阅读说明：本技术 利用外源金属硫蛋白构建酵母发酵产高含硒蛋白的方法 (Method for producing high-selenium-content protein by constructing yeast fermentation by using exogenous metallothionein ) 是由 马云峰 王松廷 李华 于 2019-06-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了利用外源金属硫蛋白构建酵母发酵产高含硒蛋白的方法,以酵母菌作为原始菌株,设计引物对YES2-MT2和引物对MT2-yes2-F,经遗传转化得到基因工程菌,基因工程菌再经过发酵生产高含硒蛋白；本发明以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为原始菌株,经过外源基因遗传转化得到基因工程菌,基因工程菌再经过发酵生产以及分离纯化得到高含硒蛋白,无机硒转化为硒蛋白的总效率高达22％,可实现工业化生产。(The invention discloses a method for producing high-selenium protein by constructing yeast fermentation by utilizing exogenous metallothionein, which comprises the steps of taking yeast as an original strain, designing a primer pair YES2-MT2 and a primer pair MT2-YES2-F, obtaining genetic engineering bacteria through genetic transformation, and fermenting the genetic engineering bacteria to produce the high-selenium protein; the invention takes Saccharomyces cerevisiae as an original strain, obtains genetically engineered bacteria through exogenous gene genetic transformation, obtains high selenium-containing protein through fermentation production and separation and purification of the genetically engineered bacteria, has the total efficiency of converting inorganic selenium into the selenium protein as high as 22 percent, and can realize industrial production.)

利用外源金属硫蛋白构建酵母发酵产高含硒蛋白的方法

技术领域

本发明涉及利用外源金属硫蛋白构建酵母发酵产高含硒蛋白的方法，具体为以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为原始菌株，经过外源基因遗传转化得到基因工程菌，基因工程菌再经过发酵生产高含硒蛋白。

背景技术

硒是生物体所必需的一种微量元素，具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力、预防心血管疾病以及癌症等功能。而我国较多地区出现人群的硒营养不足，需要补充含硒食物，研究表明有机硒化合物更能被人体吸收和利用。微生物发酵合成有机硒具有快速、稳定、高效的特点。但是，在已有的研究中存在以下不足：如对菌体中有机硒化合物的分离分析不够充分；对有机硒合成的限制因素研究不足等问题。

硒的生物有机化主要是通过动物、植物、微生物使无机硒合成为有机硒，和植物、动物合成有机硒相比，微生物发酵合成具有生产周期短，可工业放大，质量和产量稳定的特点，更适合富硒产品的产业化发展，并且国内外都取得了一定的进展。金属硫蛋白(Metallothionein,简称MT)，无金属结合的MT称作硫蛋白(thionein)，是一类广泛存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸、能被金属诱导的金属结合蛋白,具有广泛的生物学功能,主要参与微量元素的储存、运输和代谢,拮抗电离辐射,清除羟基自由基及重金属解毒等。MT除了能保护细胞免受重金属伤害的功能外，还是自由基的高效清除剂，可以保护酵母免受氧化胁迫，从金属硫蛋白的功能可知其主要参与抗逆的次生代谢，而不参与或很少参与生物体的基本代谢，更重要的是其富含半胱氨酸，硒可以取代金属硫蛋白中的硫成为硒代金属硫蛋白，而且对生物体的基本代谢影响较小，这就使有机硒在细胞内高效富集成为可能。

