阅读说明：本技术 一种固定化青霉素g酰化酶及其制备方法 (Immobilized penicillin G acylase and preparation method thereof ) 是由 陈振斌 柳春丽 周永山 张定军 李慧 吴翠玲 于 2020-05-26 设计创作，主要内容包括：本发明一种固定化青霉素G酰化酶及其制备方法,属于固定化酶技术领域。所述固定化青霉素G酰化酶为具有纳米囊性结构的Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub>@PTA-PGA/PDA,是由Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub> NPs固定化PGA和包覆在所述Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub> NPs固定化PGA表面的PDA涂层制成,所述Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub> NPs的表面负载有PTA。制备方法为：用TA对Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub> NPs进行表面修饰,制备得Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub>@PTA NPs；将所述Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub>@PTA NPs作为载体对PGA进行固定化,制备得Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub>@PTA-PGA NPs；用DA对所述Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub>@PTA-PGA NPs进行表面包覆,即得。本发明的固定化青霉素G酰化酶具有良好的pH稳定性和温度耐受性,且操作稳定性和重复利用率较好,具有很高的工业应用价值。(The invention relates to an immobilized penicillin G acylase and a preparation method thereof, belonging to the technical field of immobilized enzymes. The immobilized penicillin G acylase is Fe with a nano-cystic structure 3 O 4 @ PTA-PGA/PDA, is made of Fe 3 O 4 NPs immobilized PGA and coated on the Fe 3 O 4 PDA coating of NPs immobilized PGA surface, Fe 3 O 4 The surface of the NPs is loaded with PTA. The preparation method comprises the following steps: using TA for Fe 3 O 4 NPs are subjected to surface modification to prepare Fe 3 O 4 @ PTA NPs; subjecting said Fe to 3 O 4 The @ PTA NPs are used as carriers to immobilize PGA to prepare Fe 3 O 4 @ PTA-PGA NPs; the DA is used for the Fe 3 O 4 And coating the surface of the @ PTA-PGA NPs to obtain the product. The immobilized penicillin G acylase has good pH stability and temperature tolerance, and has operation stability and repeatabilityThe utilization rate is good, and the industrial application value is high.)

一种固定化青霉素G酰化酶及其制备方法

技术领域

本发明属于固定化酶制备技术领域，尤其涉及一种固定化青霉素G酰化酶及其制备方法，具体说是具有纳米囊性结构的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA及其制备方法。

背景技术

青霉素G酰化酶简称PGA，主要被用于生产β-内酰胺类抗生素。游离的青霉素G酰化酶在工业催化应用中存在许多不足，如容易丧失催化活性，游离酶回收困难，造成产物难以分离提纯，生产过程难以实现连续操作。而固定化青霉素G酰化酶克服了游离酶的上述缺点，不仅能保持游离酶的催化活性，还可提高操作稳定性，生产过程易于实现连续操作，易与产物分离且可重复使用，被国内外进行了广泛研究，且已取得良好的进展。但制备和/或选择性能更好的载体来满足工业化应用的要求并减少其传质限制，仍是青霉素G酰化酶得以进一步利用的关键。

研究表明多羟基的微环境有利于PGA活性构象的维持，而单宁酸(TA)是一种含没食子酰基的多元酚，用于构建载体表面的多羟基微环境，能将酶通过物理吸附固定在载体表面，并提高固定化PGA的酶活力。但由于载体通过范德华力和氢键与PGA进行吸附，相互作用较弱，在实际操作过程中PGA容易脱落，严重影响其重复利用。另外，现有利用吸附法制备的固定化PGA在重复使用6次后，其酶活通常仅为初始活力的80％以下，如Xue等采用Co增加MCM-48框架内的弱酸性结合位点(Co/Si＝0.01)，固定化青霉素G酰化酶在使用6次后，其酶活力可维持在80％左右。因此，如何进一步提高吸附法制备的固定化青霉素G酰化酶的操作稳定性和重复利用率是亟需解决的难点问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种固定化青霉素G酰化酶及其制备方法，通过对载体进行表面修饰并在固定化PGA表面包覆PDA涂层的技术手段，减少了固定化PGA的脱落，提高了固定化PGA的操作稳定性和重复利用率。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供了一种固定化青霉素G酰化酶，所述固定化青霉素G酰化酶为纳米囊性结构，其包括：

