S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原、制备方法及其应用
阅读说明：本技术 S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原、制备方法及其应用 (S-adenosyl homocysteine artificial complete antigen, preparation method and application thereof ) 是由 马岚 刘丹 吴峰 岑瑜 于 2020-05-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法,包括以下步骤：将S-腺苷同型半胱氨酸与二碳酸二叔丁基酯混合,得到一第一中间体,所述二碳酸二叔丁基酯用于保护S-腺苷同型半胱氨酸中的抗原表位；将载体蛋白加入到所述第一中间体中,反应后得到一第二中间体；以及去除所述第二中间体中的所述二碳酸二叔丁基酯,从而得到所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。该方法制备出的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原具有较高特异性、选择性和免疫原性。本发明还提供一种该方法制备的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原以及该S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原在抗体制备上的应用。(The invention provides a preparation method of an artificial complete antigen of S-adenosyl homocysteine, which comprises the following steps: mixing S-adenosyl homocysteine with di-tert-butyl dicarbonate to obtain a first intermediate, wherein the di-tert-butyl dicarbonate is used for protecting an epitope in the S-adenosyl homocysteine; adding carrier protein into the first intermediate, and reacting to obtain a second intermediate; and removing the di-tert-butyl dicarbonate in the second intermediate, thereby obtaining the S-adenosylhomocysteine artificial complete antigen. The S-adenosyl homocysteine artificial complete antigen prepared by the method has higher specificity, selectivity and immunogenicity. The invention also provides the S-adenosyl homocysteine artificial complete antigen prepared by the method and the application of the S-adenosyl homocysteine artificial complete antigen in antibody preparation.)
技术领域
本发明涉及有机化学及免疫学技术领域，尤其涉及一种S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原、制备方法及其应用。
背景技术
在生物体内，活化的甲基化物S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl-L-methionine,SAM)由酶催化将甲基转移到各类蛋白质或者核酸分子上，从而形成对应的甲基化产物称为生物的甲基化。脱去甲基的SAM生成S-腺苷同型半胱氨酸(S-Adenosyl-L-homocysteine,SAH)，再经过进一步水解后脱去腺苷产生同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)该过程为目前已知脊椎动物产生Hcy的唯一途径。
甲基化是生物体普遍存在的重要生化反应，与基因的调控、机体代谢、衰老、疾病、激素等生命过程密切相关，且其量化指标也是阿尔茨海默症(AD)、关节炎、帕金森病(PD)、系统性红斑狼疮、肿瘤乃至抑郁症和精神分裂等多种疾病的重要生理指标。同时，高血Hcy含量更作为心脑血管发病的独立危险因子在临床医学上有重要意义。因此实现对SAH和Hcy的快速简便且精准的检测，有着重要科学价值和广阔的市场前景。传统的检测方法主要有高效液相色谱(HPLC)、质谱法、电化学法、荧光偏振法(FPIA)、毛细管电泳法等，而这些方法费时费力、成本高昂、严重依赖各类大型设备和具备专业技能的操作人员。循环酶法虽然相对简便，但反应繁琐程序复杂并且无法实现对目标分子的瞬时直接检测，更难以开发快速检测试剂。
