Ab1恢复了TGFβ处理的CD8+ T细胞中的增殖和IFN-γ产生的图。
图12A是显示在整个针对结肠癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、乳腺癌、黑素瘤、间皮瘤和肾癌的同基因小鼠肿瘤模型的概要之间CD8+ T细胞的相对丰度(经log2-转化)的图。
图12B是显示在整个针对结肠癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、乳腺癌、黑素瘤、间皮瘤和肾癌的同基因小鼠肿瘤模型的概要之间TGFβ途径活化的图。
发明详述
本发明的特征在于改进的泛-TGF-β特异性单克隆抗体，其不易形成半抗体，同时还具有优异的药代动力学概貌，例如比现有已知抗体更高的体内暴露。本发明的抗体被统称为“Ab1和相关抗体”并且共享共同的结构特征，即它们具有SEQ ID NO:1中的重链CDR(HCDR)1-3和SEQ ID NO:2中的轻链CDR(LCDR)1-3，并且具有其中铰链区中的残基228(EU编号)已经从丝氨酸突变为脯氨酸的人IgG4恒定区。P228在下面显示的SEQ ID NO:1的序列中以方框和黑体字表示。
当未糖基化时，抗体Ab1具有144KD的估算分子量。其重和轻(链)氨基酸序列分别是SEQ ID NO:1和2。这两个序列如下所示。可变域为斜体。CDR以方框显示。重链恒定域中的糖基化位点以黑体字表示(N297)。
在一些实施方案中，本发明的抗体，如抗TGFβ抗体，在重链中不具有C-末端赖氨酸。C-末端赖氨酸可以在制备期间或通过重组技术(即，重链的编码序列不包括C-末端赖氨酸的密码子)被去除。因此，在本发明内考虑的还有包含不具有C-末端赖氨酸的SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列的抗体。
Ab1和相关抗体特异性结合人TGF-β1、-β2和-β3。“特异性”意指通过例如表面等离子体共振(参见例如下文实施例1)或生物层干涉(Bio-Layer Interferometry)测定的结合具有低于10-7M的KD，例如低于10-8M(例如，1-5nM)的KD。Ab1和相关抗体还可以具有当在貂肺上皮细胞测定法中测定时(参见例如下文实施例2)的强TGF-β中和效力，或在A549细胞IL-11诱导测定法中测定的约0.05-1μg/ml的EC50(参见例如PCT公开WO 2006/086469中的实施例6，其公开内容通过引用整体并入本文)。
Ab1和相关抗体的这些抗原结合和中和特性与先前的抗TGF-β抗体fresolimumab(WO 2006/086469中描述的种系化的IgG4PET1073G12抗体)相当。fresolimumab的重链和轻链序列，包括前导序列，分别显示于SEQ ID NO:3和4中。如SEQ ID NO:3中可见，fresolimumab不具有位置228(EU编号，其对应于SEQ ID NO:3中的实际位置247)的脯氨酸。Ab1和相关抗体与fresolimumab相比具有数种改进的特征。
在制造过程中，fresolimumab可在非还原性变性条件下形成高达6-18％的半抗体(即具有一重链和一轻链的二聚体，而不是具有与两条轻链复合的两条重链的四聚体)。相反，Ab1产生大幅度减少的半抗体(<1％)。因此，Ab1和相关抗体在制造过程中产生更纯的药物产品。
此外，与fresolimumab相比，Ab1和相关抗体可具有改进的药代动力学(PK)概貌。它们可能具有线性PK表现，其比fresolimumab半衰期长得多且消除速率更低，这导致体内暴露是fresolimumab的大约1.7倍。例如，在大鼠中，已显示Ab1具有与fresolimumab的4.3天相比7.1天的平均半衰期，和与fresolimumab的0.51ml/hr/kg相比0.30ml/hr/kg的消除速率(CL)(实施例7，下文)。在食蟹猴中，已显示Ab1具有与fresolimumab的4.5天相比13天的平均半衰期，和与fresolimumab的0.66ml/hr/kg相比0.40ml/hr/kg的消除速率(CL)。同上文。这些改进的PK特性表明，Ab1和相关抗体可以以比fresolimumab更低的剂量和/或更低的频率给予患者，以实现相同或更好的临床效果，同时引起更少的不良副作用和更少的抗药物抗体反应，因此在必要时允许更长的治疗持续时间。
此外，在非人灵长类动物中fresolimumab的毒理学研究期间，观察到了药物暴露与不良事件如贫血之间的相关性。然而，在用Ab1在相当或甚至更高的暴露下进行的类似研究中，没有观察到这种事件。
不受理论束缚，我们假定Ab1和相关抗体的重链中的残基228突变导致增加的稳定性以及改进的PK和毒理学概貌。
可以根据需要进一步修饰Ab1和相关抗体的恒定结构域，例如在Kabat残基L248处(例如通过引入突变L248E)，以减少分子的任何不需要的效应功能。
如本文所用，术语“抗体”(Ab)或“免疫球蛋白”(Ig)是指包含通过二硫键相互连接的两条重(H)链(约50-70kDa)和两条轻(L)链(约25kDa)的四聚体蛋白。每条重链由重链可变域(VH)和重链恒定区(CH)组成。每条轻链由轻链可变域(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL结构域可以进一步细分成高变区，称为“互补决定区”(CDR)，其间为称为“框架区”(FR)的更保守的区域。每个VH或VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。可以根据定义(Lefranc等，Dev CompImmunol 27(1):55-77(2003)；或Kabat的定义，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD(1987and1991))；Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；或Chothia等，Nature 342:878-883(1989)将氨基酸分配到每个区域。
术语“人抗体”是指其中可变域和恒定区序列源自人序列的抗体。该术语涵盖具有衍生自人基因的序列的抗体，但是那些序列已经被修饰例如以降低免疫原性、增加亲和力和增加稳定性。该术语涵盖在非人细胞中重组产生的抗体，其可以赋予对于人细胞而言非典型的糖基化。
术语“嵌合抗体”是指包含来自两种不同动物物种的序列的抗体。例如，嵌合抗体可以含有鼠抗体(即，由鼠抗体基因编码的抗体，例如使用杂交瘤技术从经免疫的小鼠获得的抗体)的VH和VL，该VH和VL与来自另一物种(例如，人、兔子或大鼠)的抗体的恒定区连接。
术语抗体的“抗原结合片段”是指保留特异性结合抗原的能力的抗体片段。在一些实施方案中，本发明的抗原结合片段是F(ab')2片段，其是包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段(Fab是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价抗体片段)。在一些实施方案中，本发明的抗原结合片段还可以包含CH2或CH3结构域。
本文所述的抗体和抗原结合片段可以是分离的。术语“分离的蛋白质”、“分离的多肽”或“分离的抗体”是指这样的蛋白质、多肽或抗体，其由于其起源或衍生来源而(1)不与在其天然状态下伴随它的天然关联组分关联，(2)基本上不含来自相同物种的其他蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。因此，化学合成或在与其天然来源的细胞不同的细胞系统中合成的多肽会是与其天然关联组分“分离的”。通过使用本领域公知的蛋白质纯化技术分离也可使蛋白质基本上不含天然关联组分。
I.Ab1和相关抗体的用途
TGF-β受体在免疫细胞上广泛表达，这导致TGF-β在先天性和适应性免疫系统中具有广泛的作用。TGF-β与许多疾病状况有关，例如出生缺陷、癌症、慢性炎症、自身免疫和纤维化疾病。治疗量的Ab1或相关抗体可用于治疗这些病症。“治疗有效”量指的是减轻所治疗病症的一种或多种症状的Ab1、相关抗体或本文提到的另一种治疗剂的量。这个量可能会根据治疗的病症或患者而有所不同，并且可以由医疗专业人员使用完善的原则来确定。
在一些实施方案中，Ab1或相关抗体可以以40、20或15mg/kg或更少(例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1mg/kg)施用。在一些其他实施方案中，剂量可以是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4或0.5mg/kg。给药频率可以是例如每天，每两天，每三天，每四天或每五天，每周，每两周或每三周，每月或每两个月。抗体可以静脉内(例如，0.5-8小时的静脉内输注)、皮下、局部或适合于病症和药物制剂的任何其他施用途径施用。
Ab1和相关抗体源自人抗体基因，因此在人体中具有低免疫原性。Ab1的毒理学研究在下面的实施例8中详述。在大鼠中观察到某些心脏和肺部副作用。因此，在用Ab1或相关抗体治疗患者时，可监测患者的不良事件。
在一些实施方案中，本发明的抗体的功效可以由患者中下列的一项或多项指示(例如，在受影响的组织中，例如患者的肿瘤组织中)：(1)TGF-β水平或活性的减少，(2)MIP2和/或KC/GRO水平的增加，(3)CD8+ T细胞如INF-γ阳性CD8+ T细胞的活化或浸润至肿瘤组织，以及(4)自然杀伤(NK)细胞聚集的增加。
A.非肿瘤疾病状况
可以通过Ab1和相关抗体治疗的病症可以包括但不限于骨缺损(例如成骨不全症)、肾小球性肾炎、神经或皮肤瘢痕形成、肺或肺纤维化(lung or pulmonary fibrosis)(例如、特发性肺纤维化)、辐射诱发的纤维化、肝纤维化、骨髓纤维化、硬皮病、免疫介导的疾病(包括类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、干燥综合征(Sjogren’ssyndrome)、伯格氏病(Berger’s disease)和移植排斥)和Dupuytren氏挛缩。
它们也可用于治疗、预防肾功能不全和降低发生肾功能不全的风险，包括但不限于局部节段性肾小球硬化症(FSGS)、糖尿病(I型和II型)性肾病、放射性肾病、梗阻性肾病、弥漫性系统性硬化症、遗传性肾病(例如，多囊性肾病、髓质海绵肾、马蹄肾)、肾小球肾炎、肾硬化、肾钙质沉着症、系统性或肾小球性高血压、肾小管间质性肾病、肾小管酸中毒、肾结核和肾梗塞。特别地，它们与肾素-血管紧张素-醛固酮体系的拮抗剂组合时是有用的，所述肾素-血管紧张素-醛固酮体系的拮抗剂包括但不限于：肾素抑制剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、Ang II受体拮抗剂(也称为“Ang II受体阻断剂”)和醛固酮拮抗剂。参见例如WO 2004/098637，其公开内容通过引用整体并入本文。
Ab1和相关抗体可用于治疗与ECM沉积有关的疾病和病症，例如系统性硬化、术后粘连、瘢痕瘤和增生性瘢痕形成、增生性玻璃体视网膜病变、青光眼引流手术、角膜损伤、白内障、佩罗尼氏病、成人呼吸窘迫综合征、肝硬化、心肌梗塞后的瘢痕形成、血管成形术后的再狭窄、蛛网膜下腔出血后的瘢痕形成、椎板切除术后的纤维化、肌腱和其他修复后的纤维化、胆汁性肝硬化(包括硬化性胆管炎)、心包炎、胸膜炎、气管切开术、穿透性CNS损伤、嗜酸性肌炎综合征、血管再狭窄、静脉闭塞性疾病、胰腺炎和银屑病性关节病。
