阅读说明：本技术 一种天然油脂抗氧化剂的制备方法及用途 (Preparation method and application of natural oil antioxidant ) 是由 姚宏亮 唐艳 石琪鑫 钱金旖 杨佳妮 秦莹 于 2020-05-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种天然油脂抗氧化剂的制备方法及用途,天然油脂抗氧化剂为甘薯叶黄酮,制备方法包括如下步骤：步骤1,将甘薯叶制备成甘薯叶超微粉,然后将超微粉放入提取液中,提取液为乙醇,提取条件为：乙醇浓度50%-90%,液料比30:1-70:1(mL/g),超声提取,提取时间30-150min,提取温度40-80℃；步骤2,随后离心(4000r/m,4℃,10min)去上清液,将上清液旋转浓缩至无明显醇味,步骤3,再次离心(4000r/m,4℃,10min)取上清液即为甘薯叶黄酮提取液；然后再提纯处理。本发明,以现有的甘薯叶为原料提取黄酮并应用于食用油脂天然抗氧化剂的开发具有重要的现实意义,原料来源广泛,且成本低,具有良好的经济效益。(The invention discloses a preparation method and application of a natural oil antioxidant, wherein the natural oil antioxidant is sweet potato leaf flavone, and the preparation method comprises the following steps: step 1, preparing sweet potato leaves into sweet potato leaf superfine powder, then putting the superfine powder into an extracting solution, wherein the extracting solution is ethanol, and the extracting conditions are as follows: extracting with 50-90% ethanol at a liquid-to-material ratio of 30:1-70:1(mL/g) under ultrasonic conditions for 30-150min at 40-80 deg.C; step 2, centrifuging (4000r/m, 4 ℃ and 10min) to remove supernatant, concentrating the supernatant in a rotating manner until no obvious alcohol smell exists, and step 3, centrifuging again (4000r/m, 4 ℃ and 10min) to obtain supernatant which is the sweet potato leaf flavone extracting solution; then purifying. The invention has important practical significance for extracting flavone from the existing sweet potato leaves as the raw material and applying the flavone to the development of the natural antioxidant of the edible oil, has wide raw material source and low cost, and has good economic benefit.)

一种天然油脂抗氧化剂的制备方法及用途

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，具体为一种天然油脂抗氧化剂的制备方法及用途。

背景技术

近年来，随着人们对营养和健康的不断追求，甘薯叶作为一种功能性蔬菜越来越受欢迎。一些口感好、品质优的菜用甘薯新品种在我国得到一定的规模种植，经济效益显著。甘薯叶中蛋白质、矿物质丰富，还富含黄酮类化合物，黄酮因具有抗氧化、抗菌等多种功能活性而广受人们的关注与研究。关于黄酮的抗氧化研究多集中在体外自由基清除能力的分析，而对其进行食用油脂抗氧化应用的研究较少。目前食用油脂中使用较多的抗氧化剂是二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、和特丁基对苯二酚(TBHQ)等合成抗氧化剂，它们起到较好的抗氧化作用，但却具有一定的毒性和致癌可能性。因此，它们在食用油脂中的使用量受到限制，最高使用量为0.2g/Kg。安全性高、抗氧化能力强的食用油脂天然抗氧化剂日益受到关注，甘薯叶贮存期短，鲜销甘薯叶极易黄化、腐烂，因此开展甘薯叶的深加工研究很有必要，以其为原料提取黄酮并应用于食用油脂天然抗氧化剂的开发具有重要的现实意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了一种天然油脂抗氧化剂的制备方法及用途，。

为了达到以上目的，本发明提供如下技术方案：

一种天然油脂抗氧化剂，天然油脂抗氧化剂为甘薯叶黄酮。

甘薯叶黄酮的制备方法包括提取过程和纯化过程，包括如下步骤：

步骤1，将甘薯叶制备成甘薯叶超微粉，然后将超微粉放入提取液中，提取液为乙醇，提取条件为：乙醇浓度50％-90％，液料比30:1-70:1(mL/g)，超声提取，提取时间30-150min，提取温度40-80℃；

步骤2，随后离心(4000r/m，4℃，10min)去上清液，将上清液旋转浓缩至无明显醇味，

步骤3，再次离心(4000r/m，4℃，10min)取上清液即为甘薯叶黄酮提取液。

步骤4，采用大孔吸附树脂对甘薯叶黄酮粗提取液纯化处理，纯化过程为：对大孔吸附树脂进行预处理，然后称取大孔吸附树脂装柱，分别加入甘薯叶黄酮粗提取液，用旋转混匀仪吸附后抽滤，抽滤后的大孔吸附树脂加入乙醇溶液于旋转混匀仪解吸后抽滤，得到纯化后的甘薯叶黄酮提取液。

