阅读说明：本技术 一种促进子宫内膜修复的干细胞复合蛋白制剂的制备方法 (Preparation method of stem cell composite protein preparation for promoting endometrial repair ) 是由 胡储涵 于 2020-05-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种促进子宫内膜修复的干细胞复合蛋白制剂的制备方法。本发明的制备方法步骤如下：1)人脐带间充质干细胞的原代提取和培养；2)人脐带间充质干细胞特异性诱导培养；3)干细胞特异性蛋白复合物上清的制备和浓缩；4)干细胞浓缩因子的冻干；5)壳聚糖温敏凝胶的制备。本发明具有取材便利、细胞得率高、生产过程易控制及生产成本低的优点。(The invention relates to a preparation method of a stem cell complex protein preparation for promoting endometrial repair. The preparation method comprises the following steps: 1) primary extraction and culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells; 2) specific induction culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells; 3) preparing and concentrating a supernatant of the stem cell specific protein complex; 4) freeze-drying the stem cell concentration factor; 5) preparing the chitosan temperature-sensitive gel. The invention has the advantages of convenient material taking, high cell yield, easy control of the production process and low production cost.)

一种促进子宫内膜修复的干细胞复合蛋白制剂的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种促进子宫内膜修复的干细胞复合蛋白制剂的制备方法。

背景技术

子宫内膜是覆盖在子宫壁内层的一层黏膜，分为功能层和基底层，是一个高度可再生的组织，在月经周期中进行动态周期性的生长、分化、脱落和再生。因此，当由于各种因素造成基底层损伤，会导致子宫上皮、间质细胞再生障碍，新生血管形成受损，最终子宫内膜难以实现自我修复。例如频繁的宫腔操作史、感染及部分药物的使用，子宫内膜损伤的发生逐渐增多时，子宫内膜将失去增生和修复的能力，子宫前后壁之间可出现病理性修复，导致纤维瘢痕和粘连的形成，临床上可表现为月经减少、闭经、不孕、习惯性流产、早产和胎盘异常等。由于子宫环境和功能的复杂性限制了有效治疗的可能性。因此，妇科迫切需要探索新的治疗方法，以修复子宫内膜损伤，改善微环境和耐受状态。总结目前的治疗策略，重点在早期干预减少瘢痕形成、促进已损伤内膜的修复再生，从而实现子宫内膜结构和功能的恢复。

干细胞具有独特的生物学特性，在再生医学治疗领域具有极大的应用前景。基于各种动物实验模型及临床实验的研究，学者们发现干细胞在子宫内膜损伤修复方面具有重要作用，可能机制主要有：1.干细胞具有分化为子宫内膜细胞或血管细胞的能力，可补充缺失的子宫内膜，并通过加速损伤区域新生血管的形成促进组织的修复过程；2.干细胞具有强大的旁分泌功能，可分泌血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胎盘生长因子(PIGF)、血小板衍生因子(PDGF)等不同类型的细胞因子，可促进损伤细胞的恢复，抑制炎症及调节免疫应答的能力。近年来随着临床和基础研究的深入，干细胞旁分泌机制在子宫内膜修复方面的作用可能更大。因此，如何利用干细胞分泌的各种生物活性因子如可溶性蛋白质、游离核酸、脂类和细胞外囊泡(微粒、外泌体等)进行细胞间通讯，改善组织微环境，促进子宫内膜修复和再生，已成为目前研究的热点领域。

经过文献检索和调研，专利CN201910692005.8及CN201910925566.8，该两项发明均通过从人子宫内膜组织中分离得到子宫内膜干细胞后将其培养上清浓缩、冻干，和溶媒混合最终得到人子宫内膜干细胞复合修复因子/制剂。但以上发明所用种子细胞为子宫内膜干细胞，该细胞取材存在一定难度，产业化具有限制性，并且最终制备的复合修复因子为液体形式，产品在应用过程中的有效利用度较差。除此之外，目前现有和子宫内膜修复相关的干细胞因子制品并没有特异性诱导干细胞产生刺激子宫内膜损伤修复的旁分泌组，所获得的干细胞因子制品在疗效具有一定限制性。

因此，针对目前已有技术的缺陷，需要进一步改良和提升制备工艺，开发适合规模性产业化及患者临床应用的促进子宫内膜修复的干细胞复合蛋白制剂的制备方法。

发明内容

为解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种促进子宫内膜修复的干细胞复合蛋白制剂的制备方法,具有取材便利、细胞得率高、生产过程易控制及生产成本低的优点。

