阅读说明：本技术 一种发酵榨油粕类制备活性多肽的方法 (Method for preparing active polypeptide by fermenting oil pressing meals ) 是由 李清玉 刘希军 于 2020-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种发酵榨油粕类制备活性多肽的方法,其包括以下的步骤：(1)配置发酵培养基;(2)接种复合菌剂5-10%,在200rpm的摇床中摇床培养30-40h；(3)8000rpm离心,20min；(4)发酵液采用10kDa,5kDa,3kDa,1kDa的卷式滤膜进行截留；(5)对5-10kDa的组分进行硫酸铵沉淀；(6)将硫酸铵沉淀采用PBS缓冲液溶解并在PBS溶液中进行透析；(7)将透析所得5-10kDa以及3-5kDa,1-3kDa的组分进行冷冻干燥即得活性多肽。本发明将豆粕等转化为高附加值的活性多肽,该活性多肽并未检出黄曲霉毒素,安全可靠,其具有促进动物生长,提高机体免疫力的功效。(The invention provides a method for preparing active polypeptide by fermenting oil cakes, which comprises the following steps: (1) inoculating 5-10% of the compound microbial inoculum, and performing shake culture in a shaker at 200rpm for 30-40 h; (3) centrifuging at 8000rpm for 20 min; (4) the fermentation liquor is intercepted by a 10kDa, 5kDa, 3kDa and 1kDa roll-up filter membrane; (5) performing ammonium sulfate precipitation on the 5-10kDa fraction; (6) dissolving the ammonium sulfate precipitate by adopting PBS buffer solution and dialyzing in the PBS solution; (7) freeze drying the 5-10kDa and 3-5kDa, 1-3kDa fractions obtained by dialysis to obtain active polypeptide. The invention converts the soybean meal and the like into the active polypeptide with high added value, the active polypeptide does not detect aflatoxin, is safe and reliable, and has the effects of promoting the growth of animals and improving the immunity of organisms.)

一种发酵榨油粕类制备活性多肽的方法

技术领域

本发明属于发酵制备活性产物领域，具体的涉及一种发酵榨油粕类制备活性多肽的方法。

背景技术

豆粕、花生粕及菜籽粕等是榨油后得到的一种副产品。因为榨油只是把油脂提取出来，而粕中含有很多蛋白质等营养物质。例如菜籽粕其粗蛋白含量应在32％以上，粗纤维含量应在12％以下。花生粕富含植物蛋白，其口感较好。因此粕类往往直接用于饲料领域。但粕类中含有的大量的营养成分不易被动物直接吸收，造成了资源的浪费，对粕类中的营养物质进一步提取利用，具有重要的意义。

利用微生物发酵的方法从粕类中制备生物活性多肽，可以提高粕类的利用价值。同时微生物发酵剩下的粕类残渣更容易被动物吸收，有些难被动物吸收利用的多糖可以被微生物降解为寡糖等活性物质，所含益生菌也可以促进动物肠道健康。

利用微生物发酵的方法从粕类中制备生物活性多肽，实现粕类的高值化利用成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明旨在解决利用微生物发酵的方法从粕类中制备生物活性多肽的问题，实现粕类的高值化利用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种发酵榨油粕类制备活性多肽的方法，其包括以下的步骤：

(1)配置发酵培养基；

(2)接种复合菌剂5-10％，在200rpm的摇床中摇床培养30-40h；

(3)8000rpm离心，20min；

(4)发酵液采用10kDa，5kDa，3kDa，1kDa的卷式滤膜进行截留；

(5)对5-10kDa的组分进行硫酸铵沉淀；

(6)将硫酸铵沉淀采用PBS缓冲液溶解并在PBS溶液中进行透析；

(7)将透析所得5-10kDa以及3-5kDa，1-3kDa的组分进行冷冻干燥即得活性多肽。

进一步，步骤(1)中，具体做法如下：取榨油粕类60-80％，淀粉20-30％，NaCl 1-5％，K2HPO4 0.2-0.4％，MnCl2 0.3-0.5％，溶解于1000mL的蒸馏水中，121℃灭菌20min。

进一步，所述述榨油粕类为花生粕：豆粕：菜籽粕＝1-1.5:1-1.5:2-3。

进一步，步骤(2)中采用的复合菌剂为绿色木霉：地衣芽孢杆菌：短小芽孢杆菌：解淀粉芽孢杆菌：双歧杆菌：魏斯氏乳杆菌＝1:1:1:4:1:2。

进一步，步骤(5)中所述硫酸铵沉淀的水饱和硫酸铵浓度为30-60％。

进一步，所述复合菌剂中活菌的个数大于108cfu/mL。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.本发明属于榨油粕类的高值化利用，将本来只能用于饲料的豆粕等转化为高附加值的活性多肽。

2.本发明所得活性多肽具有促进动物生长，提高机体免疫力的功效。

3.通过本发明处理后的活性多肽中并未检出黄曲霉毒素，安全可靠。

具体实施方式

本发明结合实施例、实验例与表格做详细的描述。

实施例1.

