具体实施方式

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开提供了一种脐带干细胞制剂在制备治疗骨关节炎药物中的应用，该脐带干细胞制剂中包括：脐带间充质干细胞、组织提取液和异甘草素。

根据本公开，其中，所述脐带间充质干细胞的浓度为(0.5～5)×10⁶个/mL。

根据本公开，其中，所述组织提取液为从脐带华通氏胶组织中获取的组织提取液，该组织提取液中的蛋白分子量为3-10KD，蛋白浓度为0.1-0.8mg/mL。

根据本公开，其中，所述异甘草素的浓度为0.1-5μg/mL。

根据本公开，其中，所述脐带间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：将脐带华通氏胶剪碎，置于无血清完全培养基中进行贴壁培养，待细胞融合度为70-90％，弃掉脐带华通氏胶碎块继续培养；培养结束后，消化分散离心细胞，然后离心、接种进行传代培养，得到脐带间充质干细胞。

该脐带间充质干细胞为从脐带组织分离的成纤维样细胞，表达CD73、CD90和CD105，不表达CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR。

根据本公开，其中，所述原代培养的条件包括：培养时间为14-21天，培养温度为37℃；原代培养第7-21天，每隔2-3天完全更换培养瓶内的原代培养基；

根据本公开，其中，所述传代培养的条件包括：培养时间为3-5天，培养温度为37℃，传代培养每隔2-3天更换一半传代培养基。

根据本公开，其中，所述组织提取液的制备方法包括如下步骤：

S1、破碎所述脐带华通氏胶组织，离心处理后取组织上清液；

S2、使用生理盐水将所述组织上清液调整至浓度为0.1-1mg/mL；

S3、将浓度为0.1-1mg/mL的组织上清液进行超滤处理，得到组织提取液。

其中，离心处理的条件包括：离心2-4次，离心速率为3000-10000rpm，离心时间10-30min；

超滤处理的条件包括：使用3-10KD超滤管，3000-5000g离心15-30min。

根据本公开，其中，所述步骤S1中破碎过程包括：将所述脐带华通氏胶组织与生理盐水和/或PBS混合，然后进行破碎。

根据本公开，其中，所述脐带华通氏胶组织与生理盐水和/或PBS的体积比为1：(1-5)。

下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。

本公开所使用的无血清完全培养基可通过购买市售商品得到。

实施例1

将脐带剪成1cm小段后，使用含双抗的生理盐水清洁表面，并将组织内的血液清理干净；使用无菌镊子剥离组织内的静脉管和动脉管后，分离出的胶状物即为华通氏胶。取华通氏胶的1/3-2/3用于分离脐带干细胞。

脐带间充质干细胞制剂UCMSC的制备：将脐带间充质干细胞使用生理盐水悬浮，制备成脐带干细胞悬液，总体积为50μL，其中脐带间充质干细胞的浓度为2×10⁶个/mL。

大鼠骨关节炎模型构建：用注射器将25mg/mL碘乙酸100μL注入大鼠膝关节腔，诱导早期大鼠膝关节骨性关节炎，一周后模型构建完成。

将上述脐带间充质干细胞制剂注射至大鼠模型侧关节，每周一次，共注射3次，第3次注射完成后的第7天，取样检测膝关节软骨细胞标志基因，同时通过HE染色检测关节面损伤病理情况并进行关节炎程度评分(Mankin’s评分)，结果如图1～3所示。

实施例2

本实施例的脐带间充质干细胞的制备、和大鼠模型的构建过程与实施例1相同。

组织提取液的制备：取实施例1的华通氏胶剩余部分与生理盐水1按照体积比1:5混合，使用组织匀浆机破碎组织；将破碎后的组织在3000rpm下离心10min，取其上清液，在此条件下重复离心3次；在10000rpm下离心30min后取上清液，并用0.22μm滤网过滤，所得液体为华通氏胶组织裂解液。再将组织裂解液在4℃、4000g的条件下，使用10KD的超滤管离心20min，得到完全成分的、分子量大于10KD的组织提取液1；将组织提取液1的滤出液使用3KD的超滤管在4℃、4000g的条件下离心20min后，得到的浓缩液即分子量为3-10KD的蛋白质，用生理盐水调整蛋白浓度至0.5mg/mL，即为组织提取液2；最后的滤出液为分子量小于3KD的蛋白质，用生理盐水调整蛋白浓度至0.5mg/mL，即为组织提取液3。

脐带间充质干细胞制剂1的制备：将脐带间充质干细胞、组织提取液1、异甘草素混合，加入生理盐水悬浮，制备成脐带干细胞悬浮液，总体积为50μL，其中脐带间充质干细胞的浓度为2×10⁶个/mL，蛋白浓度为0.5mg/mL，异甘草素浓度为2μg/mL。