本发明的技术解决方案是：本发明为一种促进子宫内膜修复的干细胞复合蛋白制剂的制备方法，其特殊之处在于：该方法包括以下步骤：

1)人脐带间充质干细胞的原代提取和培养：

1.1)人脐带间充质干细胞的提取：脐带组织取自足月健康新生儿，组织消毒后，剥离华通氏胶并剪切成0.5cm³大小的组织块，离心清洗，加入培养基中并在37℃、5％CO2的培养箱中常规培养,每隔3d更换培养基，约12～14d后去除脐带组织，贴壁细胞培养；

1.2)细胞融合度到达一定程度时使用0.25％胰酶-EDTA消化细胞并传代；

2)人脐带间充质干细胞特异性诱导培养：

取适合代次细胞，细胞培养至一定融合度时，弃去原培养基，无菌生理盐水清洗3遍，更换为含铁离子螯合剂去铁胺(DFO)的无血清培养基进行预处理培养，培养后收集培养上清液；

3)干细胞特异性蛋白复合物上清的制备和浓缩：

3.1)将收集的培养上清离心以去除细胞碎片；

3.2)用滤膜进行首次超滤，随后更换滤膜对滤过液进行浓缩，获得首道浓缩液。

3.3)将首道浓缩液用无菌生理盐水清洗两次并用滤膜再次超滤，目的是为了从浓缩液中完全移除铁离子螯合剂去铁胺，最终获得的浓缩液即为干细胞浓缩因子，将其置于-80℃保存；

4)干细胞浓缩因子的冻干：

将获得的干细胞浓缩因子进行蛋白浓度测定，根据测定结果调节各赋性剂比例(质量比)；无菌注射用水调整干细胞浓缩因子浓度，0.22um滤膜过滤后以2ml/支分装冻干。冻干后即可得到浓度为0.2mg/支的干细胞浓缩因子冻干粉；

5)壳聚糖温敏凝胶的制备：

5.1)壳聚糖制备：取医用级壳聚糖粉末,加入乙酸中，磁力搅拌器搅拌后溶液4℃放置保存；

5.2)β-甘油磷酸钠(Beta-glycerol phosphate,β-GP)配置：取β-GP溶解于无菌注射用水中，震荡搅拌后0.22μm滤器过滤，配置好溶液4℃放置保存；

5.3)壳聚糖温敏凝胶制备：将配置好的壳聚糖和β-GP从4℃环境取出，于冰上β-GP溶液逐步滴加至壳聚糖溶液，持续搅拌后即得到壳聚糖温敏凝胶，以3ml/瓶分装至西林瓶中，置于4℃保存。

优选的，步骤1.1)中，离心条件为室温，200g-450g转速条件下离心4-7min,离心清洗后所加入培养基为含体积分数10％胎牛血清的DF-12培养基。

优选的，步骤1.2)中，细胞融合度到达70-80％时进行细胞消化。

优选的，步骤2)中，适合代次的细胞为P3-P6代；铁离子螯合剂去铁胺(DFO)的浓度为100μM-200，更换的无血清培养基为MSCXeno-FreeSFM(Corning Cat.No 88-600-CV),培养48h后收集培养上清液。

优选的，步骤3.1)中，收集上清离心条件为4℃，300g-500g，5min-15min。

优选的，步骤3.2)中，首次超滤截留分子量为50KD，首次浓缩时截留分子量为3KD，浓缩倍数为10倍(v/v)。

优选的，步骤3.3)中，首道浓缩液二次超滤的截留分子量为3KD。

优选的，步骤4)中，各赋性剂比例(质量比)为：甘露醇1％-8％，右旋糖酐0.5-5％，海藻糖0.5-2％，冻干条件为：温度-30℃～-80℃，真空度30Pa，时间24～72h。

优选的，步骤5.1)中，医用级壳聚糖质量为150g-250g；乙酸的使用条件为：体积7ml-10ml，浓度O.1M，PH4.0。

优选的，步骤5)中，壳聚糖溶解条件为：8-20min内将壳聚糖粉末逐步添加到溶剂中，室温下连续磁力搅拌1.5h-2.5h以使其完全溶解；β-甘油磷酸钠溶解条件为：质量0.5g-0.85gβ-GP溶解于1ml-2ml无菌注射用水中，震荡搅拌4min-8min；壳聚糖温敏凝胶的配置比例和条件为：1ml的β-GP溶液逐步滴加至9ml壳聚糖溶液，持续搅拌5min-15min。