然而，SAH为小分子物质，属于半抗原，自身无免疫原性，无法直接免疫动物获取对应抗体，需要与合适的载体蛋白耦联后才能制备同时具有免疫原性和免疫反应性的完全抗原。理论上，半抗原为单价抗原，即：分子上只有一个抗原表位。因此要想获得高效和特异性的抗体就必须在连接载体蛋白时保护好关键抗原表位，并将其完全暴露于载体表面，只有这样才能让B细胞的BCR受体识别并得到充分刺激。当小分子有羧基时，通常用酰胺化试剂将之与载体表面氨基缩合连接到载体蛋白表面。虽然该方法副产物少，效率高，但前提是用于耦联的羧基不是抗原的表位。在SAH分子可以看成是Hcy分子与腺苷通过-S-C-键结合，分子中有唯一一个羧基位于同型半胱氨酸部分，而该羧基为抗原表位的关键基团，如要获得可以对SAH分子和Hcy分子都能同时响应的抗体，Hcy端的任何基团都要原封不动完好无损。倘若直接用于连接载体势必会大大影响到合成抗原的免疫特异性，以及后续产生抗体的特异性。然而现仅有的少数SAH和Hcy单抗的制备研究中均忽略了这一关键问题，缺乏基于SAH分子结构的优化合理的抗原制备工艺，不能稳定生产优质高效的SAH抗原和抗体。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法，该方法可有效避免抗原表位在后续制备的过程中被反应而破坏。
另，还有必要提供一种上述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法制备的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。
另，还有必要提供一种上述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原在抗体制备上的应用。
本发明提供一种S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
将S-腺苷同型半胱氨酸与二碳酸二叔丁基酯混合，得到一第一中间体，所述二碳酸二叔丁基酯用于保护S-腺苷同型半胱氨酸中的抗原表位；
将载体蛋白加入到所述第一中间体中，反应后得到一第二中间体；以及
去除所述第二中间体中的所述二碳酸二叔丁基酯，从而得到所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。
本发明还提供一种应用所述的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法制备的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。
本发明还提供一种所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原在抗体制备上的应用。
本发明首先通过将S-腺苷同型半胱氨酸SAH分子上关键的α-氨基以二碳酸二叔丁基酯(Boc)试剂保护，从而屏蔽SAH分子的关键抗原位点，以制备出Boc-SAH第一中间体。该第一中间体可有效避免其在后续制备完全抗原的过程中抗原的关键表位被反应而破坏，同时可以选择性地使SAH分子腺苷端的伯氨基成为与载体蛋白耦联的反应位点。随后通过SAH分子腺苷端的氨基与载体蛋白(BSA)通过戊二醛耦联，制备出Boc-SAH-BSA第二中间体。最后将Boc保护的α-氨基去除保护，修复其关键抗原表位，从而制备出有较高特异性、选择性和免疫原性的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。
附图说明
图1是本发明较佳实施例提供的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备流程图。
图2是本发明较佳实施例提供的第一中间体的分子式。
图3是本发明较佳实施例制备的SAH完全抗原与SAH标准品进行ELISA竞争检测的结果。
图4是本发明较佳实施例制备的SAH完全抗原与Hcy标准品进行ELISA竞争检测的结果。
图5是本发明较佳实施例制备的SAH完全抗原的傅里叶红外鉴定图谱。
图6是拟合的SAH的浓度-吸光度标准曲线。
图7是拟合的SAH的浓度-吸光度标准曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
请参阅图1，本发明较佳实施方式提供一种S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
步骤S11，将S-腺苷同型半胱氨酸与二碳酸二叔丁基酯混合，得到一第一中间体，所述二碳酸二叔丁基酯用于保护S-腺苷同型半胱氨酸中的抗原表位。
其中，通过二碳酸二叔丁基酯(Boc)对S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)中的抗原表位进行保护。如图2所示，SAH分子为同型半胱氨酸(Hcy)分子与腺苷通过-S-C-键结合，分子中有唯一一个羧基位于同型半胱氨酸部分，并与其临近的α-氨基一同构成特具有特征性的所述抗原表位。在后续制备抗原过程中，该处的α-氨基必须不发生反应。因此，SAH分子半胱氨酸部分的α-氨基通过Boc进行选择性保护。其中，所述第一中间体即可表示为Boc-SAH。