本发明提供一种发酵榨油粕类制备活性多肽的方法，具体包括以下步骤：

(1)配置发酵培养基：榨油粕类60-80％，淀粉20-30％，NaCl 1-5％，K2HPO4 0.2-0.4％，MnCl2 0.3-0.5％，溶解于1000mL的蒸馏水中，121℃灭菌20min；上述榨油粕类为花生粕：豆粕：菜籽粕＝20-30％:20-30％:40-60％。

(2)接种复合菌剂5-10％，在200rpm的摇床中摇床培养30-40h；(3)8000rpm离心，20min；优选地，复合菌剂为绿色木霉：地衣芽孢杆菌：短小芽孢杆菌：解淀粉芽孢杆菌：双歧杆菌：魏斯氏乳杆菌＝1:1:1:4:1:2。上述复合菌剂中活菌的个数大于108cfu/mL。

(4)发酵液采用10kDa，5kDa，3kDa，1kDa的卷式滤膜进行截留，获得1-3kDa，3-5kDa，5-10kDa的组分；

(5)对5-10kDa的组分进行硫酸铵沉淀，将5-10kDa的组分置于0℃的冰浴中，向其中逐渐加入硫酸铵固体粉末，然后使硫酸铵的水饱和浓度达到30-40％，在4℃静置过夜，离心，弃沉淀，取上清向其中逐渐加入硫酸铵固体粉末，然后使硫酸铵的水饱和浓度达到50-60％，然后在4℃静置过夜，离心，收集沉淀，用PBS缓冲液溶解沉淀；

(6)将步骤(5)所得溶解后的沉淀在PBS溶液中进行透析，每隔2、4、6、8h换一次透析液；

(7)将透析所得5-10kDa以及3-5kDa，1-3kDa的组分进行冷冻干燥即得活性多肽。

实施例2

本实施例在实施例1的基础上作为一种优选的实施方式，具体包括以下步骤：

(1)配置发酵培养基：榨油粕类60％，淀粉20％，NaCl 1％，K2HPO40.2％，MnCl20.3％，溶解于1000mL的蒸馏水中，121℃灭菌20min；上述榨油粕类为花生粕：豆粕：菜籽粕＝20％:20％:60％。

(2)接种复合菌剂5％，在200rpm的摇床中摇床培养30h；复合菌剂为绿色木霉：地衣芽孢杆菌：短小芽孢杆菌：解淀粉芽孢杆菌：双歧杆菌：魏斯氏乳杆菌＝1:1:1:4:1:2。上述复合菌剂中活菌的个数大于108cfu/mL。

(3)8000rpm离心，20min；

(4)发酵液采用10kDa，5kDa，3kDa，1kDa的卷式滤膜进行截留，获得1-3kDa，3-5kDa，5-10kDa的组分；

(5)对5-10kDa的组分进行硫酸铵沉淀，将5-10kDa的组分置于0℃的冰浴中，向其中逐渐加入硫酸铵固体粉末，然后使硫酸铵的水饱和浓度达到30％，在4℃静置过夜，离心，弃沉淀，取上清向其中逐渐加入硫酸铵固体粉末，然后使硫酸铵的水饱和浓度达到50％，然后在4℃静置过夜，离心，收集沉淀，用PBS缓冲液溶解沉淀；

(6)将步骤(5)所得溶解后的沉淀在PBS溶液中进行透析，每隔2、4、6、8h换一次透析液；

(7)将透析所得5-10kDa以及3-5kDa，1-3kDa的组分进行冷冻干燥即得活性多肽。

实施例3

本实施例在实施例1-2的基础上作为一种优选的实施方式，具体包括以下步骤：

(1)配置发酵培养基：榨油粕类80％，淀粉30％，NaCl 5％，K2HPO40.4％，MnCl20.5％，溶解于1000mL的蒸馏水中，121℃灭菌20min；上述榨油粕类为花生粕：豆粕：菜籽粕＝30％:30％:40％。

(2)接种复合菌剂10％，在200rpm的摇床中摇床培养30-40h；复合菌剂为绿色木霉：地衣芽孢杆菌：短小芽孢杆菌：解淀粉芽孢杆菌：双歧杆菌：魏斯氏乳杆菌＝1:1:1:4:1:2。上述复合菌剂中活菌的个数大于108cfu/mL。

(3)8000rpm离心，20min；

(4)发酵液采用10kDa，5kDa，3kDa，1kDa的卷式滤膜进行截留，获得1-3kDa，3-5kDa，5-10kDa的组分；

(5)对5-10kDa的组分进行硫酸铵沉淀，将5-10kDa的组分置于0℃的冰浴中，向其中逐渐加入硫酸铵固体粉末，然后使硫酸铵的水饱和浓度达到40％，在4℃静置过夜，离心，弃沉淀，取上清向其中逐渐加入硫酸铵固体粉末，然后使硫酸铵的水饱和浓度达到60％，然后在4℃静置过夜，离心，收集沉淀，用PBS缓冲液溶解沉淀；