Fe₃O₄ NPs固定化PGA，所述Fe₃O₄ NPs的表面负载有PTA；以及

包覆在所述Fe₃O₄ NPs固定化PGA表面的PDA涂层。

本发明还提供了一种固定化青霉素G酰化酶的制备方法，包括：

用TA对Fe₃O₄ NPs进行表面修饰，制备得到Fe₃O₄@PTA NPs；

将所述Fe₃O₄@PTA NPs作为载体，对PGA进行固定化，制备得到固定化PGA(Fe₃O₄@PTA-PGA NPs)；

用DA对所述Fe₃O₄@PTA-PGA NPs进行表面包覆，制备得到Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA，即为本发明的固定化青霉素G酰化酶。

作为优选，制备Fe₃O₄@PTA NPs，包括：

将Fe₃O₄ NPs分散在蒸馏水中，并在40℃的恒温水浴中通N₂30min；

向Fe₃O₄ NPs的水分散液中加入TA水溶液，并在N₂保护下进行反应2h；

对产物进行分离，并用蒸馏水多次洗涤分离出的产物，直至洗涤所述产物的洗涤液在275nm处的吸光度小于0.005，所述吸光度采用紫外分光光度法进行测定，即得Fe₃O₄@PTA NPs。

作为优选，制备Fe₃O₄@PTA NPs，还包括：

在40℃的温度下，对制备的Fe₃O₄@PTA NPs进行真空干燥至恒重。

作为优选，制备Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA，包括：

将Fe₃O₄@PTA-PGA NPs分散在PBS缓冲液中；

向Fe₃O₄@PTA-PGANPs/PBS溶液中加入DA，在25℃恒温水浴中，搅拌下进行聚合反应4-9h；

对产物进行分离，并用PBS缓冲液多次洗涤分离出的产物，直至洗涤所述产物的洗脱液在507nm处的吸光度小于0.005，所述吸光度采用紫外分光光度法进行测定，即得Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA。

作为优选，制备具有纳米囊性结构的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA，还包括：

在40℃的温度下,对制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA进行真空干燥。

作为优选，所述PBS缓冲液的浓度为40mmol/mL，pH＝8.0。

作为优选，制备所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的聚合反应时间为4h。

作为优选，所述Fe₃O₄ NPs的平均粒径为9.13nm。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明制备的固定化青霉素G酰化酶具有纳米囊性结构，其不仅具有良好的pH稳定性和温度耐受性，而且操作稳定性和重复利用率较好，具有很高的工业应用价值。实验表明，本发明的固定化青霉素G酰化酶在储存90天后的酶活保留率为87.1％，重复使用12次后仍保留94.1％的相对酶活，且固定化青霉素G酰化酶的回收率为98.0％。

本发明的制备方法简单易行，条件温和，生物相容性高，可规模化生产。

附图说明

图1为发明本实施例制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的结构示意图；

图2为本发明实施例制备Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的流程图；

图3为本发明实施例所述Fe₃O₄ NPs、Fe₃O₄@PTA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的FTIR谱图；

图4为本发明实施例所述Fe₃O₄ NPs、Fe₃O₄@PTA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的XRD谱图；

图5为本发明实施例所述Fe₃O₄ NPs、Fe₃O₄@PTA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的磁滞回线；

图6为游离PGA和本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR随催化pH值的变化曲线；

图7为游离PGA和本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR随催化温度的变化曲线；

图8为在60℃的温度环境下游离PGA和本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR随温育时间的变化曲线；

图9为在pH＝4的环境下游离PGA和本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR随温育时间的变化曲线；

图10在为pH＝10的环境下游离PGA和本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR随温育时间的变化曲线；

图11为游离PGA和本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的R_a随储存时间的变化曲线；

图12为本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGANPs和Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的R_a随使用次数的变化情况；

图13为本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的R_e随使用次数的变化情况；

图14为本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的PDA包覆量随聚合反应时间的变化曲线；

图15为游离PGA、本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和在不同聚合反应时间下制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA与残液中6-APA的吸光度随催化时间的变化曲线；

图16为本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EA和EAR随聚合反应时间的变化曲线；

图17为游离PGA、本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和在聚合反应时间分别为4h和15h制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的形态结构示意图；

图18为在pH＝4的环境中本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR和R_a随聚合反应时间的变化曲线；