进一步的，步骤1最低超声功率320W。

进一步的，步骤1的提取条件为：提取温度70℃、提取时间120min、乙醇浓度80％、液料比70：1。

进一步的，步骤4的大孔吸附树脂为AB-8大孔树脂。

进一步的，步骤4的纯化过程为：采用湿法装柱法将大孔树脂装柱，将浓度为2.0mg/mL-40.0mg/ml的甘薯叶黄酮粗提取液上样液，上样液pH值为3-7；以1BV/h-5BV/h的流速过柱进行吸附，后用3BV超纯水过柱去除树脂表面杂质；以浓度为60-100％的乙醇溶液以1BV/h-5BV/h的流速过柱进行解吸，收集过柱后的解吸液。

进一步的，步骤4的纯化过程为：甘薯叶黄酮粗提取液的最佳浓度为2.5mg/mL，最佳上样液pH值为5；最佳上样流速为2BV/h；最佳乙醇溶液浓度为100％；解吸液流速为2BV/h。在上述最佳条件下，纯化回收率可达到45.61±0.02％。

一种甘薯叶黄酮的用途，甘薯叶黄酮对食用油脂具有抗氧化效果；所述甘薯叶黄酮用于食用油脂的天然抗氧化剂。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明的甘薯叶黄酮的提取方法，整体提取高效，提取效果好，提供了一种安全性能搞、抗氧化能力强的食用油脂天然抗氧化剂。

2、本发明的甘薯叶黄酮的纯化方法，纯化回收率高，纯化效果显著，且纯化时间短。

3、本发明的甘薯叶黄酮，可作为食用油脂的天然抗氧化剂，具有安全系能高、抗氧化效果好的优势，且甘薯叶黄酮为纯天然成分，食用更安全放心。

4、本发明，以现有的甘薯叶为原料提取黄酮并应用于食用油脂天然抗氧化剂的开发具有重要的现实意义，原料来源广泛，且成本低，具有良好的经济效益。

附图说明

图1为几种甘薯叶黄酮提取得率的比较图；

图2A为甘薯叶黄酮提取单因素实验结果图(提取温度不同)；

图2B为甘薯叶黄酮提取单因素实验结果图(提取时间不同)；

图2C为甘薯叶黄酮提取单因素实验结果图(乙醇浓度不同)；

图2D为甘薯叶黄酮提取单因素实验结果图(液料比不同)；

图3为不同大孔树脂的纯化效果图；

图4A为纯化过程影响因素研究结果图(上样液质量浓度不同)；

图4B为纯化过程影响因素研究结果图(上样液pH值不同)；

图4C为纯化过程影响因素研究结果图(上样液流速不同)；

图4D为纯化过程影响因素研究结果图(解吸溶剂浓度不同)；

图4E为纯化过程影响因素研究结果图(解吸溶剂流速不同)；

图5A为甘薯叶黄酮对食用油脂的抗氧化效果图(猪油)；

图5B为甘薯叶黄酮对食用油脂的抗氧化效果图(花生油)；

图5C为甘薯叶黄酮对食用油脂的抗氧化效果图(调和油)；

图6为芦丁标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

1.1实验材料

实验材料：甘薯叶由xx有限公司提供，新鲜甘薯叶原料在50℃条件下热风干燥，超微粉碎，备用。猪油为采购于农贸市场并在实验室经熬炼而成，花生油、调和油采购于超市。芦丁(≥95％)、二丁基羟基甲苯(Butylated hydroxytoluene,BHT)、大孔吸附树脂购于xx有限公司，其他试剂均购于xx有限公司。

1.2主要仪器

实验设备：LS-1离心浓缩仪；

SCIENTZ-10冷冻干燥机；

KQ-800KDV超声波清洗仪；

H2050R高速冷冻离心机；

EV351旋转蒸发仪；

Alpha-1860紫外可见分光光度计；

DHG-9073B5-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱；

QE-1000超微气流粉碎机；

SB 3003电子天平；

HL-2B恒流泵；

MX-RL-Pro LCD数控旋转混匀仪。

2.实验方法

2.1芦丁标准曲线的绘制

以芦丁为标准品，配制不同浓度标准溶液，采用硝酸铝法在509nm处测定吸光值，并以标准溶液质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。在质量浓度为0.015～0.075mg/mL范围内，吸光度(A)与芦丁质量浓度(C)的线性方程为A＝10.402C+0.0318(R2＝0.9995)，见图6。