Ab1和相关抗体进一步用于其中促进上皮再形成是有益的病症。这些病症包括但不限于皮肤疾病如静脉性溃疡、缺血性溃疡(压疮)、糖尿病性溃疡、移植部位、移植供体部位、擦伤和烧伤，支气管上皮的疾病如哮喘、ARDS，肠上皮的疾病如与细胞毒性治疗相关的粘膜炎、食管溃疡(反射疾病)、胃食管返流疾病、胃溃疡、小肠和大肠损伤(炎性肠病)。
Ab1和相关抗体的另外的用途是在其中期望内皮细胞增殖的病症中，例如稳定动脉粥样硬化斑块，促进血管吻合的愈合，或在其中期望抑制平滑肌细胞增殖的病症中，如动脉疾病、再狭窄和哮喘。
Ab1和相关抗体也可用于增强对巨噬细胞介导的感染的免疫应答，所述感染例如由利什曼原虫属种(Leishmania spp.)、克氏锥虫(Trypanosorna cruzi)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)以及原生动物刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、真菌荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、白色念珠菌(Candida albicans)、***滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)引起的感染。它们也可用于减少例如由肿瘤、AIDS或肉芽肿性疾病引起的免疫抑制。
Ab1和相关抗体也可用于预防和/或治疗眼科病症，例如小梁切除术后的青光眼和瘢痕形成。
B.肿瘤疾病状况
TGF-β调节几种生物过程，包括细胞增殖、上皮-间充质转化(EMT)、基质重塑、血管生成和免疫功能。这些过程中的每一个都促成肿瘤进展。TGF-β在跨越适应症的癌症患者中广泛的不利作用也由其在肿瘤微环境内以及全身性的升高而提示。参见，例如，Kadam等，Mol.Biomark.Diagn.(2013)4(3)。研究表明，在恶性状态下，TGF-β可诱导EMT，并且由此产生的间充质表型导致细胞迁移和侵袭增加。
Ab1和相关抗体可用于治疗过度增殖性疾病，例如癌症，包括但不限于皮肤癌(例如，黑素瘤，包括不可切除或转移性黑素瘤、皮肤鳞状细胞癌和角化棘皮瘤)、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食道癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌(例如，肝细胞癌)、原发性腹膜癌、膀胱癌、肾癌(renal cancer)或肾癌(kidney cancer)(例如，肾细胞癌)、尿路上皮癌、乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、***、子宫癌、***癌、睾丸癌、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌)、脑癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、间皮瘤、白血病和淋巴瘤。
在一些实施方案中，Ab1和相关抗体可用于治疗基于抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2治疗剂的先前治疗失败或预期会失败的患者中的癌症，即对抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2疗法为非响应者或预期为非响应者的患者。在一些实施方案中，Ab1和相关抗体可用于治疗已经从先前的抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2疗法复发的患者中的癌症。如本文所用，术语“预期”是指医学领域的技术人员在没有施用治疗的情况下，基于他/她的一般医学知识和患者的具体情况，可以预见到患者会是响应者还是非响应者，以及该疗法是否会失败或将不会有效。
在一些实施方案中，癌症是实体瘤的间叶性亚型，包括但不限于间叶性结肠直肠癌、间叶性卵巢癌、间叶性肺癌、间叶性头癌和间叶性颈癌。上皮间充质转化(EMT)通过下调上皮细胞基因和增强间充质基因表达来促进细胞迁移和侵入性质。EMT是肿瘤进展和侵入的标志。多达四分之一的结肠直肠癌和卵巢癌是间叶性的。因此，通过抑制TGF-β及其对EMT的诱导，Ab1或相关抗体可用于治疗间叶性实体瘤。实体瘤的间叶性亚型可通过许多遗传标志物和病理学检测来鉴定。标志物包括可通过qRT-PCR或免疫组织化学检测的ACTA2、VIM、MGP、ZEB2和ZWINT。此类标志物可用于选择用于本发明的抗TGF-β单一疗法或联合疗法的患者。
在一些实施方案中，Ab1和相关抗体可用于治疗晚期实体瘤患者。
Ab1和相关抗体也可用于治疗造血功能紊乱(hematopoietic disorder)或恶性肿瘤，如多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和白血病，以及各种肉瘤如卡波西肉瘤。
Ab1和相关抗体也可用于抑制环孢菌素介导的恶性肿瘤或癌症进展(例如，转移)。
当然可以理解的是，在癌症治疗的情况下，“治疗”包括致使癌症生长减缓、癌症进展或复发延迟、或癌症转移减少以及癌症部分缓解以延长患者的预期寿命的任何医学干预。
C.肿瘤学中的联合疗法
已经观察到，癌症中细胞毒性T细胞浸润的水平与有利的临床结果相关(Fridman等，Nat Rev Cancer(2012)12(4):298–306；和Galon等，Immunity(2013)39(1):11–26)。另外，辅助细胞毒性T细胞(CD4+ TH1)的T辅助细胞和它们产生的细胞因子(例如，INF-γ)通常也与积极的患者结果相关。相反，Treg细胞的存在已被证明与不良患者预后相关(Fridman，见上文)。
TGF-β抑制抗肿瘤免疫应答的几乎所有方面。该细胞因子促进iTreg分化并降低细胞毒性(CD8+)细胞增殖和浸润。如上所述，通过Ab1或相关抗体抑制TGF-β将减轻免疫抑制性肿瘤微环境，从而为癌症患者带来积极结果。
此外，发明人已经发现通过减轻免疫抑制性肿瘤微环境，Ab1和相关抗体可以允许检查点调节剂(例如抗PD-1抗体)更好地诱导免疫应答。因此，更多的患者可以从免疫治疗如抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2治疗中受益。
在使用或不用靶向免疫检查点分子的治疗剂的情况下，Ab1和相关抗体也可以与其他癌症疗法联合使用，其它癌症疗法例如化疗(例如，基于铂或紫杉烷类的疗法)、放射疗法和靶向癌症抗原或致癌驱动者的疗法。
可以通过涉及Ab1或相关抗体以及免疫检查点抑制剂例如抗PD-1抗体的组合来治疗的癌症包括上文小节中列出的癌症。
在一些实施方案中，癌症对于先前的抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2疗法是难治的，例如晚期或转移性黑素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、头颈部鳞状细胞癌和霍奇金淋巴瘤。难治性患者是疾病进展的患者，例如在开始治疗的12周内通过放射性方法没有任何响应证据而确认的。
在一些实施方案中，Ab1或相关抗体可以与另一种癌症疗法如抗-PD-1疗法联合使用以治疗间叶性癌症，例如结肠直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌、肾细胞癌、肝细胞癌和皮肤鳞状细胞癌。另见上文的讨论。
抗PD-1抗体的例子是nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab、MEDI0608(曾为AMP-514；参见例如WO2012/145493和美国专利9,205,148)、PDR001(参见例如WO2015/112900)、PF-06801591(参见例如WO 2016/092419)和BGB-A317(参见例如WO 2015/035606)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包括在WO 2015/112800中公开的那些(如在该PCT公开的表1中称为H1M7789N、H1M7799N、H1M7800N、H2M7780N、H2M7788N、H2M7790N、H2M7791N、H2M7794N、H2M7795N、H2M7796N、H2M7798N、H4H9019P、H4xH9034P2、H4xH9035P2、H4xH9037P2、H4xH9045P2、H4xH9048P2、H4H9057P2、H4H9068P2、H4xH9119P2、H4xH9120P2、H4xH9128P2、H4xH9135P2、H4xH9145P2、H4xH8992P、H4xH8999P和H4xH9008P的那些，和在该PCT公开的表3中称为H4H7798N、H4H7795N2、H4H9008P和H4H9048P2的那些)。WO2015/112800的公开内容通过引用整体并入本文。
例如，WO 2015/112800中公开的抗体和相关抗体，包括具有该PCT公开中公开的CDR、VH和VL序列或重链和轻链序列的抗体和抗原结合片段，以及与该PCT公开中公开的抗体结合相同PD-1表位的抗体和抗原结合片段，可以与本发明的Ab1或相关抗体联合用于治疗癌症。在相关实施方案中，有用的抗PD-1抗体可包含分别如下文中作为SEQ ID NO:5和6所示的重链和轻链氨基酸序列；SEQ ID NO:5和6中的VH和VL序列(斜体显示)，或SEQ ID NO:5和6中的一个或多个(例如全部六个)CDR(显示在框中)。
在一些实施方案中，本发明的抗体如抗PD-1抗体在重链中不具有C-末端赖氨酸。C-末端赖氨酸可以在制造期间或通过重组技术(即，重链的编码序列不包括C-末端赖氨酸的密码子)去除。如此在本发明内考虑的还有包含没有C-末端赖氨酸的SEQ ID NO:5的重链氨基酸序列的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗TGF-β抗体或片段也可以与针对免疫调节性抗原如PD-L1和CTLA-4的抗体联合使用。示例性的抗PD-L1抗体是atezolizumab、avelumab、durvalumab、LY3300054和BMS-936559。示例性的抗CTLA-4抗体是ipilimumab或tremelimumab。
D.治疗功效的生物标志物
Ab1和相关抗体的功效可以通过生物标志物或靶标占有率(target occupancy)来确定。例如，在肿瘤组织中，可通过使用Meso Scale Discovery(MSD)测定法评估活检组织中活性TGF-β的水平来测定靶标占有率。在血液中，可以通过评估外周血单核细胞如淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞上循环TGF-β降低的效果来测定靶标接合。例如，可以使用CD45+RO+CCR7+CD28+Ki67+作为流式细胞术中的标志物来评估循环CD8+ T细胞增殖的增加。循环NK细胞的活化可以使用CD3-CD56high/dim CD16+或CD137+作为流式细胞术中的标志物来评估。此外，Ki-67、PD-1和ICOS可以用作与T细胞活化相关的PD标志物。