修佳祺利用重叠延伸PCR技术将鼠型MT2型基因拆分为两个目的片段,采用两次PCR的方式成功合成了鼠型MT2型编码基因,并成功将其克隆入pMD18-T载体。林稚兰利用重金属诱导酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BD101和异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)BD102产生金属硫蛋白。通过重金属诱导会造成后期纯化困难等问题，而直接将MT基因构建载体在宿主表达会面临检测转化子困难等问题。所以需要一种能够将外源基因转入宿主并简便、快速检测成功转化子的方法。目前，还没有利用外源金属硫蛋白基因在酵母中表达生产高含硒蛋白的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中有机硒在细胞内高效富集的方法为通过重金属诱导或直接将MT基因构建载体在宿主表达，而通过重金属诱导会造成后期纯化困难等问题，而直接将MT基因构建载体在宿主表达会面临检测转化子困难等问题的缺陷，提供一种利用外源金属硫蛋白构建酵母发酵产高含硒蛋白的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明公开了一种利用外源金属硫蛋白与融合蛋白基因构建载体转化酵母基因工程菌发酵生产高含硒蛋白的方法，菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。具体为以酵母菌作为原始菌株，设计引物对YES2-MT2和引物对MT2-yes2-F，经遗传转化得到基因工程菌，基因工程菌再经过发酵生产高含硒蛋白；

设计引物对YES2-MT2和引物对MT2-yes2-F，其序列如下：

YES2-MT2-R：AGCAGTTGGGGTCCATGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTA

YES2-MT2-F：GCTGTGCCGACGACGACAAGatGGGTAAGGGAGAAGAACTT

MT2-yes2-F:GGTACCGAGCTCGGATCCATGGACCCCAACTGCTCCTGTG

MT2-Yes2-R:TTACCCATCTTGTCGTCGTCGGCACAGCAGCTGCACTTGT

其中引物对YES2-MT2用于反向扩增载体序列带MT2同源臂，引物对MT2-yes2-F用于扩增MT2片段。引物对YES2-MT2和已有的EGFP-pGK质粒为模板扩增载体框架，以第二对引物和之前构建好的质粒为模板扩增MT2片段。扩增产物经处理后再进行无缝克隆。然后转化感受态细胞，涂布含Amp的LB平板，37℃培养，长出的单克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定的阳性克隆即为重组克隆。提取质粒备用。将质粒加到酵母感受态细胞，进行电转化，筛选阳性重组子，接种鉴定的阳性单克隆至MD培养基中，30℃培养3-5天分别取样后检测蛋白表达情况，可以进行荧光检测，将培养物上清直接置于紫外灯下，观察有荧光产生；WesternBlotting检测,有目的条带产生即转化成功，得到基因工程菌株MT22。

将菌株MT22接种于含碳源源、氮源、无机盐和水的培养基中进行培养产酶，通过离心收集MT22细胞，破碎细胞分离纯化高含硒蛋白的方法。

将基因工程菌MT22先进行活性培养，再按1～10％的接种量接种到种子培养基中，于28～30℃好氧培养4～8h；然后将培养好的种子按2～5％的接种量接入液体发酵培养基。其中，所述种子培养基为马铃薯液体培养基，培养基pH自然。

进一步的，种子培养于28～30℃好氧培养4～8h，培养基中加亚硒酸钠,浓度为0.1-10mmol/L；在摇瓶中进行，摇床转速160～230r/min；发酵培养于28～30℃好氧培养4～8h，发酵罐通风量0.5～1vvm，搅拌转速为100～600r/min。优选的，所述液体发酵培养基的氮源为：酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆中的一种或多种。

进一步的，在发酵结束后，将发酵液离心后保留沉淀，加缓冲液，细胞破壁；离心取上清溶液，用肠激酶水解后，离心取上清溶液。然后进SDS-PAGE分离测定根据蛋白质Marker以及标准品收集条带，计算目的蛋白中硒的含量。测定办法为将硒蛋白条带进行消解，在酸性条件下与2,3-二氨基苯进行衍生反应，通过高效液相色谱测定硒的含量。优选的，用肠激酶37℃保温水解30分钟。

硒蛋白转化率定义方法：(高硒蛋白中硒量/投入的硒的量)×100％

本发明所达到的有益效果是：本发明以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为原始菌株，经过外源基因遗传转化得到基因工程菌，基因工程菌再经过发酵生产以及分离纯化得到高含硒蛋白，无机硒转化为硒蛋白的效率高达22％，可实现工业化生产。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

