阅读说明：本技术 一种治疗过敏性鼻炎的细胞制剂 (cell preparation for treating allergic rhinitis ) 是由 常智杰 付艳霞 王银银 任芳丽 于 2018-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种治疗过敏性鼻炎的细胞制剂。本发明首先保护间充质干细胞在制备用于治疗过敏性鼻炎的药物中的应用。本发明还保护一种细胞制剂的制备方法,包括如下步骤：以脐带沃顿区组织块为原料,制备脐带间充质干细胞,得到细胞制剂,制备过程中采用低血清培养基。本发明还保护所述细胞制剂在制备用于治疗过敏性鼻炎的药物中的应用。本发明提供的细胞制剂,适用于过敏性鼻炎的细胞治疗。本发明对于过敏性鼻炎的治疗具有重大的应用价值。(The invention discloses cell preparations for treating allergic rhinitis, which firstly protect the application of mesenchymal stem cells in preparing a medicament for treating the allergic rhinitis and also protect a preparation method of cell preparations.)

一种治疗过敏性鼻炎的细胞制剂

技术领域

本发明涉及一种治疗过敏性鼻炎的细胞制剂，其为一种人脐带沃顿区间充质干细胞制剂，本发明还涉及其制备方法和应用。

背景技术

过敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR),又称变应性鼻炎,是常见的耳鼻咽喉科疾病,也是常见的呼吸道变应性疾病。该病是发生于鼻粘膜的变应性疾病,以鼻痒、喷嚏、鼻溢清涕、鼻粘膜肿胀为主要特点。过敏性鼻炎的患病率在10％-40％,其中花粉过敏症多见于欧洲和北美,常年性的过敏性鼻炎多见于亚洲。虽然过敏性鼻炎并不致死,但由于患者的鼻子和全身不适感很明显,影响患者的学习和工作。如果得不到正确的治疗,约30％的患者会发展为支气管哮喘,甚至肺心病等严重影响患者身体健康和生活质量的疾病。皮质类固醇和抗组胺药是目前治疗过敏性鼻炎的一线药物。

引起AR发病的因素很多。①接触过敏原：AR是发生在鼻腔中IgE介导的过敏性炎症反应,是在过敏性体质个体中，由过敏原引起的生化物质和细胞级联反应,其发生归因于浸润的炎症细胞和正常细胞的相互作用。②家族遗传性；据报道,AR患者大多为特异性过敏体质，有家族其它过敏病史的过敏性鼻炎患者约占60％，父母双方若都患有AR其后代子女发生本病的几率为75％-100％。③与哮喘相关；AR与哮喘均属于在不同部位发生的呼吸道慢性***反应性疾病,如果得不到有效治疗，40％的过敏性鼻炎病人会发展为哮喘。

过敏性鼻炎是在体外环境因素作用由IgE介导的,以鼻腔黏膜的免疫反应为主的变应性炎症反应。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗过敏性鼻炎的细胞制剂。

本发明首先保护间充质干细胞在制备用于治疗过敏性鼻炎的药物中的应用。

所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。所述脐带间充质干细胞是以脐带沃顿区组织块为原料制备得到的脐带间充质干细胞。以脐带沃顿区组织块为原料制备脐带间充质干细胞的过程中采用低血清培养基。所述脐带为离体脐带。所述脐带间充质干细胞可为原代脐带间充质干细胞也可为传代后的脐带间充质干细胞。传代后的脐带间充质干细胞可为传代20代以内的脐带间充质干细胞，具体为传代10代以内的脐带间充质干细胞，更具体为传代3-5代的脐带间充质干细胞。

本发明还保护一种细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：以脐带沃顿区组织块为原料，制备脐带间充质干细胞，得到细胞制剂，制备过程中采用低血清培养基。