(6)将步骤(5)所得溶解后的沉淀在PBS溶液中进行透析，每隔2、4、6、8h换一次透析液；

(7)将透析所得5-10kDa以及3-5kDa，1-3kDa的组分进行冷冻干燥即得活性多肽。

实施例4

本实施例在实施例1-3的基础上作为一种优选的实施方式，具体包括以下步骤：

(1)配置发酵培养基：榨油粕类70％，淀粉25％，NaCl 3％，K2HPO40.3％，MnCl20.4％，溶解于1000mL的蒸馏水中，121℃灭菌20min；上述榨油粕类为花生粕：豆粕：菜籽粕＝25％:25％:50％。

(2)接种复合菌剂7％，在200rpm的摇床中摇床培养35h；复合菌剂为绿色木霉：地衣芽孢杆菌：短小芽孢杆菌：解淀粉芽孢杆菌：双歧杆菌：魏斯氏乳杆菌＝1:1:1:4:1:2。上述复合菌剂中活菌的个数大于108cfu/mL。

(3)8000rpm离心，20min；

(4)发酵液采用10kDa，5kDa，3kDa，1kDa的卷式滤膜进行截留，获得1-3kDa，3-5kDa，5-10kDa的组分；

(5)对5-10kDa的组分进行硫酸铵沉淀，将5-10kDa的组分置于0℃的冰浴中，向其中逐渐加入硫酸铵固体粉末，然后使硫酸铵的水饱和浓度达到35％，在4℃静置过夜，离心，弃沉淀，取上清向其中逐渐加入硫酸铵固体粉末，然后使硫酸铵的水饱和浓度达到55％，然后在4℃静置过夜，离心，收集沉淀，用PBS缓冲液溶解沉淀；

(6)将步骤(5)所得溶解后的沉淀在PBS溶液中进行透析，每隔2、4、6、8h换一次透析液；

(7)将透析所得5-10kDa以及3-5kDa，1-3kDa的组分进行冷冻干燥即得活性多肽。

实验例

1.试验选择罗非鱼。随机分为4组，即对照组(A组)、B组、C组及D组。A组饲喂基础日粮，实验B、C、D组分别在基础日粮中添加0.5g/kg的5-10kDa以及3-5kDa，1-3kDa的蛋白组分。日投饲量为鱼体质量2-3％。每天定时投喂2次。每2周称量1次，并根据罗非鱼体重调整投饲量。

2.样品采集与指标测定

饲养罗非鱼每2周称量1次。计算其生长性能指标与饲料系数。

存活率/％＝终末尾数/始尾数*100；

特定生长率/％＝(末重-初重)/(初重*饲喂天数)*100；

饲料转换系数＝摄食饲料总量/(末重-初重)。

试验结束时采集鱼血，离心制备血清，低温冷冻保存。用考马斯亮兰染色法测定血清总蛋白含量；用溴绿甲酚比色法测定血清白蛋白含量；球蛋白含量为总蛋白量减去白蛋白量；超氧化物歧化酶(SOD)活力用试剂盒测定；溶菌酶活力用溶菌酶检测试剂盒测定。

表1本发明的活性多肽对罗非鱼终末体重、特定生长率、存活率、饲料转化系数的影响

从表1可以看出，三种活性多肽对罗非鱼的生长都有促进作用，存活率也比对照组较高，在三种活性多肽中，小组分即1-3kDa组分对罗非鱼的促进作用最好，饲料转化系数也最低。

表2本发明的活性多肽对罗非鱼血清蛋白含量的影响

由表2可以知道本发明的活性多肽可以提高罗非鱼白蛋白、球蛋白和总蛋白的含量。血清球蛋白是一种重要的免疫蛋白，本发明的活性多肽可以提高罗非鱼体内蛋白的含量，进而提高罗非鱼的免疫力。

表3活性多肽对溶菌酶含量、总SOD活力的影响

由表3可以得出，与对照组相比三种活性多肽饲养的罗非鱼溶菌酶的含量都有显著的提升，总SOD的酶活力也比对照组有显著的增加，溶菌酶是吞噬细胞杀菌的物质基础，是构成鱼类非特异性免疫最重要的组成部分。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，是生物体内清除自由基的首要物质，本发明的活性多肽可以提高罗非鱼体内溶菌酶的含量，提高SOD酶的酶活力，进而提高罗非鱼的免疫力。

本发明所得三种活性多肽，其中1-3kDa组分的活性最好，可以明显的促进罗非鱼的生长，降低饲料转化系数，同时提高罗非鱼的免疫力。