本发明制备的细胞复合蛋白制剂主要包括两部分：干细胞浓缩因子冻干粉以及壳聚糖温敏凝胶。通过提取脐带间充质干细胞并经过特异性诱导培养，使其大量分泌具有促进血管形成、细胞修复及免疫调节功能的细胞因子，并通过浓缩和冻干等步骤，得到干细胞浓缩因子。同时制备无菌的壳聚糖温敏凝胶，将干细胞浓缩因子均匀混合至壳聚糖温敏凝胶中即可得到干细胞复合蛋白制剂，使其可应用于子宫内膜修复的治疗中。因此，与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明选择以脐带间充质干细胞作为种子细胞产出干细胞浓缩液的原料，脐带间充质干细胞主要是取材于脐带，具有取材方便，易于采集和运输，生物学特性稳定，免疫原性低，无异体排斥反应，避免了伦理争议，细胞数量多等优点。和子宫内膜干细胞相比，脐带间充质干细胞取材更为便利，一次取材即可获得大量种子细胞，且子宫内膜干细胞多从女性经血中提取获得，取材、运输和培养过程中污染风险大，不利生产过程控制和成本控制。因此，脐带间充质干细胞作为种子细胞具有取材便利、细胞得率高、生产过程易控制及生产成本低等优点。

2、干细胞旁分泌组在应用中的一个主要问题是，在大多数情况下，细胞因子和生长因子的浓度太低而无法用于治疗。根据子宫内膜损伤修复机制，本发明通过铁离子螯合剂去铁胺(DFO)对人脐带间充质干细胞进行特异性诱导培养，目的是为了一方面特异性增强干细胞在和血管形成有关的因子分泌能力，另一方面特异性增强干细胞分泌抗炎活性的细胞因子的能力，继而改善子宫内膜微环境和微循环，增强子宫内膜的自我修复和抵御能力。这样做的经济益处为，产生大量靶向性生产干细胞分泌组，可减少生产成本，最终降低患者的治疗成本。铁离子螯合剂去铁胺(DFO)在本发明中主要起到缺氧模拟剂的作用，与其他处理刺激物(如氯化钴)相比，DFO的临床安全性高，已在临床应用三十余年；其次DFO在生产中可通过浓度来对预处理进行精细调节；最后，DFO的分子量小，可通过洗涤和浓缩去除，对最终产物的成分和疗效无影响。

3、为了从最终产品中去除DFO，本发明通过二次洗涤和截留分子量为3KD的超滤膜二次超滤，将小分子DFO去除，保证最终品的纯度和效果。

4、本发明干细胞复合蛋白制剂所使用的溶媒为温敏凝胶，这样做的益处是使用便利，和冻干粉混匀后直接导入女性外生殖道中，凝胶即可充盈，同时随着干细胞浓缩因子在温敏凝胶中缓慢释放，又促进了各种抗炎因子、细胞因子等对子宫内膜细胞的修复和免疫调节。

附图说明

图1分别为人脐带间充质干细胞P2代、成脂诱导21d后染色以及成骨诱导21d后染色的镜下图；

图2为人脐带间充质干细胞CD34、CD105、CD73、CD90表达情况；

图3为DFO特异性诱导后脐带间充质干细胞VEGF-α、ANG1及IL4的mRNA表达情况；

图4为干细胞浓缩因子中VEGF-α及IL4的蛋白含量情况。

具体实施方式

本发明具体实施例的步骤如下：

1)人脐带间充质干细胞的原代提取和培养：

1.1)人脐带间充质干细胞的提取：脐带组织取自足月健康新生儿，组织消毒后，剥离华通氏胶并剪切成0.5cm3大小的组织块，在室温，200g-450g转速条件下离心4-7min清洗，于含体积分数10％胎牛血清的DF-12培养基中，在37℃、5％CO2的培养箱中常规培养。每隔3d更换培养基，约12～14d后去除脐带组织，贴壁细胞培养；

1.2)细胞融合度到达70-80％时使用0.25％胰酶-EDTA消化细胞并传代。

人脐带间充质干细胞分化能力检测：

取P3代细胞，常规消化后按照2×10⁴/孔密度接种于24孔板，细胞融合至70％密度时，更换培养基为成脂或成骨诱导培养基，每3d换液1次，21d后通过Von Kossa染色检测成骨情况，油红O检测成脂情况。

实验结果：参见图1，通过人脐带间充质干细胞P2代、成脂诱导21d后染色以及成骨诱导21d后染色的镜下图，可观察到P2代细胞呈梭形或多角形，胞体形态均一；成脂诱导21d后，细胞出现大量脂滴结构，在油红O作用下可被染成红色，镜下可见胞浆中充满红色油滴结构；成骨诱导21d时，细胞呈现多层结节结构，经Von Kossa染色可见黑色钙质沉积。说明所得细胞具有成脂分化和成骨分化的能力，具有间充质干细胞的分化潜能。

人脐带间充质干细胞表面标记物检测：

取P3代细胞，常规消化后，按照每个样本2×105细胞分管，经CD34、CD105、CD73、CD90抗体标记后，PBS重悬至400ul，流式细胞仪检测。

实验结果：参见图2，人脐带间充质干细胞CD34、CD105、CD73、CD90表达情况，经检测可见，所得细胞CD105、CD73、CD90表达为阳性，CD34表达为阴性，表明所分离细胞具有典型间充质干细胞表型。