脐带间充质干细胞可为原代脐带间充质干细胞也可为传代后的脐带间充质干细胞。

原代脐带间充质干细胞的制备方法依次包括如下步骤：

(1)采用低血清培养基培养脐带沃顿区组织块，直至有细胞爬出；

(2)采用低血清培养基培养细胞；

(3)收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为原代脐带间充质细胞。

传代后的脐带间充质干细胞可为传代20代以内的脐带间充质干细胞，具体为传代10代以内的脐带间充质干细胞，更具体为传代3-5代的脐带间充质干细胞。

传代方法具体可为：将脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养细胞，收集细胞，胰酶消化，收集细胞。

本发明还保护一种细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用低血清培养基培养离体的脐带沃顿区组织块7-10天；

(2)完成步骤(1)后，弃除组织块，采用低血清培养基培养细胞至80％汇合度；

(3)完成步骤(2)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P0代脐带间充质细胞；

(4)将P0代脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养至80％汇合度；

(5)完成步骤(4)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P1代脐带间充质细胞；

(6)将P1代脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养至80％汇合度；

(7)完成步骤(6)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P2代脐带间充质细胞；

(8)将P2代脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养至80％汇合度；

(9)完成步骤(8)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为细胞制剂。

以上任一所述方法制备得到的细胞制剂也属于本发明的保护范围。

以上任一所述细胞制剂为CD126阳性的细胞制剂，CD126的阳性率在95％以上，优选为99％以上。以上任一所述细胞制剂为CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在90％以上的细胞制剂，CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率优选在95％以上，进一步优选在99％以上。以上任一所述细胞制剂的CD31和CD34的阳性率菌低于10％，优选低于7％。以上任一所述细胞制剂的CD45和HLA-DR阳性率均低于5％，优选低于3％，进一步优选低于1％。CD29、CD44、CD90和CD105均为鉴定间充质干细胞常用的表面标志物，CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率高说明细胞制剂是间充质干细胞且其纯度很高。CD31是内皮祖细胞的标志物、CD45是白细胞的标志物和CD34造血干细胞的标志物，CD31、CD45以及CD34的三个指标的阳性率低，说明细胞制剂纯度很高。HLA-DR是移植排斥相关的标志物，HLA-DR阳性率低说明细胞制剂应用时不容易发生移植排斥。

本发明还保护所述细胞制剂在制备用于治疗过敏性鼻炎的药物中的应用。

本发明还保护一种用于治疗过敏性鼻炎的药物，其活性成分为间充质细胞。

所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。所述脐带间充质干细胞是以脐带沃顿区组织块为原料制备得到的脐带间充质干细胞。以脐带沃顿区组织块为原料制备脐带间充质干细胞的过程中采用低血清培养基。所述脐带为离体脐带。所述脐带间充质干细胞可为原代脐带间充质干细胞也可为传代后的脐带间充质干细胞。传代后的脐带间充质干细胞可为传代20代以内的脐带间充质干细胞，具体为传代10代以内的脐带间充质干细胞，更具体为传代3-5代的脐带间充质干细胞。

本发明还保护一种用于治疗过敏性鼻炎的药物，其活性成分为所述细胞制剂。

以上任一所述低血清培养基为含3-5％(体积比)血清的细胞培养基。

以上任一所述低血清培养基的组成如下：人上皮生长因子10ng/ml、人碱性成纤维生长因子10ng/ml、重组人***5μg/ml、血小板衍生因子10ng/ml、肝素5μg/ml、氢化可的松1μg/ml、抗坏血酸10μg/ml、非必需氨基酸溶液1％(体积百分比)、L-谷氨酰胺2mmol/L、胎牛血清3-5％(体积百分比)、青霉素50U/ml、链霉素50μg/ml，余量为DMEM高糖培养基。胎牛血清的浓度具体可为4％(体积百分比)。

非必需氨基酸溶液中含有Glycine 10.0mM、L-Alanine 10.0mM、L-Asparagine10.0mM、L-Aspartic acid 10.0mM、L-Glutamic Acid 10.0mM、L-Proline 10.0mM、L-Serine 10.0mM。