2.2几种甘薯叶黄酮提取得率的比较

选取了薯绿1号、徐紫菜薯1号、黄金叶、蒲薯53等四种不同种类的甘薯叶，分别在相同的提取条件下进行黄酮的提取，然后比较四种甘薯叶的黄酮提取得率，计算公式见式(1)，选取提取得率最高的品种作为后续研究对象。提取条件如下：乙醇提取液浓度70％，液料比60:1，超声提取功率320W，提取时间60min，提取温度70℃。随后离心(4000r/m，4℃，10min)去上清液，将上清液旋转浓缩至无明显醇味，再次离心(4000r/m，4℃，10min)取上清液即为甘薯叶黄酮提取液，定容(V)待测。

式中C为根据标准曲线计算出的甘薯叶黄酮提取液浓度，mg/mL；V为黄酮提取液定容体积，mL；m为甘薯叶粉质量，g。

2.3甘薯叶黄酮提取工艺单因素试验

影响黄酮提取得率的主要因素有提取温度、提取时间、提取液(乙醇)浓度、液料比、超声功率等。根据前期实验研究结果发现采用超声辅助作用明显提高黄酮提取率，但不同的超声功率对提取率的作用差异不显著，因此在提取工艺研究中采用固定的最低超声功率320W。固定提取时间60min，乙醇浓度70％，液料比60:1，比较不同的超声提取温度对黄酮提取得率的影响；固定提取温度为70℃，乙醇浓度70％，液料比60:1，比较不同的超声提取时间对黄酮提取得率的影响；固定提取温度为70℃，提取时间60min，乙醇浓度70％，比较不同的液料比对黄酮提取得率的影响；固定提取温度为70℃，提取时间60min，液料比60:1，比较不同的乙醇浓度对黄酮提取得率的影响。

2.4甘薯叶黄酮提取工艺正交实验

根据单因素试验的结果，设计四因素三水平正交实验，正交试验设计见表1。

表1 甘薯叶黄酮提取正交实验设计因素水平表

2.5甘薯叶黄酮纯化工艺研究

2.5.1甘薯叶黄酮粗提液的制备

准确称量5g甘薯叶超微粉，按照提取工艺优化条件提取甘薯叶黄酮，离心(4000r/m，4℃，10min)后将得到的上清液旋转浓缩至无明显醇味，再次离心(4000r/m，4℃，10min)取上清液并在509nm处测定其吸光值，计算出粗提液黄酮质量浓度。

2.5.2纯化树脂的筛选

按产品说明书对AB-8、HPD600、D101三种大孔吸附树脂进行预处理。各称取2g于50mL离心管中，分别加入甘薯叶粗提液20mL(质量浓度为C0)，用旋转混匀仪吸附12h后抽滤，将滤液定容至20mL并测定黄酮质量浓度(C1)，将吸附树脂置于干燥的50mL离心管中，加入20mL 95％乙醇溶液于旋转混匀仪解吸12h后抽滤，将滤液定容至20mL并测定黄酮质量浓度(C2)。计算不同树脂的吸附率、解吸率、回收率，筛选出纯化效果最佳的大孔吸附树脂，计算公式见式(2)～(4)：

R＝AD。 (4)

式中A---吸附率，％；D---解吸率，％；R---回收率，％；C0---吸附初始溶液黄酮质量浓度，mg/mL；C1---吸附平衡溶液黄酮质量浓度，mg/mL；C2---解吸液黄酮质量浓度，mg/mL。

2.5.3纯化过程影响因素研究

纯化包括相对独立的吸附、解吸两部分过程，影响吸附效果的因素有上样液质量浓度、上样液pH值、上样流速等，影响解吸效果的因素有解吸溶剂浓度、解吸流速等。采用湿法装柱法将2g AB-8大孔树脂装柱，将10mL不同质量浓度的甘薯叶黄酮粗提液以2BV/h的流速过柱，收集过柱后的吸附液并定容至10mL，测定其吸光值，分析上样液质量浓度对吸附率的影响；取10mL质量浓度为2.5mg/mL上样液，将其pH值分别调成1～7，以2BV/h的流速过柱，收集过柱后的吸附液并定容至10mL，测定其吸光值，分析上样液pH值对吸附率的影响；取10mL浓度为2.5mg/mL、pH值为5的上样液，分别以1～5BV/h的流速过柱，收集过柱后的吸附液并定容至10mL，测定其吸光值，分析上样流速对吸附率的影响。