步骤S12，将载体蛋白加入到所述第一中间体中，反应后得到一第二中间体。
其中，所述载体蛋白表面具有氨基。所述载体蛋白包括牛血清蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)以及人血清蛋白(HSA)中的至少一种。在本实施方式中，所述载体蛋白为BSA。即所述第二中间体可表示为Boc-SAH-BSA。
具体地，还可将交联剂加入到所述第一中间体中，所述交联剂可以为戊二醛。其中，所述第一中间体的SAH分子中位于腺苷部位的伯氨基与所述载体蛋白表面大量的游离氨基通过所述交联剂反应。其中，位于戊二醛分子末端的醛基分别与载体蛋白表面的氨基以及SAH的氨基形成席夫碱，从而将所述第一中间体连接到所述载体蛋白的表面。
本发明利用戊二醛偶联法可保留SAH分子中半胱氨酸部位的羧基。即该偶联法可以避免破坏SAH的羧基。
在本实施方式中，所述第一中间体与BSA通过戊二醛交联过程中可能发生非特异性的载体蛋白自生交联，其团聚的蛋白可通过分子量为10000的浓缩离心管去除，从而保持制备的Boc-SAH-BSA完全抗原前体有较为均一的分子量和较好的溶解和分散度。
步骤S13，去除所述第二中间体中的所述二碳酸二叔丁基酯，从而得到所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。
在本实施方式中，通过三氟乙酸(TFA)去除所述第二中间体中的保护基团Boc，从而还原所述SAH分子中的α-氨基，修复影响所述抗原表位的化学基团。其中，在修复所述抗原表位时还可使用硅胶催化法，所述硅胶催化法可降低TFA的使用浓度，最大限度避免所述载体蛋白在TFA作用下发生水解。
在本实施方式中，所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原可表示为SAH-BSA。
本发明还提供一种应用所述的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法制备的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。
本发明还提供一种所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原在抗体制备上的应用。
下面通过实施例对本发明进行具体说明。
下述实施例中的pH为7.4，浓度为0.02M的磷酸盐(PBS)缓冲液按照如下方法配制：称取2.3g Na2HPO4、0.524g NaH2PO4.H2O以及8.77g NaCl溶于纯水，用去离子水定容至1L，调pH至7.4，得到pH为7.4，浓度为0.02M的PBS缓冲液。
下述实施例中的透析液按照如下方法配制：取配制好的pH为7.4，浓度为0.02M的PBS液体积稀释2倍则为透析液。
下述实施例中的PBST按照如下方法配制：取配制好的pH为7.4，浓度为0.02M的PBS液，按比例为0.05％加入Tween20溶解混匀则为PBST溶液。
下述实施例中的封闭液按照如下方法配制：取配制好的PBST溶液，按比例为1％加入BSA溶解均匀则为封闭液。
下述实施例中的pH为9.6，浓度为0.5M的碳酸盐(CBS)冲液按照如下方法配制：称取1.59g Na2CO3、2.93g NaHCO3溶于去离子水定容至100ml，调节pH至9.6，得到pH为9.5，浓度为0.5M的CBS缓冲液。
实施例1
第一步、取8.5mg碳酸氢钠溶于2mL去离子水中，完全溶解后加入19.25mg SAH，随后在冰浴环境下缓慢滴加四氢呋喃：二氧六环为1：1的两亲性增溶剂3mL，滴加完毕后在0℃下磁力搅拌15分钟，观察SAH溶解情况，之后加入溶解有11.5μL二碳酸二叔丁基酯的四氢呋喃溶液2mL于0℃下继续反应40分钟，之后升温至25℃继续避光反应18小时。反应结束后加入5mL乙酸乙酯萃取三遍，分离水相后于-20℃冷冻结冰，通过冻干机冷冻干燥回收结晶，该产物为第一中间体(即Boc-SAH)，于4℃保存待用。
第二步、取10mg第一步中制备的Boc-SAH第一中间体以及30mg的BSA一同溶解于3mL浓度为0.02M含0.15M氯化钠，pH为7.4的PBS溶液中，在4℃下平衡15分钟，之后加入45μL浓度为25％的戊二醛，于冰浴下反应2.5小时，之后加入溶有50μL三乙胺，浓度为0.5M，pH为9.6的CBS缓冲液反应2小时。反应结束后将产物以分子量为10000的浓缩离心管于3000rpm下离心分离10分钟，将滤出液于0.01M，pH为7.4的PBS溶液中4℃下透析36小时，每12小时跟换一次透析液，透析结束后回收透析袋中的产物，测定蛋白浓度，所得溶液为第二中间体(即Boc-SAH-BSA)，于4℃保存待用。
第三步、取10mL约含15mg溶质的第二步中的Boc-SAH-BSA第二中间体，于4℃下加入5mg 200目的硅胶，磁力搅拌30分钟，之后升温至30℃后滴加50μL浓度为10％的三氟乙酸，反应5分钟后立即加入2mL浓度为0.1M的碳酸氢钠溶液终止反应并移至冰浴中冷却5分钟，随后离心分离出硅胶，上清液于浓度为0.01M，pH为7.4的PBS溶液中4℃下透析36小时，每12小时跟换一次透析液，透析结束后回收透析袋中的产物，测定蛋白浓度，所得溶液为SAH-BSA完全抗原，于4℃保存待用。