本发明中采用了低血清培养基来进行培养。在间充质干细胞培养方面，通常使用10％(体积百分数)的胎牛血清，有的血清浓度高达20％(体积百分数)。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、碳水化合物、生长因子、激素等。血清成分复杂，每批血清之间都有差别，不能保证其成分一致。另外，虽然血清内含有很多利于细胞生长的成分，但不可避免的含有一些对细胞有伤害的成分，如补体、抗体、内毒素等。因此，高浓度血清培养出的细胞不适合于临床应用，会增加了临床过敏的风险。本发明的发明人发现，3-5％低血清培养基对于细胞生长、增殖、形态及功能无不良影响。

免疫治疗常用的间充质细胞包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、脐带血间充质干细胞等。与常用的骨髓间充质干细胞(MSCs)相比，脐带沃顿区间充质干细胞具有来源丰富、对供体无影响、易于采集和运输、致癌性可能性小、病毒污染概率低、免疫源性弱、无社会、伦理和法律方面争议等诸多优点。更重要的是从脐带沃顿区分离的间充质干细胞含量高、增殖能力高于骨髓MSCs，免疫原性低于骨髓MSCs。

细胞治疗是通过直接影响患者的免疫系统,从细胞和体液免疫的角度,调节患者的免疫平衡,从而达到控制过敏症状的目的。本发明提供的细胞制剂，适用于过敏性鼻炎的细胞治疗。本发明对于过敏性鼻炎的治疗具有重大的应用价值。

附图说明

图1为间充质干细胞的标志物(CD29、CD44、CD90、CD105和CD126)的结果。

图2为造血干细胞及内皮细胞标志物(CD31、CD45和CD34)的结果。

图3为移植排斥相关的标志物(HLA-DR)的结果。

图4为表型观察的结果。

图5为鼻黏膜病理检测的结果。

图6为IFN-γ、IL-4、IL-17和TNF-α的检测结果。

图7为IgE和组胺的检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

低血清培养基：人上皮生长因子10ng/ml、人碱性成纤维生长因子10ng/ml、重组人***5μg/ml、血小板衍生因子10ng/ml、肝素5μg/ml、氢化可的松1μg/ml、抗坏血酸10μg/ml、非必需氨基酸溶液1％(体积百分比)、L-谷氨酰胺2mmol/L、胎牛血清4％(体积百分比)、青霉素50U/ml、链霉素50μg/ml，余量为DMEM高糖培养基。

人上皮生长因子(hEGF)：GenScript公司，产品全称为EGF Recombinant HumanProtein，货号为Z00333。

人碱性成纤维生长因子(b-FGF)：GenScript公司，货号为Z03116。

重组人***(IGF)：GenScript公司，货号为Z03017。

血小板衍生因子(PDGF)：GenScript公司，货号为Z02529。

卵蛋白：Sigma，货号为S7951。

肝素：迈晨公司。氢化可的松：迈晨公司。抗坏血酸：迈晨公司。青霉素：GIBCO公司。链霉素：GIBCO公司。

非必需氨基酸溶液为Gibco^TMMEM Non-Essential Amino Acids Solution,(100X)，货号为11140050。网址https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/technical-resources/media-formulation.165.html。该产品中具有七种氨基酸，组成如下：Glycine10.0mM、L-Alanine 10.0mM、L-Asparagine 10.0mM、L-Aspartic acid 10.0mM、L-GlutamicAcid 10.0mM、L-Proline 10.0mM、L-Serine 10.0mM。

SD大鼠：北京维通利华有限公司。

实施例1、脐带沃顿区间充质干细胞制剂的制备

一、胎儿脐带的获取

取足月、无先天性疾病的新生儿的离体脐带；该产妇无肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病，产妇及家属对脐带用于试验研究均知情同意。