采用湿法装柱法将2g AB-8大孔树脂装柱，将10mL、pH值为5、质量浓度为2.5mg/mL上样液，以2BV/h的流速过柱进行吸附，后用3BV超纯水过柱去除树脂表面杂质。分别以10mL浓度为60～100％的乙醇溶液以3BV/h的流速过柱进行解吸，收集过柱后的解吸液并定容至10mL，测定其吸光值，分析解吸溶剂浓度对解析率的影响；重复上述吸附过程，用10mL浓度为100％的乙醇溶液分别以1～5BV/h流速进行解吸，收集过柱后的解吸液并定容至10mL，测定其吸光值，分析解吸流速对解析率的影响。

2.6食用油脂的抗氧化效果研究

以20g甘薯叶超微粉为原料，按照提取优化条件制备甘薯叶黄酮粗提液，并经旋转浓缩后定容至100mL，一半经冷冻干燥后获得甘薯叶黄酮粗提物，另一半进行纯化并经冷冻干燥后获得甘薯叶黄酮纯化物。

采用烘箱加温法，将试验食用油样放入60℃烘箱加速氧化，每隔24小时取样测定油脂过氧化值。以不加任何抗氧化剂的花生油、调和油、猪油为空白对照，以添加常用油脂抗氧化剂BHT的油样为参比对照，分析甘薯叶黄酮粗提物、纯化物对食用油脂的抗氧化效果。参照国家标准最大限量(0.2g/Kg)，BHT、甘薯叶黄酮粗提物、黄酮纯化物的添加量均为0.02％。

2.7数据分析

实验平行三次，结果表示为平均值±标准偏差，采用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行统计分析，显著性分析采用ANOVA Duncan法，显著水平为0.05，采用AdobeIllustrator软件绘图。

3.结果与分析

3.1不同甘薯叶黄酮提取得率

如图1所示，图中不同小写字母代表差异显著。经分析，在同样提取条件下薯绿1号甘薯叶的黄酮提取率最高，达到5.07±0.14％，因此选择薯绿1号作为后续研究的品种。

3.2甘薯叶黄酮提取单因素试验结果

如图2A-图2D所示，图中不同小写字母代表差异显著，提取温度、提取时间、乙醇浓度、液料比对甘薯叶黄酮提取得率的影响。由图2A可以看出，随着温度的升高，甘薯叶黄酮的提取得率先增加后减少，温度升高促进了分子运动、加速黄酮的浸出，但温度过高造成溶剂挥发加剧，反而减少了溶剂与物料的接触，降低了扩散速度，同时，高温条件下杂质的溶出量增加，造成黄酮提取得率下降；由图2B可以看出，随着提取时间的增加，甘薯叶黄酮提取得率逐渐提高，但90min后提取得率趋于稳定水平，黄酮的浸出趋于饱和；由图2C可以看出，甘薯叶黄酮提取得率随着乙醇浓度的增加而呈现先升高后下降的趋势，在乙醇浓度为80％时提取率最高，随后提取得率下降，可能是脂溶性成分溶出造成黄酮类物质浸出率降低；由图2D可以看出，随着液料比的增加，甘薯叶黄酮的提取得率先增高后趋于稳定水平，这可能是由于浸提液体积的增加使得物料与浸提液充分接触从而促进黄酮的浸出直至浸出达到饱和，而过多的乙醇可能造成脂溶性物质的溶出反而造成黄酮提取得率的下降。

3.3甘薯叶黄酮提取正交试验结果

根据单因素试验结果，以提取温度(A)、提取时间(B)、乙醇浓度(C)、液料比(D)为因素，设计了四因素三水平正交实验，试验结果见表2。

表2 甘薯叶黄酮提取正交试验设计结果

正交实验结果表明：各因素对甘薯叶黄酮提取效果影响的主次顺序依次为液料比＞乙醇浓度＞提取时间＞提取温度，利用IBM SPSS方差分析结果表明上述4个因素对甘薯叶黄酮提取得率影响均极显著(p<0.01)。正交试验设计所得到的优化组合为A₂B₃C₂D₃即提取温度70℃、提取时间120min、乙醇浓度80％、液料比70：1的组合。按照上述步骤进行实验，平行三次，所得结果与正交实验最优结果A₂B₁C₂D₃进行差异性分析，结果显示差异不显著(p>0.05)。出于节省提取时间的考虑，确定最佳工艺条件为A₂B₁C₂D₃即提取温度70℃、提取时间60min、乙醇浓度80％、液料比70：1，此条件下甘薯叶黄酮提取得率为8.40±0.20％，提取得率与文献结果相当，甘薯叶属于黄酮含量很高的植物资源，具有很高的开发利用价值。