图19为在pH＝10的环境中本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR和R_a随聚合反应时间的变化曲线；

图20为在60℃温度环境中本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR和R_a随聚合反应时间的变化曲线；

图中，EA-酶活力、EAR-酶活回收率、R_a-相对酶活力、R_e-固定化PGA回收率。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

请参见图1至图2，图1提供了本发明一种固定化青霉素G酰化酶的结构示意图，图2提供了本发明一种固定化青霉素G酰化酶的制备流程图。

参照图1所示，本发明提供了一种固定化青霉素G酰化酶，所述固定化青霉素G酰化酶为纳米囊性结构，其包括：

Fe₃O₄ NPs固定化PGA，所述Fe₃O₄ NPs的表面负载有PTA；以及

包覆在所述Fe₃O₄ NPs固定化PGA表面的PDA涂层。

其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售或所属领域公开的按常规方法制备即可。

本发明实施例中，所用TA(单宁酸)购自上海麦克林试剂有限公司，其纯度为98％。

本发明实施例中，所用Fe₃O₄NPs的平均粒径为9.13nm，它是采用反相微乳液法制备获得。

单宁酸简称TA，是一种含没食子酰基的多元酚，属于儿茶酚衍生物。本发明采用TA对载体Fe₃O₄ NPs进行表面修饰，构建了Fe₃O₄ NPs表面的多羟基微环境，从而提高了固定化PGA的酶活力。

进一步地，本发明利用TA的氧化自聚对Fe₃O₄ NPs进行表面修饰，在Fe₃O₄ NPs的表面形成仿生粘附层，然后通过物理吸附作用固定化PGA，得到固定化PGA(Fe₃O₄@PTA-PGANPs)。

多巴胺简称DA，是一种儿茶酚衍生物。本发明利用DA的粘附性在所述固定化PGA(Fe₃O₄@PTA-PGA NPs)的表面聚合形成一层保护涂层，从而得到具有纳米囊性结构的固定化青霉素G酰化酶(Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA)，减少了固定化PGA的脱落，提高了固定化PGA的操作稳定性和重复利用率。

参照图2所示，本发明还提供了一种固定化青霉素G酰化酶的制备方法，其步骤包括：

用TA对Fe₃O₄ NPs进行表面修饰，制备得Fe₃O₄@PTA NPs；

将所述Fe₃O₄@PTA NPs作为载体，对PGA进行固定，制备得到固定化PGA(Fe₃O₄@PTA-PGA NPs)；

用DA对所述Fe₃O₄@PTA-PGA NPs进行表面包覆，制备得到Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA，即为本发明的固定化青霉素G酰化酶。

在本发明的实施方案中，所述制备Fe₃O₄@PTA NPs，包括：

将Fe₃O₄ NPs分散在蒸馏水中，并在40℃的恒温水浴中通N₂30min；

向Fe₃O₄ NPs的水分散液中加入TA水溶液，并在N₂保护下进行反应2h；

反应结束后对产物进行分离，并用蒸馏水多次洗涤分离出的产物，直至洗涤所述产物的洗脱液在275nm处的吸光度小于0.005，所述吸光度采用紫外分光光度法进行测定，即得Fe₃O₄@PTA NPs。

在本发明的实施方案中，制备Fe₃O₄@PTA NPs，还包括：

在40℃的温度下，对制备的Fe₃O₄@PTA NPs进行真空干燥至恒重。

在本发明的实施方案中，制备Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA，包括：

将Fe₃O₄@PTA-PGANPs分散在PBS缓冲液中，得到Fe₃O₄@PTA-PGANPs/PBS溶液；

向所述Fe₃O₄@PTA-PGA NPs/PBS溶液中加入DA，在25℃恒温水浴中，搅拌下进行聚合反应4-9h；

反应结束后对产物进行分离，并用PBS缓冲液多次洗涤分离出的产物，直至洗脱液采用紫外分光光度法在507nm处测定的吸光度小于0.005，即得具有纳米囊性结构的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA。