二、脐带沃顿区间充质细胞的获取

1、在无菌实验台内，将脐带用生理盐水反复冲洗，洗去残余血液。用无菌手术器械将脐带剪成2-3cm的小段，将脐带纵向剖开，去除脐动脉、脐静脉和羊膜，取沃顿区，剪成0.5-1mm³左右的小块。

2、采用组织块培养法获取原代脐带间充质细胞。

具体步骤如下：

(1)将步骤1得到的沃顿区组织块均匀的铺在直径为10cm的无菌培养皿内，覆盖60-70％皿底面积，倒置放入37℃培养箱15min；翻转培养皿，轻轻加入10ml低血清培养基，在37℃，5％CO₂的培养箱内培养7-10天，此时组织块下均匀爬出细胞。

(2)取步骤(1)的培养皿，用PBS缓冲液清洗2次，弃除组织块(此时细胞已贴壁生长)，每皿加入10ml新鲜的低血清培养基(3-4天换液一次)，培养至细胞铺满培养皿底的80％左右。

(3)完成步骤(2)后，收集细胞，用0.25％的胰酶消化1-2min，1000rpm离心3min，收集细胞，即为原代脐带间充质细胞，又称P0代脐带间充质细胞。

3、获得P3代脐带间充质细胞

(1)将步骤2获得的P0代脐带间充质细胞平均分到两个直径为10cm的无菌培养皿内(1：2传代)，每个培养皿内分别加入10ml新鲜的低血清培养基(3-4天换液一次)，培养至细胞铺满培养皿底80％左右。

(2)完成步骤(1)后，收集细胞，用0.25％的胰酶消化1-2min，1000rpm离心3min，收集细胞，即为P1代脐带间充质细胞。

(3)将步骤(2)获得的P1代脐带间充质细胞平均分到直径为10cm的无菌培养皿内(1：2传代)，每个培养皿内分别加入10ml新鲜的低血清培养基(3-4天换液一次)，培养至细胞铺满培养皿底80％左右。

(4)完成步骤(3)后，收集细胞，用0.25％的胰酶消化细胞1-2min，1000rpm离心3min，收集细胞，即为P2代脐带间充质细胞。

(5)将步骤(4)获得的P2代脐带间充质细胞平均分到直径为10cm的无菌培养皿内(1：2传代)，每个培养皿内分别加入10ml新鲜的低血清培养基(3-4天换液一次)，培养至细胞铺满培养皿底80％左右。

(6)完成步骤(5)后，收集细胞，用0.25％的胰酶消化细胞1-2min，1000rpm离心3min，收集细胞，即为P3代脐带间充质细胞(又称P3细胞制剂)。

实施例2、P3细胞制剂的鉴定

供试品为实施例1制备的P3细胞制剂。

用流式细胞术检测供试品中CD29、CD44、CD90、CD105、CD126、CD31、CD45、CD34及HLA-DR的表达，具体步骤为：细胞分别与相应抗体共同孵育后，洗去多余的抗体，用PBS缓冲液重悬细胞，利用BD公司的LSR Fortessa仪器检测各指标的阳性率。

间充质干细胞的标志物(CD29、CD44、CD90、CD105和CD126)的结果见图1。造血干细胞及内皮细胞标志物(CD31、CD45和CD34)的结果见图2。移植排斥相关的标志物(HLA-DR)的结果见图3。结果表明，供试品高表达间充质干细胞的标志物(阳性率均为95％以上)，低表达造血干细胞及内皮细胞标志物(阳性率均低于10％)，基本不表达移植排斥相关的标志物(仅为0.2％)。