通过使用例如NeoGenomics平台等多重免疫组织化学(IHC)测定法评估浸润性免疫细胞和免疫标志物的变化，由此可以测定通过Ab1或相关抗体治疗后的免疫调节。具体而言，NeoGenomic的MultiOmyx TIL Panel染色一组免疫标志物，允许定量测定各种免疫细胞的密度和定位。免疫标志物可表明iTreg的分化；CD8+ T细胞的浸润和增殖；并通过CD8+ T细胞产生IFNγ。已显示Ab1抑制CD4+ T细胞分化成iTreg(参见例如下文实施例3)，并增加CD8+ T细胞增殖及其产生IFNγ(如混合淋巴细胞反应测定法中所示；数据未显示)。因此，可以通过对iTreg的抑制、对CD8+ T细胞增殖和向肿瘤或其他患病组织的浸润的诱导、增加的IFNγ产生和/或CD8+ T细胞与Treg细胞的比率增加来指示Ab1或相关抗体的治疗功效。还可以通过基于甲基化-PCR的CD8+ T细胞、Treg细胞、NK细胞和其他免疫细胞的定量免疫细胞计数在外周血中测定Ab1或相关抗体治疗后的免疫调节。治疗功效在临床上可表现为疾病进展如肿瘤进展的延迟或逆转。
II.制备抗体的方法
Ab1和相关抗体，以及靶向其他共同靶标如PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体可以通过本领域充分确立的方法制备。可将编码抗体重链和轻链的DNA序列***到表达载体中，使得基因可操作地连接到必需的表达控制序列，例如转录和翻译控制序列。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、植物病毒如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、YAC、EBV衍生的附加体等。抗体轻链编码序列和抗体重链编码序列可以***分开的载体中，并且可以可操作地连接至相同或不同的表达控制序列(例如启动子)。在一个实施方案中，两种编码序列被***到同一表达载体中，并且可以可操作地连接到同一表达控制序列(例如，共同的启动子)，连接到分开的相同表达控制序列(例如启动子)或连接到不同的表达控制序列(例如启动子)。可以通过标准方法(例如连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或者如果不存在限制性位点则进行平端连接)将抗体编码序列***表达载体中。
除抗体链基因外，重组表达载体可携带控制宿主细胞中抗体链基因表达的调节序列。用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列的实例包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，例如来源于如下的启动子和/或增强子：逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤病毒和强哺乳动物启动子如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。
除了抗体链基因和调节序列之外，本发明的重组表达载体可以携带额外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。例如，选择标记基因赋予载体已经导入其中的宿主细胞对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。选择标记基因可以包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)、neo基因(用于G418选择)和谷氨酸合成酶基因。
将编码本发明抗体的表达载体导入宿主细胞中进行表达。宿主细胞在适合表达该抗体的条件下培养，然后将抗体收获并分离。宿主细胞包括哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。可用作表达宿主的哺乳动物细胞系在本领域中是公知的，并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系。这些中包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、293Freestyle细胞(Invitrogen)、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞和许多其他细胞系。可以基于它们的表达水平选择细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系，例如Sf9或Sf21细胞。
此外，使用许多已知技术可以增强抗体的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些条件下增强表达的常用方法。
用于宿主细胞的组织培养基可包含或不含动物衍生组分(ADC)，例如牛血清白蛋白。在一些实施方案中，无ADC的培养基对人的安全性是优选的。组织培养可以使用补料分批方法、连续灌注方法或任何其他适合宿主细胞和所需产率的方法进行。
III.药物组合物
本发明的抗体可以针对合适的储存稳定性配制。例如，可以使用药学上可接受的赋形剂将抗体冻干或保存或重构以供使用。对于联合疗法，可以将两种或更多种治疗剂例如抗体共同配制，例如混合并以单一组合物提供。
本文使用术语“赋形剂”来描述除本发明化合物之外的任何成分。赋形剂的选择在很大程度上取决于诸如特定施用模式、赋形剂对溶解性和稳定性的影响以及剂型的性质等因素。“药学上可接受的赋形剂”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的赋形剂的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合。在一些情况下，会在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药学上可接受的物质的另外的实例是润湿剂或少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加抗体的保质期或功效。
本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量制备、包装或散装销售(sold in bulk)。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用于受试者的活性成分的剂量或该剂量的方便的一部分，例如该剂量的一半或三分之一。
本发明的药物组合物通常适用于肠胃外施用。如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括任何特征如下的施用途径，其特征在于物理破坏受试者组织并通过组织中的所述破裂施用药物组合物，因此通常导致直接施用到血液中、肌肉中或进入内部器官。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物、通过手术切口施用组合物、通过组织穿透性非手术伤口施用组合物等来施用药物组合物。特别地，考虑的肠胃外给药包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、肿瘤内和滑膜内注射或输注；以及肾透析输注技术。也考虑区域灌注。优选的实施方案可包括静脉内和皮下途径。
适用于胃肠外施用的药物组合物的制剂通常包含与药学上可接受的载体(例如无菌水或无菌等渗盐水)组合的活性成分。这样的制剂可以适合于推注施用(bolusadministration)或连续施用的形式制备、包装或出售。注射制剂可以以单位剂量形式制备、包装或销售，例如在安瓿或含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于混悬液、溶液、油性或水性载体中的乳剂、糊剂等。这样的制剂可以进一步包含一种或多种另外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一个实施方案中，活性成分以干燥(即粉末或颗粒)形式提供，用于在肠胃外施用重构组合物之前用合适的载体(例如无菌无热原水)重构。胃肠外制剂还包括可含有赋形剂例如盐、碳水化合物和缓冲剂(例如，具有pH 3-9)的水溶液，但是对于一些应用，它们可以更合适地配制成无菌非水溶液或作为干燥形式与适宜的载体如无菌无热原水一起使用。示例性肠胃外施用形式包括在无菌水溶液中的溶液或混悬液，例如丙二醇水溶液或右旋糖水溶液。如果需要，可以适当缓冲这种剂型。可用的其它可以肠胃外施用的制剂包括含有微晶形式的活性成分或脂质制备物的那些制剂。用于肠胃外施用的制剂可以配制成立即和/或调节释放(modified release)。调节释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序释放。
IV.示例性实施方案
本发明的进一步具体的实施方案在下文中描述。
1.一种分离的单克隆抗体，其特异性结合人TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，所述抗体包含SEQ ID NO：1中的重链互补决定区(CDR)1-3和SEQ ID NO：2中的轻链CDR1-3，其中所述抗体包含在第228位(EU编号)具有脯氨酸的人IgG4恒定区。
2.如实施方案1的抗体，其中所述抗体包含对应于SEQ ID NO：1的残基1-120的重链可变结构域(VH)氨基酸序列和对应于SEQ ID NO：2的残基1-108的轻链可变结构域(VL)。
3.如实施方案2的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1中所示的重链氨基酸序列(具有或不具有C-末端赖氨酸)和SEQ ID NO：2中所示的轻链氨基酸序列。
4.如实施方案3的抗体的抗原结合片段，其中所述片段是F(ab’)2。
5.如实施方案1-4中任一项的抗体或片段，其中所述抗体或片段与fresolimumab相比具有增加的半衰期或增加的暴露。
6.如实施方案1-5中任一项的抗体或片段，其中所述抗体或片段具有以下性质中的一个或多个：
a)抑制CD4+ T细胞向可诱导型调节性T细胞(iTreg)的分化，
b)增加CD8+ T细胞增殖，
c)增加自然杀伤(NK)细胞的聚集，
d)增加MIP2的水平，和
e)增加KC/GRO的水平。
7.一种组合物，其包含实施方案1-6中任一项的抗体或片段，其中所述组合物包含少于1％的半抗体
8.如实施方案1-6中任一项的抗体或片段作为药物。
9.一种在有需要的患者中抑制TGF-β信号转导的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的如实施方案1-6中任一项的抗体或片段。
10.如实施方案9的方法，其中所述患者患有癌症。
11.如实施方案10的方法，其中所述癌症选自下组：黑素瘤、肺癌、皮肤鳞状细胞癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、肝细胞癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
12.如实施方案10或11的方法，其中所述癌症的特征在于ACTA2、VIM、MGP和ZWINT中的一种或多种的过表达。