3.4不同树脂纯化效果

由图3可以看出，AB-8大孔吸附树脂对甘薯叶黄酮的吸附效果最好，达到50.17％，在解吸过程中，HPD-600大孔吸附树脂对甘薯叶黄酮的解吸效果较好，解吸率达92.82％。最终通过比较三种不同大孔树脂的回收率，确定AB-8大孔吸附树脂为最佳纯化树脂。

3.5纯化过程影响因素研究结果

由图4A可知，当上样液浓度逐渐变小的时候，甘薯叶黄酮的吸附率随之增大，当浓度达到2.5mg/mL时，吸附率达到最高，此后吸附率随着粗提液浓度的减小而降低。当粗提液浓度过高时，粗提物中的杂质较多会堵住AB-8大孔树脂的吸附孔，导致吸附率较低，而当浓度降低时，粗提液中含有的黄酮量减少，无法使AB-8树脂达到吸附饱和状态，故吸附率下降。由图4B可知，随着pH值的增大，甘薯叶黄酮的吸附率逐渐变低。甘薯叶黄酮是一种多羟基化合物，呈弱酸性，在酸性条件下更容易被大孔树脂吸附，因此黄酮在酸性条件下或弱酸条件下有更好的吸附效果，经过分析，选择pH值5为最佳上样pH值。由图4C可知，黄酮的吸附效果随着上样液流速的增加而减小。上样液流速越快，树脂吸附的有效时间越短，黄酮不能被大孔树脂完全吸附，因此流速较快时会导致吸附率较低，但流速过慢造成纯化耗时，因此，选择上样流速为2BV/h。由图4D可知，解吸溶剂浓度从60％增加到100％的过程中，解吸率逐渐增加，这是高浓度乙醇溶液的极性与黄酮相似的原因。由图4E可知，随着解吸溶剂流速增大，黄酮的解吸率逐渐降低。流速越快，解吸溶剂与大孔树脂接触时间越短，此时大孔树脂中吸附的黄酮无法完全被乙醇解吸出来，因此解吸率较低，经过分析，选择2BV/h作为最佳解吸液流速。在上述最佳条件下，纯化回收率可达到45.61±0.02％。

3.6甘薯叶黄酮对食用油脂的抗氧化效果

食用油在60℃干燥箱中加速了氧化，干燥箱中强化氧化1天近似于常温贮存1个月，食用油脂的过氧化值也不断升高。

由图5A可以看出，前四天对照组以及实验组的猪油过氧化值差别并不大且在第三天时过氧化值就超过了0.2，超出了国家标准要求，在试验后期添加抗氧化物实验组的油脂过氧化值明显低于空白对照组。可见，本专利中的天然或合成油脂抗氧化物使用量对动物油脂的抗氧化作用没有实际应用意义，但可以加大甘薯叶黄酮的添加量以提高其在动物油脂中的抗氧化作用。

由图5B以及图5C可以看出，实验第四天，空白对照组花生油、调和油的过氧化值均超过0.25，超出国家标准要求，而添加了甘薯叶黄酮提取物的植物油其过氧化值直到第六天仍然符合标准要求，到第7天时才刚刚超出标准，其在烘箱中的贮存时间比空白对照组延长2-3天，结果与BHT实验组相近。可见，在现有使用量的情况下，甘薯叶黄酮提取物对植物油有很好的抗氧化作用，纯化物效果更佳。

4.结论

在几种甘薯叶中，薯绿1号的黄酮提取得率最高，在提取温度为70℃、提取时间为60min、乙醇浓度80％、液料比70：1、超声功率为320W的优化条件下甘薯叶黄酮提取得率可达到8.40±0.20％。三种大孔吸附树脂中AB-8对甘薯叶黄酮的纯化回收率最高，纯化过程中上样液质量浓度、上样液pH、上样液流速、解吸溶剂浓度和解吸流速的最佳条件分别为2.5mg/mL、5、2BV/h、100％、2BV/h，在该条件下，回收率达到45.61±0.02％。通过食用油脂烘箱强化贮藏试验发现，甘薯叶黄酮提取物能有效抑制动、植物油的氧化，其抗氧化效果与BHT相当。在植物油中的使用量数值具有直接商业应用的参考价值，但对动物油脂实现抗氧化作用商业应用的使用量还有待进一步研究。本专利的研究结果为：甘薯叶黄酮对食用油脂具有抗氧化效果；甘薯叶黄酮可作为一种天然油脂抗氧化剂。

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。