将脐带间充质干细胞制剂1注射至大鼠模型关节腔；每周一次，共注射3次，第3次注射完成后的第7天，取样检测膝关节软骨细胞标志基因，同时通过HE染色检测关节面损伤病理情况并进行关节炎程度评分(Mankin’s评分)，结果如图1～3所示。

实施例3

本实施例的脐带间充质干细胞的制备和大鼠模型的构建过程与实施例1相同；本实施例脐带组织提取液的制备与实施例2相同。

脐带间充质干细胞制剂2的制备：将脐带间充质干细胞、组织提取液2、异甘草素混合，加入生理盐水悬浮，制备成脐带干细胞悬浮液，总体积为50μL，其中脐带间充质干细胞的浓度为2×10⁶个/mL，蛋白浓度为0.5mg/mL，异甘草素浓度为2μg/mL。

将脐带间充质干细胞制剂2注射至大鼠模型关节腔，每周一次，共注射3次，第3次注射完成后的第7天，取样检测膝关节软骨细胞标志基因，同时通过HE染色检测关节面损伤病理情况并进行关节炎程度评分(Mankin’s评分)，结果如图1～3所示。

实施例4

本实施例的脐带间充质干细胞的制备和大鼠模型的构建过程与实施例1相同；本实施例的脐带组织提取液的制备与实施例2相同。

脐带间充质干细胞制剂3的制备：将脐带间充质干细胞、组织提取液3和异甘草素混合，加入生理盐水悬浮，制备成脐带干细胞悬浮液，总体积为50μL，其中脐带间充质干细胞的浓度为2×10⁶个/mL，蛋白浓度为0.5mg/mL，异甘草素浓度为2μg/mL。

将脐带间充质干细胞制剂3注射至大鼠模型关节腔，每周一次，共注射3次，第3次注射完成后的第7天，取样检测膝关节软骨细胞标志基因，同时通过HE染色检测关节面损伤病理情况并进行关节炎程度评分(Mankin’s评分)，结果如图1～3所示。

实施例5

本实施例的脐带间充质干细胞的制备和大鼠模型的构建过程与实施例1相同；本实施例的脐带组织提取液的制备与实施例2相同。

脐带间充质干细胞制剂4的制备：将脐带间充质干细胞、组织提取液3、异甘草素混合，加入生理盐水悬浮，制备成脐带干细胞悬浮液，总体积为50μL，其中脐带间充质干细胞的浓度为2×10⁶个/mL，蛋白浓度为0.5mg/mL，异甘草素浓度为10μg/mL。

将脐带间充质干细胞制剂4注射至大鼠模型关节腔，每周一次，共注射3次，第3次注射完成后的第7天，取样检测膝关节软骨细胞标志基因，同时通过HE染色检测关节面损伤病理情况并进行关节炎程度评分(Mankin’s评分)，结果如图1～3所示。

模型组为未经过治疗的大鼠模型，从图1可以明显看出，模型组的关节破坏明显，属于早期关节炎的症状；不同的处理组，均能恢复骨关节炎造成的破坏，其中，制剂2组治疗效果最为显著；

图2根据Mankin`s评分规则对各组别进行评分，制剂2组得分显著低于其他组(**p<0.01)，表示其降低骨关节损伤效果最佳；

图3中显示，制剂2组能促进软骨细胞标志基因Aggrecan、Col2a1的表达效果显著优于其他组(*p<0.05；**p<0.01)，表明其保护和促进软骨细胞修复作用最佳。

对比例1

本对比例与实施例2的制备方法相同，唯一不同的是本对比例中的脐带干细胞制剂中未添加组织提取液。结果显示，本对比例所制备的脐带干细胞制剂能够轻微降低骨关节损伤、提高软骨细胞标志基因表达。

对比例2

本对比例与实施例2的制备方法相同，唯一不同的是本实施例中的脐带干细胞制剂中未添加异甘草素。结果显示，本对比例所制备的脐带干细胞制剂能够轻微降低骨关节损伤、提高软骨细胞标志基因表达。

通过上述实施例可以看出，单一脐带干细胞能够一定程度上降低骨关节炎的炎症水平，提高软骨细胞标志基因的表达，降低了关节损伤程度；使用脐带干细胞制剂1、3、4不能提高脐带干细胞的修复功能；使用脐带干细胞制剂2，即脐带干细胞混合组织提取液2(3KD-10KD分子量的组织提取液)，并添加2μg/mL异甘草素，能显著降低管关节炎评分、降低炎症、促进软骨细胞标志基因表达，表明本公开所制备的脐带干细胞制剂2能够显著降低骨关节炎损伤，保护软骨细胞。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。