一种利用外源金属硫蛋白与融合蛋白基因构建载体转化酵母基因工程菌发酵生产高含硒蛋白的方法，出发菌株为酿酒酵母，设计引物对YES2-MT2和引物对MT2-yes2-F，经遗传转化得到基因工程菌，基因工程菌再经过发酵生产高含硒蛋白；

设计引物对YES2-MT2和引物对MT2-yes2-F，其序列如下：

YES2-MT2-R：AGCAGTTGGGGTCCATGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTA

YES2-MT2-F：GCTGTGCCGACGACGACAAGatGGGTAAGGGAGAAGAACTT

MT2-yes2-F:GGTACCGAGCTCGGATCCATGGACCCCAACTGCTCCTGTG

MT2-Yes2-R:TTACCCATCTTGTCGTCGTCGGCACAGCAGCTGCACTTGT

其中引物对YES2-MT2用于反向扩增载体序列带MT2同源臂，引物对MT2-yes2-F用于扩增MT2片段。引物对YES2-MT2和已有的EGFP-pGK质粒为模板扩增载体框架，以第二对引物和之前构建好的质粒为模板扩增MT2片段。扩增产物经处理后再进行无缝克隆。然后转化感受态细胞，涂布含Amp的LB平板，37℃培养，长出的单克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定的阳性克隆即为重组克隆。提取质粒备用。将质粒加到酵母感受态细胞，进行电转化，筛选阳性重组子，接种鉴定的阳性单克隆至MD培养基中，30℃培养3-5天分别取样后检测蛋白表达情况，可以进行荧光检测，将培养物上清直接置于紫外灯下，观察有荧光产生；WesternBlotting检测,有目的条带产生即转化成功，得到基因工程菌株MT22。

将菌株MT22先进行活性培养，再按5％的接种量接种到种子培养基中，于28℃好氧培养8h；然后将培养好的种子按5％的接种量接入液体发酵培养基。其中，所述种子培养基为马铃薯液体培养基，培养基pH自然。

将菌株MT22进行培养的条件是：种子培养于28～30℃好氧培养8h，培养基中加亚硒酸钠,浓度为0.05mmol/L。在摇瓶中进行，摇床转速180r/min。将发酵液离心获得MT22菌体细胞离心保留沉淀，加缓冲液，细胞破壁。离心取上清溶液，超滤离心，收集目的组分，然后进SDS-PAGE分离测定其纯化效果。将收集组分进行消解，在酸性条件下与2,3-二氨基苯进行衍生反应，通过高效液相色谱测定硒的含量。每个实验做三次平行样，取平均值。转化结束时，计算转化率，无机硒转化为硒蛋白的总效率为13％。

将获得的MT22菌体细胞，用转化培养基(马铃薯液体培养基，pH调6.5，亚硒酸钠浓度为0.1mmol/L)中悬浮，在摇瓶中(500ml摇瓶，装液量200ml)进行生物转化。摇瓶转化时菌体浓度为10％，转化液初始pH为6.5，温度为28℃，摇床转速200r/min，转化时间为24h。转化结束时，无机硒转化为硒蛋白的总效率为18％。

将获得的MT22菌体细胞，用转化培养基(马铃薯液体培养基，pH调6.5，亚硒酸钠浓度为0.2mmol/L)中悬浮，在摇瓶中(500ml摇瓶，装液量100ml)进行生物转化。摇瓶转化时菌体浓度为10％，转化液初始pH为6.5，温度为28℃，摇床转速200r/min，转化时间为24h后加入新鲜培养基100ml，再培养24h。转化结束时，无机硒转化为硒蛋白的总效率为22％。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南大学

<120> 利用外源金属硫蛋白构建酵母发酵产高含硒蛋白的方法

<130> W20191004

<141> 2019-06-27

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcagttggg gtccatggat ccgagctcgg taccaagctt a 41

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctgtgccga cgacgacaag atgggtaagg gagaagaact t 41

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtaccgagc tcggatccat ggaccccaac tgctcctgtg 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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