2)人脐带间充质干细胞特异性诱导培养：

取P3-P6代细胞，细胞培养至50％-70％融合度时，弃去原培养基，无菌生理盐水清洗3遍，更换为含浓度100μM-200μM铁离子螯合剂去铁胺(DFO)的无血清培养基MSC Xeno-Free SFM(Corning Cat.No 88-600-CV)进行预处理培养，培养48h后收集培养上清液。

DFO特异性诱导后脐带间充质干细胞VEGF-α、ANG1及IL4的mRNA表达水平检测，采用实时定量PCR法分别检测经DFO特异性诱导后细胞VEGF-α、ANG1及IL4的mRNA表达。

实验结果：参见图3，DFO特异性诱导后脐带间充质干细胞VEGF-α、ANG1及IL4的mRNA表达情况。结果表明通过DFO的特异性诱导预处理，细胞VEGF-α、ANG1及IL4的mRNA水平显著增加。DFO处理可增加促血管生成因子VEGF-α、ANG1以及抗炎因子IL4的表达和分泌。

3)干细胞特异性蛋白复合物上清的制备和浓缩：

3.1)将收集的培养上清以4℃，300g-500g，5min-15min离心条件离心以去除细胞碎片；

3.2)用截留分子量为50KD的滤膜进行首次超滤，随后更换截留分子量为3KD的滤膜对滤过液进行浓缩，浓缩倍数为10倍(v/v)，获得首道浓缩液；

3.3)将首道浓缩液用无菌生理盐水清洗两次并用截留分子量为3KD的滤膜二次超滤，目的是为了从浓缩液中完全移除铁离子螯合剂去铁胺，最终获得的浓缩液即为干细胞浓缩因子，将其置于-80℃保存。

干细胞浓缩因子中VEGF-α及IL4的蛋白含量检测：

将干细胞浓缩因子使用人VEGF-αELISA试剂盒和人IL4ELISA试剂盒测量间充质干细胞分泌组中VEGF-α及IL4的蛋白含量水平，具体操作参照说明书进行。

实验结果：参见图4，干细胞浓缩因子中VEGF-α及IL4的蛋白含量情况。结果表明通过DFO的特异性诱导预处理，干细胞浓缩因子中的VEGF-α及IL4的蛋白含量分别为81.35±10.73ng/ml和1.98±0.35pg/ml，和未经过DFO预处理组相比显著增加。说明经过DFO预处理后可刺激获得的干细胞浓缩因子中，促血管生成因子VEGF-α以及抗炎因子IL4蛋白含量增加。

干细胞浓缩因子的冻干和理化性质、微生物检测：

4)将获得的干细胞浓缩因子进行蛋白浓度测定，根据测定结果调节赋性剂比例(质量比)。各个赋形剂比例为：甘露醇1％-8％，右旋糖酐0.5-5％，海藻糖0.5-2％。无菌注射用水调整干细胞浓缩因子浓度为0.1mg/ml，0.22um滤膜过滤后以2ml/支分装冻干，其中冻干条件为：温度-30℃-80℃，真空度30Pa，时间24～72h。冻干后即可得到浓度为0.2mg/支的干细胞浓缩因子冻干粉。将所得冻干粉进行外观、复溶性、含水量、PH、蛋白浓度、微生物及内毒素等项目检测。

实验结果：冻干粉为表面光滑的白色疏松粉末。表1为对冻干粉进行的理化性质和微生物检测结果。

表1冻干粉实验结果

5)壳聚糖温敏凝胶的制备：

5.1)壳聚糖制备：取150g-250g医用级壳聚糖粉末,加入9ml浓度O.1M，PH4.0的乙酸中，磁力搅拌器搅拌1.5h-2.5h，配置好溶液4℃放置保存；在8-20min内将壳聚糖粉末逐步添加到溶剂中，以防止粉末结块，室温下连续磁力搅拌1.5h-2.5h以使其完全溶解；

5.2)β-甘油磷酸钠(Beta-glycerol phosphate,β-GP)配置：取0.5g-0.85gβ-GP溶解于1ml-2ml无菌注射用水中，震荡搅拌4min-8min，通过0.22μm滤器过滤，配置好溶液4℃放置保存；

5.3)壳聚糖温敏凝胶制备：将配置好的壳聚糖和β-GP从4℃环境取出，于冰上将1ml的β-GP溶液逐步滴加至9ml壳聚糖溶液，持续搅拌5min-15min，即得到壳聚糖温敏凝胶，以3ml/瓶分装至西林瓶中，置于4℃保存。

以上，仅为本发明公开的具体实施方式，但本发明公开的保护范围并不局限于此，本发明公开的保护范围应以权利要求的保护范围为准。