13.如实施方案10-12中任一项的方法，其中所述癌症是间叶性肿瘤。
14.如实施方案10-13中任一项的方法，其中所述抗体或片段减轻免疫抑制性肿瘤微环境。
15.一种治疗患者中的癌症的方法，其包括向所述患者施用(1)如实施方案1-6中任一项的抗体或片段，和(2)免疫检查点蛋白的抑制剂。
16.如实施方案15的方法，其中所述免疫检查点蛋白是PD-1、PD-L1或PD-L2。
17.如实施方案16的方法，其中所述免疫检查点蛋白的抑制剂是抗PD-1抗体。
18.如实施方案17的方法，其中所述抗PD-1抗体包含SEQ ID NO:5中的重链CDR1-3和SEQ ID NO:6中的轻链CDR1-3。
19.如实施方案17的方法，其中所述抗PD-1抗体包含对应于SEQ ID NO:5的残基1-117的VH氨基酸序列和对应于SEQ ID NO:6的残基1-107的VL氨基酸序列。
20.如实施方案17的方法，其中所述抗PD-1抗体包含SEQ ID NO:5中所示的重链氨基酸序列(具有或不具有C-末端赖氨酸)和SEQ ID NO:6中所示的轻链氨基酸序列。
21.如实施方案15-20中任一项的方法，其中所述抗TGF-β抗体包含SEQ ID NO:1中所示的重链氨基酸序列(具有或不具有C-末端赖氨酸)和SEQ ID NO:2中所示的轻链氨基酸序列。
22.如实施方案15-21中任一项的方法，其中所述癌症对于抗PD-1抗体治疗是难治的。
23.如实施方案15-22中任一项的方法，其中所述癌症是晚期或转移性黑素瘤或皮肤鳞状细胞癌。
24.如实施方案15-23中任一项的方法，其中所述癌症是实体瘤的间叶性亚型。
25.如实施方案15-24中任一项的方法，其中所述癌症的特征在于ACTA2、VIM、MGP和ZWINT中的一种或多种的过表达。
26.如实施方案15-25中任一项的方法，其中所述癌症选自下组：黑素瘤、肺癌、皮肤鳞状细胞癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、肝细胞癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
27.如实施方案15-26中任一项的方法，其中所述抗体或片段减轻免疫抑制性肿瘤微环境。
28.如实施方案17-27中任一项的方法，其中所述抗TGF-β抗体和所述抗PD-1抗体在同一天向所述患者施用。
29.如实施方案17-28中任一项的用途，其中所述抗TGF-β抗体和所述抗PD-1抗体每两周向所述患者施用。
30.如实施方案17-29中任一项的用途，其中所述抗TGF-β抗体和所述抗PD-1抗体分别以0.05-20mg/kg体重的剂量施用。
31.一种在有需要的受试者中增加免疫应答的方法，包括向所述患者施用免疫检查点抑制剂和如实施方案1-6中任一项的抗体或片段。
32.如实施方案31的方法，其中所述检查点抑制剂是抗PD-1抗体。
33.如实施方案32的方法，其中所述抗PD-1抗体包含：
a)SEQ ID NO:5中的HCDR1-3和SEQ ID NO:6中的LCDR1-3；
b)分别对应于SEQ ID NO:5中的残基1-117和SEQ ID NO:6中的残基1-107的VH和VL；或
c)具有SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的重链(具有或不具有C-末端赖氨酸)和具有SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的轻链。
34.如实施方案31-33中任一项的方法，其中所述抗TGF-β抗体包含SEQ ID NO:1中所示的重链氨基酸序列(具有或不具有C-末端赖氨酸)和SEQ ID NO:2中所示的轻链氨基酸序列。
35.如实施方案31-34中任一项的方法，其中所述患者患有癌症。
36.如实施方案35的方法，其中所述患者对于先前的用所述免疫检查点抑制剂的治疗是难治的，和/或具有实体肿瘤的间叶性亚型。
37.如实施方案35或36的方法，其中所述癌症选自下组：黑素瘤、肺癌、皮肤鳞状细胞癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、肝细胞癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
38.如实施方案35-37中任一项的方法，其中所述癌症的特征在于ACTA2、VIM、MGP和ZWINT中的一种或多种的过表达。
39.如实施方案35-38中任一项的方法，其中所述抗体或片段减轻免疫抑制性肿瘤环境。
40.如实施方案1-6中任一项的抗体或片段供在上述方法的任一项中治疗患者中使用。
41.如实施方案1-6中任一项的抗体或片段用于制备用于在上述方法的任一项中治疗患者的药物的用途。
42.一种分离的核酸分子，其包含编码实施方案1-6中任一项的抗体或片段的重链、轻链或二者的核苷酸序列。
43.一种表达载体，其包含实施方案42的分离的核酸分子。
44.一种宿主细胞，其包含实施方案43的表达载体。
45.一种产生实施方案1-6中任一项的抗体或抗原结合片段的方法，所述方案包括：
提供宿主细胞，所述宿主细胞包含分别编码所述抗体或抗原结合片段的重链和轻链的第一和第二核苷酸序列，
使所述宿主细胞在允许所述抗体或抗原结合片段产生的条件下生长，和
回收所述抗体或抗原结合片段。
46.一种产生药物组合物的方法，其包括：
提供实施方案1-6中任一项的抗体或抗原结合片段，和
将所述抗体或抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂混合。
47.一种制品或试剂盒，其包含实施方案1-6中任一项的抗体或抗原结合片段以及另一治疗剂。
48.如实施方案47的制品或试剂盒，其中所述另一治疗剂是本文所述的免疫检查点抑制剂。
将在以下实施例中进一步描述本发明，其不会限制权利要求书中所述的本发明的范围。
实施例
为了更好地理解本发明，阐述了以下实施例。这些实施例仅用于说明，而不应被理解为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：Ab1的TGF-β-结合性质
使用葡聚糖包被的(dextran-coated)羧甲基化(CM5)系列S芯片，通过在BiacoreT200生物传感器仪器(GE Healthcare)上的表面等离子体共振测定了Ab1对所有人和鼠类TGF-β同种型的亲和力。将Ab1以一系列浓度(1.11、3.33、10和30nM)注射到固定的重组TGF-β上以实时测量结合相互作用。将TGF-β同源二聚体以低密度固定以降低亲合力效应。一式三份进行注射，并重复三次结合测定。使用Biacore T200 Biaevaluation v2.0软件处理来自动力学实验的数据。使用1:1结合模型将由此得到的传感图归零、比对、进行双重参照并修剪(cropped)以供曲线拟合分析，从而确定结合速率常数(ka)，解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)。
重组蛋白是内部产生的(人TGF-β1、2和3)或从R&D Systems获得的(鼠TGF-β1和2)。下表1显示恒河猴、小鼠或大鼠与人之间三种活性TGF-β同种型的氨基酸序列同源性(同源性作为保守氨基酸相对于总氨基酸的百分比报道)。
表1 TGF-β活性同种型与人的同源性
*大鼠和小鼠TGFβ1彼此100％同源，并且大鼠和小鼠TGFβ2彼此100％同源
由于人TGF-β3和鼠(murine)TGF-β3在氨基酸序列上是相同的，因此未计算这两种蛋白质的单独亲和力测量结果。同样，鼠和大鼠TGF-β1和2在氨基酸序列上是相同的，并且未计算单独的亲和力测量结果。
通过上述方法测定的Ab1的ka、kd和KD值列于下表2中。测定了Ab1对于人TGF-β1、2和3的KD值分别为1.48、3.00和1.65nM。测定了Ab1对鼠/大鼠TGF-β1和2的KD值分别为2.80和1.88nM。这些结合性质与fresolimumab的相似。
表2 Ab1对于TGF-β的平衡常数和亲和力
上述数据表明，Ab1是强力且具有选择性的泛-TGF-β抑制剂。使用表面等离子体共振的测量表明，Ab1对于所有人和鼠类TGF-β同种型具有1至5nM的亲和力。通过使用正常大鼠、食蟹猴和人组织的GLP免疫组织化学(IHC)组织交叉反应性研究确认了高水平的特异性。
实施例2:Ab1的TGF-β中和效力
在基于细胞的测定中测量了Ab1在中和TGF-β活性方面的体外效力。该测定法测量TGF-β抑制未转化的貂肺上皮细胞(Mv 1 Lu细胞)增殖的能力。参见，例如，WO 2006/086469和Mazzieri等编辑，“Methods in Molecular Biology”，第142卷，“Transforming GrowthFactor-βProtocols”。评价了Ab1、fresolimumab和1D11(一种鼠类抗TGF-β抗体，其重链和轻链序列在本文中公开为SEQ ID NO:9和10)中和人TGF-β1、2、3和鼠TGF-β1和2的能力。重组TGF-β蛋白在内部产生(人TGF-β1、2和3)或从R&D Systems获得(鼠TGF-β1和2)。
所有人和鼠TGF-β同种型在0.02pg/ml至10ng/ml范围内以剂量依赖性的方式抑制了貂肺细胞的增殖。为了量化Ab1、fresolimumab和1D11的效力，将1ng/ml指定的TGF-β和连续稀释的抗体与貂肺细胞一起温育。温育三天后，通过在与DNA结合时发荧光的CyQUANT染料定量细胞增殖(图1A-E)。数据显示Ab1、fresolimumab及其鼠类替代物1D11以相似的程度抑制了所有人和鼠类TGF-β同种型。
实施例3：Ab1对诱导型T调节性细胞分化的抑制
调节性T细胞(Treg)是免疫抑制性的，并且已经与癌症患者的负面结果相关。在下述研究中，我们研究了Ab1是否能够抑制TGF-β诱导的人CD4+ T细胞向可诱导型调节性T细胞(iTreg)的分化。原代人CD4+ T细胞从健康的正常供体分离。人TGF-β1购自R&D Systems。
为了研究Ab1对由培养的细胞内源性产生的TGF-β的拮抗剂活性，用50μg/ml的同种型对照(人IgG4，κ抗鸡卵溶菌酶(HEL)抗体，Crown Biosience)、Ab1或fresolimumab，在存在或不存在刺激(抗CD3、抗CD28和IL-2)的条件下，在不添加外源性TGF-β的情况下处理总体CD4+ T细胞达6天，然后进行流式细胞术分析。从亲本群体(淋巴细胞/活的/单个细胞/CD4+CD127-)一式三份计算CD25+FOXP3+群体的平均百分比和标准偏差。用抗CD3、抗CD28和IL-2刺激总体人CD4+ T细胞将培养物中FOXP3+CD25+(iTreg)的百分比从0％增加到15％。用50μg/ml Ab1或50μg/ml fresolimumab治疗以相似的程度降低了iTreg的百分比(分别为8％和7％；图2)。相反，用同种型人IgG4(hIgG4)对照的处理对iTreg分化的影响最小(20％iTreg)(图2)。从第二位健康的正常志愿者分离的CD4+ T细胞产生了相似的结果。