实施例3、P3细胞制剂对过敏性鼻炎的治疗效果

抗原佐剂混悬液：卵蛋白1mg/ml、氢氧化铝2mg/ml，余量为生理盐水。

卵蛋白溶液：卵蛋白0.1mg/ml，余量为生理盐水。

一、制备模型和给药

采用含卵蛋白和氢氧化铝凝胶对大鼠进行致敏诱导过敏性鼻炎模型。

SD大鼠，雌雄各半，体重250g左右，先进行适应饲养一周(清洁级动物饲养房，自由摄取食水)，然后进行如下分组处理(每组12只大鼠)：

细胞治疗组：试验第1天，注射抗原佐剂混悬液(每个后肢跖部一点、腹腔三点，共注射5个点，每个点注射0.2ml)；试验第7天，注射抗原佐剂混悬液(每个后肢跖部一点、腹腔三点，共注射5个点，每个点注射0.2ml)；试验第14天至第27天，每天滴鼻一次卵蛋白溶液(两侧鼻孔均滴，每侧50μl)；试验第14天、第21天、第28天、第35天，各腹腔注射一次实施例1制备的P3细胞制剂(每只每次5×10⁶个细胞)；

模型组：试验第1天，注射抗原佐剂混悬液(每个后肢跖部一点、腹腔三点，共注射5个点，每个点注射0.2ml)；试验第7天，注射抗原佐剂混悬液(每个后肢跖部一点、腹腔三点，共注射5个点，每个点注射0.2ml)；试验第14天至第27天，每天滴鼻一次卵蛋白溶液(两侧鼻孔均滴，每侧50μl)；

正常对照组：试验第1天，注射生理盐水(每个后肢跖部一点、腹腔三点，共注射5个点，每个点注射0.2ml)；试验第7天，注射无菌生理盐水(每个后肢跖部一点、腹腔三点，共注射5个点，每个点注射0.2ml)；试验第14天至第27天，每天滴鼻一次生理盐水(两侧鼻孔均滴，每侧50μl)。

二、表型观察

试验第36天，细胞治疗组和模型组大鼠以卵蛋白溶液滴鼻(两侧鼻孔均滴，每侧50μl)，正常对照组大鼠以生理盐水滴鼻(两侧鼻孔均滴，每侧50μl)。滴鼻后，每只大鼠放到一个观察盒内，观察10分钟，计数其打喷嚏次数及抓鼻子次数。

结果见图4。与模型组相比，治疗组大鼠的打喷嚏次数及抓鼻次数均显著降低，即细胞制剂对于过敏性鼻炎具有显著的疗效。

三、鼻黏膜病理检测

试验第36天，取大鼠的鼻黏膜组织，制作石蜡切片(切片厚度4μm)，然后进行苏木素-依红染色。

结果见图5。正常对照组大鼠的黏膜组织，可见上皮细胞排列整齐，纤毛完整，基底膜下少量炎性细胞集聚，腺体增生不明显。模型组大鼠的黏膜组织，可见上皮细胞排列紊乱，纤毛倒伏并缺失，上皮内杯状细胞增多，基底膜下可见大量淋巴细胞、嗜酸粒细胞等炎性细胞浸润，腺体增生和血管扩张明显。治疗组大鼠的黏膜组织，腺体的增生被抑制，即细胞制剂保护了粘膜组织的完整性。

四、血液生化及免疫学指标检测

试验第36天，大鼠腹主动脉采血，收集血清。检测血清中IFN-γ、IL-4、IL-17、TNF-α、IgE及组胺水平。用于检测IFN-γ的试剂盒为联科生物有限公司的产品，货号为70-EK3802。用于检测IL-4的试剂盒为联科生物有限公司的产品，货号为70-EK3042。用于检测IL-17的试剂盒为eBioscience公司的产品，货号为85-88-7170-88。用于检测TNF-α的试剂盒为eBioscience公司的产品，货号为85-88-7340-86。用于检测IgE的试剂盒为GenWayBiotech,Inc公司的产品，货号为GWB-500760。用于检测组胺的试剂盒为ADI公司产品，货号为196030-15。

IFN-γ、IL-4、IL-17和TNF-α的检测结果见图6。IgE和组胺的检测结果见图7。与正常对照组相比，模型组大鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-17、TNF-α、IgE和组胺水平均显著升高。与模型组相比，治疗组大鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-17、TNF-α、IgE和组胺水平均显著降低。