以0.9％生理盐水稀释配制实施例1所制备的SAH-BSA完全抗原，使之终浓度为1mg/ml，取50μL该完全抗原与等体积佐剂配伍，混合均匀后选取8周龄的BALB/C小鼠对其大腿肌肉进行注射免疫，两周后进行第二次免疫，第三周取鼠尾血进行小分子酶联免疫吸附(ELISA)竞争实验。检测结果如图3及图4所示。从图3上可以看出：SAH分子与包被的SAH抗原一同与小鼠外周血中的抗体发生了竞争性结合，其OD值依照游离SAH浓度梯度呈现出了明显的负相关，充分说明所制备的SAH完全抗原有效刺激小鼠免疫B淋巴细胞产生了对应的抗体。从图4上可以看出：Hcy分子与包被的SAH抗原一同与小鼠外周血中的抗体发生了竞争性结合，其OD值依照游离Hcy浓度梯度呈现出了明显的负相关，充分说明所制备的SAH完全抗原是以半胱氨酸部位的关键抗原表位刺激B淋巴细胞，从而产生针对该表位的对应抗体。
取5mg实施例1所制备的SAH-BSA完全抗原的冻干粉，另取5mg SAH原药，利用溴化钾压制窗片后进行傅里叶红外光谱表征。测试结果如图5所示，从图5中可以看出，所制备的SAH抗原在波数为3065nm处有SAH分子中嘧啶基团的特征C-H伸缩振动峰，波数为1580nm附近有嘧啶环C＝N和C＝C双键中等强度的伸缩振动峰，波数为1600nm处有尖锐且强度较高的羧基中O-H的非蒂合峰，充分说明SAH半抗原分子成功连接到了载体蛋白分子表面。
以浓度为0.05M pH为9.6的碳酸缓冲液配制实施例1中制备的SAH-BSA完全抗原，使之终浓度为10μg/mL，以该溶液包被ELISA 96孔板并于4℃孵育过夜，之后倒掉包被液，用含0.05％Tween20的浓度为0.02M PBST溶液洗涤三次后在吸水纸上拍干，再加入含1％BSA的PBST溶液于37℃封闭2小时，分别将SAH和Hcy配制成系列浓度(1mg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL)分别与稀释100倍的鼠尾血按照1：1混匀后按浓度梯度加入96孔板中37℃下孵育一小时，并设一个空白对照孔。之后用PBST洗板3次后加入1:4000稀释的酶标二抗，37℃下孵育一小时，之后再用PBST洗板3次后加入含邻苯二胺(OPD)的显色液，显色15分钟后用硫酸终止液终止反应，立即用酶标仪检测OD值。其检测结果如下表1所示。
表1以SAH完全抗原制备多抗对不同浓度SAH、Hcy的竞争ELISA结果
利用紫外-可见光分过光度计通过波长范围为200nm-400nm对SAH进行扫描，确定其最大吸收峰位于261nm处。按照SAH的浓度梯度：17μg/ml、8.5μg/ml、4.25μg/ml、2.125μg/ml以及1.062μg/ml在261nm处测定对应吸光度(表2)，绘制浓度-吸光度标准曲线(如图6)，拟合对应线性方程：ASAH＝0.038CSAH+0.00206，R2＝0.998。
表2波长为261nm处不同浓度梯度SAH所对应的吸光值
利用紫外-可见光分过光度计通过波长范围为通过200nm-400nm对BSA扫描，确定其最大吸收峰位于278.5nm处。按照BSA的浓度梯度：1.5mg/ml、0.75mg/ml、0.375mg/ml、0.186mg/ml以及0.094mg/ml在278.5nm处测定对应吸光度(表3)，绘制浓度-吸光度标准曲线(如图7)，拟合对应线性方程：ABSA＝0.375CBSA+0.0254，R2＝0.995。
表3波长为278.5nm处不同浓度梯度BSA所对应的吸光值
分别测定实施例1中制备的SAH完全抗原的蛋白浓度为0.52mg/ml，吸光度A1为0.768，将浓度值代入BSA浓度-吸光度标准方程计算得到SAH完全抗原分子上BSA所产生的吸光度A2为0.1876，根据朗伯比尔吸光度叠加原理，ASAH＝A1-A2，ASAH＝0.579，代入SAH浓度-吸光度标准方程中计算得到CSAH为0.015mg/ml，从而计算SAH完全抗原的耦联比为1:5.28。
本发明首先通过将S-腺苷同型半胱氨酸SAH分子上关键的α-氨基以Boc试剂保护，从而屏蔽SAH分子的关键抗原位点，以制备出Boc-SAH第一中间体。该第一中间体可有效避免其在后续制备完全抗原的过程中抗原的关键表位被反应而破坏，同时可以选择性地使SAH分子中剩余的伯氨基与成为与载体蛋白耦联的反应位点。随后通过SAH分子腺苷端的氨基与载体BSA通过戊二醛耦联，制备出Boc-SAH-BSA第二中间体。最后将Boc保护的α-氨基去除保护，修复其关键抗原表位，从而制备出有较高特异性、选择性和免疫原性的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。本发明所制备的SAH抗原可为优质SAH单克隆抗体的制备，生物甲基化快速检测试剂等的制备和开发奠定坚实基础。
以上实施方式仅用以说明本发明实施例的技术方案而非限制，尽管参照以上较佳实施方式对本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明实施例的技术方案进行修改或等同替换都不应脱离本发明实施例的技术方案的精神和范围。