为了研究Ab1对外源性TGF-β的拮抗剂活性，将与2ng/ml人TGF-β1一起温育的总体CD4+ T细胞用同种型对照、Ab1或fresolimumab在不同抗体浓度下，在存在或不存在刺激(抗CD3、抗CD28和IL-2)的条件下处理6天，然后进行流式细胞术分析。除非另有说明，否则从亲本群体(淋巴细胞/活的/单细胞/CD4+CD127-)一式三份计算CD25+FOXP3+群体的平均百分比和标准偏差。向经刺激的总体人CD4+ T细胞中添加外源性TGF-β1(2ng/ml)将培养物中iTreg的百分比从15％增加至55％。用浓度渐增的Ab1的处理使iTreg的百分比以伴随的方式从55％降低至200μg/ml下的15％和6.25μg/ml下的43％。用fresolimumab处理使iTreg的百分比降低至与Ab1类似的程度(在200μg/ml时从55％至16％，而在6.25μg/ml时从55％至32％)。用不同浓度的同种型对照抗体处理对于iTreg的百分比没有影响，在200μg/ml和6.25μg/ml为60％。参见图3。从第二位健康的正常志愿者分离的CD4+ T细胞产生了相似的结果。
这项研究表明，Ab1抑制TGF-β诱导的iTreg分化，并因此可通过减轻免疫抑制性肿瘤微环境而带来临床益处。
实施例4：Ab1和抗PD-1抗体组合在体外的作用
在这项研究中，我们研究了抗PD-1治疗后TGF-β是否会阻止体外T细胞的最大刺激，并且如果是这样，那么Ab1是否可以抵消这种阻止。使用在来自NFATc(活化T细胞的核因子，细胞质1)调节序列的转录控制下的表达构建体的萤光素酶表达来测量T细胞活化的水平。
我们使用了购自Promega的细胞测定系统进行这项研究。该系统包含两种细胞类型：1)表达由NFAT应答元件驱动的人PD-1和萤光素酶报告基因的Jurkat T细胞，和2)表达人PD-L1和经设计以抗原非依赖性方式激活同源的T细胞受体的工程化细胞表面蛋白的CHO-K1细胞。在共培养时，Jurkat T细胞与CHO-K1细胞相互作用，引起T细胞受体刺激和NFATc易位至细胞核中，在那里其驱动萤光素酶表达。然而，PD-1/PD-L1的参与将酪氨酸蛋白磷酸酶非受体11(SHP2)募集至T细胞受体复合物，抑制NFATc核易位和随后的萤光素酶表达。PD-1信号传导的阻断缓解了SHP2依赖性抑制，并因此允许最大的萤光素酶表达。因此该系统提供了用于确定TGF-β对T细胞信号传导的作用以及Ab1对T细胞的抗PD-1治疗的影响的功能性方法。
由于与TGF-β依赖性作用相关的缓慢动力学，在T细胞受体刺激之前用TGF-β预处理Jurkat T细胞。人TGF-β1购自R&D Systems。用于Ab1的同种型对照抗体(抗HEL hIgG4)购自Crown Bioscience(目录号C0004-5)。小鼠抗hPD-1 IgG及其同种型对照抗体购自BioLegend(目录号329912)。针对每种样品分析了十四个重复。
结果显示将抗hPD-1抗体添加至与CHO-K1细胞共培养24小时的Jurkat T细胞诱导了萤光素酶活性(865794相对发光单位[RLU])的程度大于添加同种型对照(234963 RLU，倍数变化＝3.685，p值<0.0001)或者仅仅不存在抗体(206043RLU，倍数变化＝4.202，p值<0.0001)。用18ng/ml TGF-β1预处理Jurkat T细胞12天在存在抗hPD-1抗体的CHO-K1细胞共培养物中，与未用TGF-β1处理的Jurkat T细胞相比(865794 RLU，倍数变化＝-1.355，p值<0.0001)，诱导了更少的萤光素酶活性(638866 RLU)(图4)。
为了评估Ab1的拮抗效力，将Jurkat T细胞在存在Ab1、同种型对照Ab或无Ab的情况下用18ng/ml TGF-β1预处理12天，然后与CHO-K1细胞在抗PD-1存在下共培养24小时。与同种型对照Ab(639440RLU，倍数变化＝1.445，p值<0.0001)和无Ab对照(638866 RLU，倍数变化＝1.447，p值<0.0001)相比，Ab1(924186 RLU)的存在缓和了萤光素酶活性的TGF-β-依赖性抑制。将使用Ab1(975654 RLU)或同种型对照(955717 RLU)的对照组加入未用TGF-β1预处理的Jurkat T细胞中，并在抗-PD-1 Ab存在下与CHO-K1细胞共培养物共培养，与无Ab对照相比具有统计学上升高的萤光素酶活性，但是具有最小的倍数变化(865794 RLU，倍数变化＝1.127和1.104，p值分别为0.0023和0.001284)(图4)。RLU值也列在下面的表3中。
表3 T细胞活化测定中的相对发光单位
为了排除对Jurkat T细胞的TGF-β1预处理可能导致降低的增殖或存活力，并因此在与CHO-K1细胞共培养24小时期间导致了降低的萤光素酶活性的可能性，我们将Jurkat T细胞与18ng/ml TGF-β1或PBS在Ab1、抗HEL hIgG4或无抗体(载体)的存在下温育7天。每2至3天用等体积的各个组接种新的培养瓶，此时TGF-β1和抗体二者都被刷新(总共发生两次再接种事件)。最终培养物的评估表明，所有处理组的存活力未变(范围从94％至96％)。此外，每个处理组的最终培养物中的Jurkat T细胞总数非常相似(范围从2500至2900万)。
上述研究表明，抗PD-1治疗后T细胞受体下游的信号传导的增加被TGF-β抑制，导致次最佳(sub-optimal)T细胞刺激。我们的数据表明，抑制TGF-β减轻了免疫抑制肿瘤微环境，并允许检查点调节剂如抗PD-1剂更好地诱导免疫应答，从而增加受益于免疫肿瘤治疗的患者比例。
实施例5：Ab1和抗PD1抗体组合在体内的作用
接下来我们研究了在C57BL/6小鼠癌症模型中抗TGF-β和抗PD-1联合治疗的作用。
耐受性/初步安全性
材料和方法
在C57BL/6雌性小鼠中评估了Ab1和抗小鼠PD-1(mPD-1)单克隆抗体(mAb)作为单一药剂和组合的耐受性。Ab1(10、20和50mg/kg)或同种型对照Ab(购自Crown Bioscience的抗HEL hIgG4；以10和20mg/kg使用)每三天IV施用(Q3D)，作为单一药剂或与每周两次5mg/kg IV的抗PD1 Mab组合。本研究中使用的抗PD1 Ab被命名为“antimPD1_hyb_RMP114_mIgG1LCfullrat”(或x抗mPD-1 Mab)。它是通过用小鼠IgG1Fc区替代大鼠IgG2a克隆RMP1-14(BioXcell，目录号BE0146)的大鼠Fc区产生的嵌合大鼠抗mPD-1抗体。这种嵌合抗体的重链和轻链氨基酸序列示于SEQ ID NO:7和8中。通过测量动物体重和临床观察结果来评估耐受性。在三周治疗结束时，在最后一次治疗后4小时，进行终末采样，并将组织(心脏、肾脏、肝脏、肺脏和脾脏)固定在甲醛中并送去进行组织病理学分析。
如果剂量在单个小鼠中在连续三天期间产生了15％体重减轻，在一天期间产生了20％体重减轻，或10％或更多的药物相关死亡，则该剂量被认为是过度毒性的，除非在对照运载体处理组观察到导致体重下降的肿瘤诱导的恶病质。动物体重包括了肿瘤重量。
毒性/安全性结果
在C57BL/6小鼠中的耐受性研究显示，所有测试的剂量水平的单一药剂以及Ab1与x-抗mPD-1 Mab的组合都是良好耐受的。在所有测试剂量的任何治疗组中都没有观察到体重的重大变化。研究期间未观察到严重或主要的临床观察结果。组织病理学分析鉴定了所有处理组(包括同种型对照抗体处理的组)的脾脏(白髓)中淋巴细胞的数量增加，无论组合并且没有任何剂量关系。没有观察到其他显著的显微发现。在研究的最后一天最后一次施用后，来自联用组(同种型对照Ab(10mg/kg)和抗PD-1 Mab(5mg/kg))的两只小鼠被发现死亡。组织病理学分析没有发现任何与药物有关的死亡原因。
功效研究
评估了在携带皮下MC38同基因结肠肿瘤的C57BL/6小鼠中组合抗TGF-β和抗PD-1治疗的效果。给予小鼠25mg/kg的Ab1、5mg/kg的x-抗mPD-1Mab或两者，Q3D，持续三周。这项研究证明，Ab1和抗mPD-1 Mab联用比仅单一药剂具有显著更高的抗肿瘤活性。下面详细描述这项研究的材料和方法以及数据。
材料和方法
动物
雌性C57BL/6小鼠获自Charles River Labs(Wilmington，MA，USA)。在研究登记前让动物适应环境至少3天。在研究开始时，小鼠为11周龄，体重在17.0至20.9g之间。它们可以自由获得食物(Harlan 2916啮齿动物饮食，美国马萨诸塞州)和无菌水，并且在12小时光照/黑暗周期中饲养。
肿瘤细胞
MC38是结肠腺癌细胞系。细胞从国立癌症研究所(National Cancer Institute)(Bethesda，MD，USA)获得并且在37℃下5％CO2中在完全培养基(CM)中培养，所述培养基包括具有L-谷氨酰胺的Roswell Park Memorial Institute培养基(RPMI)-1640(Gibco，目录号11875)，补充有10％热灭活胎牛血清(HI FBS)(Gibco，目录号10438026)。将细胞收获并重悬于Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(Gibco，目录号14190)中，并将每小鼠1x 106个细胞/200μl皮下(SC)植入雌性C57BL/6小鼠的右侧。
化合物
Ab1在水溶液中施用至动物。其通过PES进行0.22μm过滤，并以无菌等分试样储存在2-10℃。将抗体以10ml/kg腹膜内(IP)，25mg/kg给予动物。
使用抗HEL hIgG4(Crown Bioscience)作为Ab1的同种型对照。这种抗体以10ml/kg通过IP，25mg/kg给予对照动物。
x-抗mPD-1 Mab(同上)在DPBS(Gibco，目录号14190-094)中提供，并以10ml/kg，5mg/kg通过IP给予动物。
研究设计
在第0天，为60只动物植入MC38肿瘤细胞。植入后第8天，将平均肿瘤大小为50-75mm3的小鼠合并并随机分配至对照组和治疗组(每组10只小鼠)。在第9天开始用上述剂量的运载体(PBS，pH7.2)、抗HEL hIgG4、Ab1和抗mPD-1 Mab处理，并在第12、15、18、21和27天重复。将用运载体和抗HEL hIgG4处理的动物用作对照。每天检查小鼠并记录不良临床反应。一周将各个小鼠称重三至四次直至实验结束。
当观察到病态或体重减轻≥20％时，使小鼠安乐死。用卡尺每周两次测量肿瘤直至最终处死。当肿瘤大小达到约2000mm3或存在动物健康问题(肿瘤面积的20％溃疡)时，动物将被安乐死并记录死亡日期。从二维肿瘤测量结果估计实体肿瘤体积并根据以下等式进行计算：
肿瘤体积(mm3)＝[长度(mm)x宽度2(mm2)]/2
然后给定日的组的百分比中值消退(regression)通过取得针对该组中每只动物在该日计算的个体百分比消退的中值来获得。计算的日期是在计算ΔT/ΔC(即，治疗组和对照组之间的肿瘤体积从基线变化的中值的比例)的那天确定的，除非中值百分比消退不代表该组的活性。在那种情况下，当中值百分比消退最大时的第一天确定为这一天。如果肿瘤体积降至在治疗开始时肿瘤体积的50％，则将消退定义为部分的(PR)。当肿瘤体积低于14mm3或无法记录时，认为已经实现了完全消退(CR)。
功效
主要功效终点是由ΔT/ΔC、中值百分比消退、部分消退和完全消退指示的与基线相比的肿瘤体积变化。通过从在指定观察日肿瘤体积中减去第一次治疗当天(分期日(staging day))的肿瘤体积，每天对每只动物计算每个治疗组(T)和对照组(C)的肿瘤体积变化。计算治疗组的中值ΔT，并计算对照组的中值ΔC。计算比率ΔT/ΔC并以百分比表示：
ΔT/ΔC＝(中值ΔT/中值ΔC)x 100
ΔT/ΔC比率≤40％被认为有治疗活性。ΔT/ΔC比率为0％被认为是肿瘤停滞。ΔT/ΔC比率<0％被认为是肿瘤消退。
将肿瘤消退百分比定义为与在研究开始时(t0)的肿瘤体积相比，在指定观察日治疗组中肿瘤体积减少的百分比。在特定时间点(t)并且对于每只动物，使用以下公式计算百分比消退：
％消退(在t时)＝[(体积t0–体积t)/体积t0]x 100
然后通过取得为组中每只动物计算的个体％消退值的中值来计算在给定日组的中值百分比消退。计算的日期由计算ΔT/ΔC的日期决定，除非中值百分比消退不代表该组的活性。在那种情况下，通过中值百分比消退最大时的第一天确定这一天。
统计学分析
对与基线相比的肿瘤体积变化进行具有因子治疗和天数(重复)的双向ANOVA类型。在显著治疗*天数相互作用或治疗效果的情况下，随后进行带有Bonferroni-Holm校正多重性的对比分析以在第8天至第27天的每一天比较所有的治疗组与对照组。针对每只动物并且在每天计算肿瘤体积相对于基线的变化，其通过从指定的观察日的肿瘤体积中减去第一次治疗当天(第8天)的肿瘤体积计算。
因为在组之间观察到差异的异质性，所以对于ANOVA类型模型(SAS InstituteInc.(2008)SAS/STAT 9.2用户指南，Cary NC)选择了具有组＝选项的复合对称(CS)协方差结构。在图5和图6中，对于每个测量日呈现每组的中值和中值绝对偏差(MAD)。在下面的表4-6中，为每个测量日报告每组的中值和归一化MAD(nMAD＝1.4826*MAD)。所有统计分析均使用SAS版本v9.2软件进行。小于5％的概率(p<0.05)被认为是显著的。
功效结果
用Ab1、抗PD-1 Mab或两者的组合处理带有肿瘤的C57BL/6小鼠也具有良好耐受性且无毒性，如动物的一般健康和活动以及没有体重的显著变化所表明的。作为单一药剂，25mg/kg Q3D的Ab1和5mg/kg Q3D的抗PD-1 Mab分别导致最低点仅3.4％(第9天)和2.1％(第9天)的体重损失值。Ab1(25mg/kg Q3D)和抗PD-1 Mab(5mg/kg Q3D)的组合也是良好耐受的，显示最低点1.3％(第9天)的体重损失值(表4)。
作为单一药剂，与用Ab1同种型对照(抗HEL hIgG4)处理的动物相比，Ab1(25mg/kgQ3D)和抗PD-1 Mab(5mg/kg Q3D)显示对肿瘤生长没有扰动。治疗第27天的ΔT/ΔC比率分别为93％和109％(表4)。抗PD-1 Mab和抗HEL hIgG4的组合显示最小的抗肿瘤活性，在治疗的第27天ΔT/ΔC为31％(与对照组没有统计学差异)，并且在10只小鼠中只有2只观察到完全消退。然而，抗PD-1 Mab和Ab1的组合在第15天至第27天表现出优异的抗肿瘤活性，在治疗的第27天具有-1ΔT/ΔC(统计学上不同于对照组)，并且在10只小鼠中的6只中观察到完全消退(表4)。
表4 Abl和X抗mPD-1 Mab在C57BL/6 MC38癌症模型中的活性
*ΔW表示最低点处每组的平均体重变化％。
**在对距离基线的肿瘤体积变化进行重复测量的双向ANOVA-Type之后，使用Bonferroni-Holm调整多重性，使用比较各治疗组与对照的对比分析获得p值。小于5％的概率(p<0.05)被认为是显著的。
表5和6以及图5-7提供了另外的数据，其显示了单独或组合的抗体对小鼠模型中肿瘤体积的活性。
表5处理组与对照组的比较
*在对距离基线的肿瘤体积变化的双向Anova-Type之后，使用Bonferroni-Holm调整多重性，使用每天相对于对照的对比分析获得p值。
表6 Ab1和X-抗mPD-1 Mab作为单一药剂与组合的对比
*在对距离基线的肿瘤体积变化进行双向Anova-Type之后，使用Bonferroni-Holm调整多重性，使用比较每天Ab1、抗HEL hIgG4和x-抗mPD-1的组合相对于组合中涉及的剂量的每种单一药剂的对比分析获得p值。
表格和附图中的数据显示，25mg/kg Q3D的Ab1和5mg/kg Q3D的x-抗mPD-1 Mab的组合比那些剂量下的任一抗体具有更高的抗肿瘤效果。当将组合与作为单一药剂的Ab1比较时，在第19、23和27天的p值分别为0.0007、<0.0001和<0.0001，这种差异是统计学显著的。当将组合与作为单一药剂的x-抗mPD-1 Mab比较时，在第19、23和27天的p值分别为0.0276、0.0004和0.0024，这种差异也是统计学显著的(表6)。对于25mg/kg Q3D的抗HELhIgG4和5mg/kg Q3D的x-抗mPD-1 Mab的联用组，在测量任何一天在从基线的肿瘤体积变化上的治疗效果与单独使用任一种药剂的效果没有显著差异。
总之，从第15天至第27天，25mg/kg Q3D的Ab1和5mg/kg Q3D的抗mPD-1 Mab的组合具有比单独使用的任一种药剂显著更大的抗肿瘤效果。
在另一项研究中，我们评估了剂量为1、10或25mg/kg的Ab1与剂量为5mg/kg的小鼠PD-1抗体对C57BL/6J小鼠中皮下MC38小鼠结肠癌模型的抗肿瘤活性。将指数生长的MC38结肠腺癌细胞(NCI，Frederick，MD)在补充有10％FBS的RPMI-1640中在湿润的5％CO2培养箱中培养，然后皮下植入(1X106个细胞)到雌性C57/Bl6J小鼠侧腹(Jackson Laboratory,BarHarbor,ME)。一旦肿瘤达到50-75mm3的平均大小，则将小鼠合并并随机分配至对照组和治疗组(每组10只小鼠)。然后用PBS、IgG4同种型对照抗体(25mg/kg)或Ab1(1、10和25mg/kg)腹膜内处理带有肿瘤的小鼠，每周三次，直到每只动物接受总共6至7个剂量。用数字卡尺每周测量肿瘤2次并计算肿瘤体积(mm3＝L x W x H)并用GraphPad Prism绘图。如果肿瘤生长至>2000mm3，或肿瘤展现出溃疡>20％的肿瘤面积，则在研究结束时将小鼠用CO2安乐死。
作为单一药剂，剂量为25mg/kg Q3D的Ab1和剂量为5mg/kg的小鼠α-PD-1抗体分别在携带MC38肿瘤的小鼠中表现出2/8和4/8完全消退的部分活性。1、10或25mg/kg Q3D的Ab1与5mg/kg Q3D的小鼠α-PD-1抗体的组合具有治疗活性。在植入后第24天，当比较相对于基线的肿瘤体积变化时，所有测试剂量的Ab1和5mg/kg Q3D的小鼠α-PD-1抗体的组合的效果大于每种单一药剂的效果，其中对于1、10和25mg/kg的Ab1分别为5/8、6/8和7/8完全消退。表6A提供了对结果的总结。
表6A Ab1+抗mPD-1 mAb组合的抗肿瘤效果
总之，这些临床前数据表明，PD-1抑制与TGF-β抑制的组合能够比仅是单独的检查点抑制剂更大程度地抑制肿瘤生长。
实施例6：肿瘤内TGF-β1水平
在LoVo结肠直肠癌皮下异种移植物移植的BALB/c小鼠模型中研究了肿瘤内TGF-β1水平。在肿瘤体积小于100mm3时开始，为小鼠每3天静脉内注射10、25或50mg/kg的Ab1或同种型对照Mab，共8次IV施用。
将在-80℃下储存在具有2.8mm陶瓷球(MoBio 13114-50)的2ml塑料管中的肿瘤样品在室温下解冻。向组织添加1毫升(ml)冷的Meso Scale Diagnostic(MSD)Tris Lysis缓冲液(R60TX-2)(补充有1x HaltTM蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo 78440))，然后使用24 Dual匀浆器(Bertin Instruments)在2个循环中以6500rpm在4℃进行匀浆，每个循环20s。通过在4℃下在Eppendorf 5417C离心机中以20,000xg离心10分钟来澄清裂解物。如上所述，将上清液转移至干净的冷冻Eppendorf管中并通过再离心20分钟进一步使之澄清。之后，将上清液转移至塑料96-孔储存块中，在液氮中快速冷冻，并在-80℃下储存。
第二天将样品在室温下解冻并置于冰上。根据制造商的说明使用BicinchoninicAcid(BCA)Protein Assay试剂盒(Thermo 23225)测量裂解物中的蛋白质浓度。通过使用具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的MSD Tris Lysis缓冲液(参见上文)将裂解物标准化至约8mg/ml的蛋白质浓度，并等分在塑料微型管中。
使用电化学发光测定法使用人TGF-β1试剂盒(MSD，K151IUC-2)根据制造商的说明测量了标准化肿瘤裂解物中的TGF-β1浓度。使用在MSD Lysis Buffer中连续稀释的重组小鼠TGF-β1(R&D Systems,目录号7666-MB-005)作为校准物。将样品一式两份加载在平板上。使用MESO SECTOR S 600读板器(MSD)测量了电化学发光信号，并且基于标准曲线使用MSDDiscovery Workbench软件v4.0定量了样品中的TGF-β1浓度。
通过软件计算了样品一式两份重复的平均浓度。由软件确定为“低于拟合曲线范围(Below Fit Curve Range)”或“低于检测范围(Below Detection Range)”的浓度值用零值代替。为了计算每mg总蛋白质的TGF-β1浓度，用测定中测得的浓度(pg/ml)除以样品中的蛋白质浓度(mg/ml)。
结果显示，注射了同种型对照的小鼠的肿瘤内TGF-β1水平具有21.4pg/mg总蛋白的中值，在注射了Ab1的小鼠中的相应水平是检测不到的(图8)。
为了证明上述发现在人类中的相关性，我们使用上述方法如上所述测试了10份人结肠直肠肿瘤样品和10份人黑素瘤肿瘤样品的肿瘤内TGF-β1水平。对于人CRC样品，TGF-β1水平在约7至25pg/mg范围内。对于人黑素瘤样品，TGF-β1水平在约1pg/mg至高达43pg/mg的范围。这些数据进一步支持了抗TGF-β1治疗剂如Ab1在单独或与其他免疫检查点抑制剂如抗PD-1抗体联合的情况下在***方面的用途。
实施例7：Ab1的药代动力学研究
本实施例描述了表征Ab1的药代动力学(PK)概貌并将其与fresolimumab药代动力学(PK)概貌相比较的研究。在一项研究中，为5组空肠Sprague-Dawley大鼠静脉内给予5mg/kg单剂量的Ab1或fresolimumab。每组有五只雌性和五只雄性。在给药后0.25、6、24、48、72、144、192和240小时收集来自大鼠的血液。通过ELISA确定了Ab1和fresolimumab血清浓度。如果(测试物质与参考物的)AUC比率的90％置信区间在80％至125％的范围内，则确定了可比性。
图9A中显示了来自五组大鼠的抗体血清浓度随时间的变化。来自组2、4和5的PK参数(参见图9A的图例)显示在下表7中。此项研究显示，Ab1具有线性PK表现，具有比fresolimumab长得多的半衰期(平均T1/2为7.1天，相对于4.3天)和较低的消除速率(CL为0.30ml/hr/kg，相对于0.51ml/hr/kg)。数据显示Ab1在大鼠中具有fresolimumab的1.7倍高的暴露。
表7 Fresolimumab和Ab1之间的PK比较
*组平均值±SD与“fresolimumab(B2)”组有统计学差异(图9A中的组2).
在食蟹猴组中进行了关于Ab1的另外一项PK研究(研究2)。每组有五只雌性和五只雄性，并且给予静脉内输注1mg/kg(图9B)或10mg/kg(图9D)的单剂量的Ab1，或者每剂量1mg/kg(图9C)或10mg/kg(图9E)的5次每周剂量的Ab1。图9B-E中显示了猴中Ab1的血清浓度随时间的变化。在以前的研究中以单次或重复Q2W(双周)剂量给予猴子的fresoliumamb随着时间的血清浓度也显示在图中用于比较。这些数据显示，在单次和重复给药后，Ab1在猴子中也具有线性PK表现，并且显示出比每剂量1mg/kg和10mg/kg两种剂量的fresolimumab更高的暴露。在10mg/kg的单次给药下，Ab1具有13天的半衰期，而fresolimumab具有4.5天的半衰期；Ab1具有约0.40ml/hr/kg的CL，而fresolimumab具有0.66ml/hr/kg的CL。与大鼠研究一样，猴子研究也显示Ab1比fresolimumab具有约1.7倍的更高的暴露。
上述研究表明，Ab1与fresolimumab相比在体内具有统计学显著更长的半衰期，更长的清除时间和更高的生物暴露。
此外，在携带Ab12肿瘤的Balb/C小鼠中的研究显示，Ab1具有类似的PK概貌，无论其是静脉内还是腹膜内施用。
在双室模型(two-compartment model)上使用异速定标(allometric scaling)，我们根据猴子数据预测了70kg男性中的以下PK参数(表8)：
表8 PK参数的异速建模
PK参数
猴子中的Ab1
人中的Ab1
T<sub>1/2</sub>(天数)
13.1
20.9
CL(ml/hr/kg)
0.392
5.7
V1(中央室)(L)
0.104
2.43
Q(ml/hr)
3.18
46
V2(周边室)(L)
0.0693
1.62
在人类中Ab1的预测PK参数也比fresolimumab的预测PK参数更有利。例如，在人体中fresolimumab的CL为12.3ml/hr/kg，比Ab1的清除速率快。
实施例8：Ab1的毒理学研究
Ab1的毒理学研究在大鼠和食蟹猴中进行。在重复剂量的GLP(良好的实验室操作)中每周评估安全药理学终点达5周。在猴子中高达10mg/kg/剂量(浓度为2mg/ml)的剂量和在大鼠中高达30mg/kg/剂量(浓度为6mg/ml)的剂量下，在注射部位没有观察到Ab1相关的组织病理学发现。在这项研究中，在神经系统检查、体温、呼吸率、血压和ECG参数方面测试的任何剂量水平都没有注意到Ab1相关的影响。
发现大鼠的NOAEL(没有观察到的不良反应的水平)为每周重复给药5周3mg/kg/剂量，且发现大鼠的STD10(导致10％的动物死亡或不可逆的严重毒性的严重毒性剂量)为3至10mg/kg/剂量。毒性包括以多个增厚的结节为特征的心脏瓣膜增殖；和异常肺部状况，如混合细胞肺泡渗出液、混合细胞血管周围浸润、肌肉动脉肥大、出血和/或肺重增加。
发现每周重复给药5周的猴子的NOAEL和HNSTD(即，最高非严重毒性剂量，在其之上发生致死性、危及生命的毒性或不可逆的毒性)为10mg/kg/剂量(参考fresolimumab，当其每两周施用达7或13次剂量或Q3D施用达4周时，其猴子中的NOAEL显示为1mg/kg)。另见下表9中的数据。
表9大鼠和猴子的毒理学研究总结
基于上述毒理学数据，预期Ab1可以以约0.05mg/kg至0.5mg/kg每周或者更低频率例如每两周的剂量水平安全地施用于人类患者。
实施例9：抗TGF-β单一疗法的体内功效
在此项研究中，我们研究了1D11(一种与人和小鼠TGF-β1、2和3交叉反应的小鼠IgG1抗牛TGF-β抗体)对转移性同基因(syngeneic)肿瘤模型的影响。在该模型中，通过IV将B16-F10小鼠黑素瘤细胞引入C57BL/6小鼠的足垫中，并在小鼠的引流***中形成转移。虽然用对照抗体13C4处理没有效果，但在肿瘤接种后一天开始每周三次用50mg/kg 1D11处理完全消除了转移。
为了研究免疫应答的作用，将B16-F10植入β2-微球蛋白基因中有缺陷并因此缺乏CD8+细胞毒性T细胞应答的小鼠的足垫中并如前处理。与有免疫活性的小鼠(immunecompetent mice)中所见到的结果相反，1D11对这些小鼠中引流***中转移的数量没有影响。这些结果表明TGF-β抑制作用的机制依赖于适应性细胞免疫。
实施例10：癌症中的TGF-β签名标记(Signatures)
先前的研究已经表明，对抗PD-1疗法没有应答的黑素瘤患者具有转录签名标记IPRES(Hugo等，Cell(2016)165:35-44)。为了研究对抗PD-1单一疗法的先天性抗性的机制，我们研究了无应答者相对于应答者的转录签名标记。我们发现，使用基因组富集分析(GeneSet Enrichment Analyses)将这些概貌(profile)与具有超过1M个概貌的数据库比较，揭示了抗PD-1应答与肿瘤中TGF-β信号传导的活化之间的强相关性。这些数据表明，在黑素瘤中在基线时，TGF-β与抗PD-1单一疗法的先天性抗性相关。
此外，我们不仅发现抗PD-1应答与TGF-β信号传导活化之间存在相关性，而且还发现相关性很强(R＝0.59，t检验的p值<9E-4)。因此，我们得到了我们的关口指征(gatewayindication)1：黑素瘤(例如，转移性黑素瘤)中TGF-β介导的免疫抑制可能导致先天性抗性。此外，我们发现TGF-β诱导的基因表达变化可通过1D11处理淬灭，证实了TGF-β活化签名标记的特异性。这些结果为联合使用抗TGF-β和抗PD-1治疗剂治疗对抗PD-1单一疗法无应答的癌症患者提供了支持。
对黑素瘤之外的其他肿瘤类型之中这种相关性的分析揭示了间充质肿瘤(例如，CRC、HCC、头颈部鳞状细胞癌和卵巢癌)也富含TGF-β活化和预测的抗PD-1抗性二者。这一发现与TGF-β信号传导在EMT中的作用一致。因此，我们到达了我们的关口指征2：间充质肿瘤，尤其是那些带有免疫浸润的肿瘤，可能受益于抗TGF-β和抗PD-1联合治疗。使用机器学习方法从30多个EMT标志物基因中鉴定出可用于选择间充质肿瘤的较少数量的基因，例如ACTA2、VIM、MGP、ZEB2和ZWINT。例如，ACTA2和VIM被发现可跨越肿瘤类型转运。因此，TGF-β活化转录签名标记和签名标记内的基因可作为在基线时为抗TGF-β和抗PD-1抗体联合疗法进行癌症患者选择的有用生物标志物。
为了研究肿瘤微环境中的生物标志物，使用MultiOmyx(一种针对CRC和黑素瘤的多重IHC测定法)评估了患者肿瘤的免疫情况。在来自每个肿瘤样品的单个FFPE切片上用12种生物标志物(在一起描述了22种免疫细胞类型)进行复合(multiplexing)。该研究包括了一系列炎症以评估分析物评价每种肿瘤类型以及与可能的治疗效果相关联的情况有多好。开发了统计方法来评价在细胞群体水平上的差异，包括重复一致性、方差分析的火山图和相关性矩阵。MultiOmyx测定法显示出卓越的技术可重复性和精确性、有利的动态范围、在选择免疫细胞和感兴趣区域中的炎症状态差异，并且包括细胞群体之间的正相关性和负相关性二者。
实施例11：在使用或不用抗PD1的条件下用Ab1处理后MC38肿瘤中的TGF-β1、MIP2和KC/GRO的变化
为了证明TGF-β的中和，评估了Ab1(使用或不使用抗PD-1)影响肿瘤中细胞因子表达的能力。
当肿瘤体积为61-110mm3时，用单剂量的PBS或单独的抗PD-1(5mg/kg)或与抗PD-1(5mg/kg)联合的增加剂量的Ab1(10、25或50mg/kg，腹膜内)处理MC38携带肿瘤的小鼠。在指在治疗后1小时、6小时、10小时、24小时、72小时和168小时收获肿瘤并快速冷冻在具有2.8mm陶瓷球的2ml塑料管(Precyllys KT3961-1007.2)中，并保存在-80℃。为了制备裂解物，在室温下融化肿瘤。将1ml的补充有1x HaltTM蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo78440)的冷Meso Scale Diagnostics(MSD)Tris裂解缓冲液(R60TX-2)添加至组织，然后使用24 Dual匀浆器(Bertin Instruments)在2个循环中以6500rpm在4℃进行匀浆，每个循环20s。通过在4℃下在Eppendorf 5417C离心机中以20,000xg离心10分钟来澄清裂解物。如上所述，将上清液转移至干净的冷冻Eppendorf管中并通过再离心30分钟进一步使之澄清。之后，将上清液转移至塑料96-孔储存块中，并防止在冰上。据制造商的说明使用Bicinchoninic Acid(BCA)Protein Assay试剂盒(Thermo 23225)测量裂解物中的蛋白质浓度。通过使用具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的MSD Tris Lysis缓冲液(参见上文)将裂解物标准化至约5mg/ml的蛋白质浓度，并等分在塑料微型管中，在液氮中快速冷冻，并保存在-80℃。
使用电化学发光测定法使用人TGF-β1试剂盒(MSD，K151IUC-2)测量了肿瘤裂解物中的活性TGF-β1的浓度。融化如上所述制备的标准化的肿瘤裂解物，并根据制造商的说明进行测定。为了用数量表示肿瘤中存在的仅TGF-β1的活性形式而不是总TGF-β1(其包括与潜在性相关肽形成复合物的TGFβ-1)，不进行样品的酸处理。将样品一式两份加载在平板上。使用MESO SECTOR S 600读板器(MSD)测量了电化学发光信号，并且基于标准曲线使用MSD Discovery Workbench软件v4.0定量了样品中的TGF-β1浓度。
与单独使用PBS或抗PD-1治疗的动物相比，与抗PD-1(5mg/kg)一起用Ab1以所有给药水平(10、25或50mg/kg)处理的动物显示了肿瘤中具有降低水平的活性TGF-β1，这表明体内Ab1与其靶标的接合(图10A)。1小时内观察到活性TGF-β1水平降低并持续至少168小时。
MIP-2(CXCL2)和KC/GRO(CXCL1)是对于包括中性粒细胞在内的粒细胞的趋化现象的趋化因子。还在这些相同的样品中评估了MIP2和KC/GRO的水平。在Ab1与抗PD-1一起处理后，与单独使用PBS或抗PD-1处理的动物相比，在用Ab1与抗PD-1一起处理的动物中显示MIP2的肿瘤内水平增加了至少4倍；并且显示MIP-2水平的升高持续至少168小时(图10B)。类似地，与MIP-2的KC/GRO的水平相比，显示KC/GRO的水平增加，但是是在72和168小时的更晚的时间点(图10C)。因此，与MIP2和KC/GRO水平的增加相比，Ab1和抗mPD-1 mAb组合更早地引起活性TGF-β1水平的降低。这些结果表明Ab1可以降低肿瘤微环境中TGF-β的水平和抑制肿瘤微环境中的TGF-β。此外，观察到的MIP2和KC/GRO水平的增加表明，它们是被TGF-β的中和所影响的细胞因子，并因此可充当用Ab1治疗的患者中的潜在生物标志物。
实施例12：用Ab1处理恢复NK细胞聚集
已知TGF-β通过抑制不同免疫细胞类型的活性来影响免疫系统。已经报道了TGF-β抑制自然杀伤(NK)细胞活性和NK细胞介导的ADCC(Trotta等，Journal of immunology(2008)181:3784-3792)。最近报道了NK细胞形成密集的簇作为通过IL-2定位在这些密集包装的簇内来增强NK细胞的活性和活化的机制(Kim等，Scientific Reports(2017)7:40623)。显示在IL2存在下体外培养的纯化人NK细胞形成了这些密集包装的簇。
在本研究中，我们评估了在Ab1缺失或存在的情况下TGF-β对NK细胞“聚集”的作用。通过用NK细胞RosetteSep试剂的负选择(negative selection)根据制造商的方案(Stem Cell Technologies)从健康供体的血液中新鲜分离NK细胞。将NK细胞以1.2x105个细胞/孔在圆底测定板(Costar)中补充了Myelocult(Stem Cell Technologies)的IL-2(100IU/mL)中培养。如所示，在存在100μg/mL的无关IgG4或Ab1的情况下，加入TGF-β1至终浓度为0.1、1或10ng/mL。将细胞培养72小时，并通过在尼康显微镜上捕获图像来显现NK细胞聚集。
显示渐增剂量的TGF-β1的添加抑制了NK细胞聚集。当将Ab1而不是IgG4对照抗体加入到NK细胞培养物中时，显示了NK细胞簇的形成。该结果表明，TGF-β中和影响NK细胞活化，导致NK细胞的活性和增殖增加以支持免疫系统的抗肿瘤应答。
实施例13：Ab1处理对增殖性CD8+T细胞中TGF-β介导的对IFN-γ产生的抑制的逆转
除了先天性免疫系统之外，已经报道了TGF-β抑制CD8+ T细胞的活性(Flavell等，Nature Reviews Immunology(2010)10:554-567)。为了探索TGF-β和Ab1对CD8+ T细胞活性的作用，建立了MLR(混合淋巴细胞反应)测定系统，其中将纯化的人CD3+细胞与BLCL细胞混合。首先在TGF-β存在下评估了CD8+细胞增殖和IFN-γ产生。具体而言，在Ficoll梯度分离后，使用EasySep T细胞富集试剂盒(StemCell Technologies)从由正常健康供体分级的PBMC分离CD3+细胞。然后根据制造商的方案(ThermoFisher)用CellTrace Violet标记CD3+细胞。通过将标记的CD3+细胞(2X105个细胞)与经辐照的BLCL细胞(Astarte Bio)(2X104个细胞；2分钟)在补充有10％FBS的RPMI中混合来进行MLR测定。如所示，将TGF-β1、IgG4对照抗体和/或Ab1加入到培养物中，并将培养物在37℃、5％CO2下温育4天。接下来在存在PMA细胞刺激混合物(eBioscience)和蛋白质转运蛋白抑制剂混合物(eBioscience)的情况下刺激细胞4小时。通过在冰上用Zombie NIR存活力染料(BioLegend)染色来区分活细胞并用FAC缓冲液洗涤。将细胞用True-Nuclear缓冲液(BioLegend)固定、洗涤、沉淀(pelleted)并重悬于FAC缓冲液中。通过用BV650抗huCD4、PERCP/Cy5.5抗huCD8、FITC抗huCD3和PE抗huIFNγ(BioLegend)染色来制备细胞用于流式细胞术。在BD Canto上运行流式细胞术，并在FlowJo软件中分析结果并对活细胞、单个细胞(singlet)和CD3+细胞进行门控。通过对CD8+细胞的门控来定量IFNγ+CD8+ T细胞的百分比，所述CD8+细胞基于减少的CellTraceViolet染色已经增殖并且对于IFN-γ染色为阳性。运行FMO作为所有抗体染色的对照。
显示在MLR测定中包含TGF-β使得IFN-γ阳性的CD8+ T细胞的百分比降低了约4倍(图11A)。在不存在TGF-β的情况下，包含Ab1或对照Ab对这些IFNγ+增殖性CD8+细胞的发育没有影响(图11B)。然而，包含Ab1而不是对照抗体能够以剂量依赖性方式恢复IFNγ+CD8+细胞的增殖。这些结果表明，通过阻断TGF-β对表达IFN-γ的效应CD8+细胞的增殖的免疫抑制作用，TGF-β中和能够影响适应性免疫系统。已经提示这些IFNγ+CD8+ T细胞在抗肿瘤免疫中发挥重要作用(Ikeda等，Cytokine Growth Factor Rev(2002)13:95-109)。
实施例14：同基因小鼠模型对抗TGF-β疗法的响应
在此项研究中，我们调查了哪些同基因小鼠模型可用于预测对使用抗TGF-β抗体Ab1和抗PD-1的治疗的应答。为了对小鼠模型进行分层，我们评估了CD8+ T细胞向小鼠肿瘤中的浸润和TGF-β途径活化。基于来自从RNASeq获得的数据的CD8+ T细胞签名标记，来分析CD8+ T细胞浸润。使用全转录组RNAseq对具有从几种适应症(如图12A和12B中x轴下所示)产生的肿瘤细胞的17种不同小鼠同基因模型进行了转录描绘轮廓。同基因模型的这种“概要(compendium)”建立在常见的背景品系C57/BL6上，每种模型使用了5至7个生物学重复。在Illumina2000测序后，使用STAR比对器(aligner)和Cufflinks转录本丰度估计量(transcript abundance estimators)，通过对原始序列读数的标准处理产生了表示为每百万转录物(TPM)中表达的基因表达谱。最终将得到的多样本数据矩阵分位归一化(quantile normalized)。
图12A显示了在概要中CD8+ T细胞的相对丰度(log2-转化的)。使用独特的标志物基因CD8B估计了相对CD8+ T细胞丰度，其已经显示为CD8T细胞存在的高度特异性指示物(Becht等，Curr Opin Immunol(2016)39:7-13；和Becht等，Genome Biol(2016)17:218)。每个方块图总结了生物学重复中的数值的范围。与EMT6模型相比，MC38模型显示约2倍更多的CD8+ T细胞浸润(分别为左框和右框)。A20和EL4淋巴瘤模型分别显示出CD8+ T细胞浸润的总体最高和最低水平，而EL4中的CD8+ T细胞可忽略不计。
MC38、MC38.ova、CT26和L1210鼠类细胞系表现出最高水平的CD8基因签名标记。另外，EMT-6乳腺癌细胞系显示出具有接近基线的T细胞浸润，这与近来有关EMT6肿瘤具有免疫排除表型(immune-excluded phenotype)的报道一致(S.Mariathasan et al.2017,ESMOImmuno-Oncology Congress,Geneva,Geneva Switzerland)。
图12B显示整个概要中的TGF-β途径活化。通过TGF-β体外刺激MCF7细胞衍生出并通过与几种其他TGF-β签名标记比较验证的TGFβ途径活化的170个基因的转录签名标记，用于为概要中的每个概貌指定途径活化评分。使用“受调控的基因集富集分析”(rGSEA，Theilhaber等，2014)计算得分，并将其表示为针对基因背景的签名标记基因的富集log2。虽然MC38模型显示了平均活化，但EMT6模型显示出非常高的TGF-β途径活化(分别为左框和右框)。
实施例15：Ab1和抗PD1抗体组合对小鼠乳腺癌模型的影响
在本项研究中，我们研究了Ab1在有或没有抗PD-1的情况下的治疗效果。将指数生长的EMT-6乳腺细胞(CRL-2755，ATCC)在补充有10％FBS的RPMI-1640中在潮湿的5％CO2培养箱中培养，然后皮下植入(0.5X106个细胞/小鼠)到雌性BALB/c小鼠(上海灵昌生物技术有限公司，中国上海)的侧腹。一旦肿瘤达到68-116mm3的平均大小，将小鼠合并并随机分配至对照和治疗组(每组10只小鼠)。然后对每只动物用PBS、Ab1(10和25mg/kg)每周三次腹膜内处理携带肿瘤的小鼠，总共6次剂量。用数字卡尺每周测量肿瘤2次并计算肿瘤体积(mm3＝L x W x H)，并使用GraphPad Prism绘图。如果肿瘤生长至>3000mm3或肿瘤展现出溃疡>20％的肿瘤面积，则在研究结束时将小鼠用CO2安乐死。
作为单一药剂，剂量为10或25mg/kg Q3D的Ab1和剂量为5mg/kg的小鼠α-PD-1抗体在携带EMT-6肿瘤的小鼠中分别显示出具有1/10、2/10和2/10完全消退的部分活性。剂量为10或25mg/kg Q3D的Ab1与5mg/kg Q3D的小鼠α-PD-1抗体的组合具有治疗活性。在植入后第31天，当比较距离基线的肿瘤体积变化时，所有测试剂量的Ab1与5mg/kg Q3D的小鼠α-PD-1抗体的组合的效果大于每种单一药剂的效果，其中对于10和25mg/kg的Ab1分别为7/10和4/10完全消退。表10是对结果的总结。
表10 Ab1/抗mPD-1组合对EMT-6小鼠模型的作用
除非在此另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。以下描述示例性方法和材料，尽管与本文所述相似或等同的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物和其他参考文献的全部内容通过引用并入。如有冲突，以本包括定义在内的本说明书为准。虽然本文引用了许多文献，但是这种引用不构成承认这些文献中的任何文献构成本领域公知常识的一部分。此外，除非上下文另有要求，否则单数形式的词语应包括复数形式，复数形式的词语应包括单数形式。通常，与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、合成有机化学、药物和药物化学以及蛋白质和核酸化学和杂交有关的命名法和技术是那些熟知并且在本领域中通常使用者。根据制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术，如本领域通常完成的或如本文所述。在整个说明书和实施例中，词语“具有(have)”和“包含(comprise)”或诸如“具有(has)”，“具有(having)”，“包含(comprises)”或“包含(comprising)”这样的变化将被理解为暗示包含所述整数或组整数，但不排除任何其他整数或整数组。
序列表
<110> SANOFI
<120> 抗TGF-β抗体及其用途
<130> 022548.WO011
<140>
<141>
<150> EP 17305061.8
<151> 2017-01-20
<150> 62/448,800
<151> 2017-01-20
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽
<400> 1
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<220>
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Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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