在本发明的实施方案中，制备Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA，还包括：

在40℃的温度下，对制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA进行真空干燥。

在本发明的实施方案中，所述PBS缓冲液的浓度为40mmol/mL，pH＝8.0。

在本发明的实施方案中，制备Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的聚合反应时间为4h。

在本发明的实施方案中，所述Fe₃O₄ NPs的平均粒径为9.13nm。

下面结合实施例，更进一步阐述本发明。

实施例1-本发明所述固定化青霉素G酰化酶的制备

本实施例提供了一种固定化青霉素G酰化酶的制备，具体提供了具有纳米囊性结构的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的制备。

所述具有纳米囊性结构的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA通过以下成分制备成：

Fe₃O₄ NPs固定化PGA，所述Fe₃O₄ NPs的表面负载有PTA；以及

包覆在所述Fe₃O₄ NPs固定化PGA表面的PDA涂层。

所述具有纳米囊性结构的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的制备方法，包括：

S1、用TA对Fe₃O₄ NPs进行表面修饰，制备获得Fe₃O₄@PTA NPs

取10.0000g Fe₃O₄ NPs(湿重)和20.0mL蒸馏水，加入到配有电动搅拌的三口瓶中，进行超声分散均匀并固定在40℃的恒温水浴中通N₂30min，然后加入20.0mLTA水溶液(25mg/mL)并在N₂保护下反应2h。反应结束后，用磁铁对产物进行分离，并用蒸馏水多次洗涤分离出的产物，直至洗涤所述产物的洗涤液在275nm处的吸光度小于0.005，所述吸光度采用紫外分光光度法进行测定，即得Fe₃O₄@PTA NPs。

为提高计算包覆率的准确性，将制备的Fe₃O₄@PTANPs在40℃真空烘箱中干燥至恒重之后，计算PTA的包覆率。

其中，所述Fe₃O₄ NPs是采用反相微乳液法制备获得，其平均粒径为9.13nm。

S2、用制备的Fe₃O₄@PTA NPs对PGA进行固定化，制备Fe₃O₄@PTA-PGA NPs

利用Fe₃O₄@PTA NPs表面的羟基通过物理吸附的方式对PGA进行固定，具体方法为：称取0.5000g制备的Fe₃O₄@PTA NPs与50.0mL的PBS缓冲液加入到锥形瓶中，超声分散30min后加入5vol.％50.0mL的游离PGA溶液，然后固定在35℃的恒温水浴振荡器反应24h。反应结束后，利用磁铁对产物进行分离，并用PBS缓冲液多次洗涤分离出的产物，直至洗涤液采用PDAB显色法在420nm处测定的吸光度小于0.005，即得Fe₃O₄@PTA-PGA NPs。

为提高计算固定化PGA负载量的准确性，将制备的Fe₃O₄@PTA-PGA NPs在40℃真空烘箱中干燥48h之后，计算固定化PGA的负载量。

S3、制备具有纳米囊性结构的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA

取6.0000g制备的Fe₃O₄@PTA-PGA NPs(湿重)和150.0mLPBS缓冲液(40mM，pH＝8.0)，加入到250mL配有电动搅拌的三口瓶中，温和搅拌10min使其均匀分散，然后加入0.3000gDA在25℃恒温水浴中，温和搅拌下进行聚合反应4h。反应结束后，用磁铁对产物进行分离，并用PBS缓冲液多次洗涤分离出的产物，直到洗涤所述产物的洗脱液在507nm处的吸光度小于0.005，所述吸光度采用紫外分光光度法进行测定，即得Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA。

为提高计算PDA涂层包覆量的准确性，将制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA在40℃真空烘箱中干燥48h之后，计算PDA涂层的包覆量。

实施例2-本发明所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的表征及性能测定

1、FTIR、XRD、VSM表征

分别对实施例1所用的Fe₃O₄NPs，及制备的Fe₃O₄@PTANPs、Fe₃O₄@PTA-PGANPs和Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA进行表征，其结果参照图3至图5。

图3为FTIR谱图；图4为XRD谱图；图5为磁滞回线。

图3中，a、b、c、d分别为Fe₃O₄ NPs、Fe₃O₄@PTA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA NPs的FTIR谱线。

通过图3可以看出，本实施例的Fe₃O₄NPs、Fe₃O₄@PTANPs、Fe₃O₄@PTA-PGANPs和Fe₃O₄@PTA-PGA/PDANPs的FTIR谱线中，都能明显观察到在583cm^-1处Fe-O键的伸缩振动特征峰，说明本发明制备Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA NPs中，Fe₃O₄NPs的结构没有发生变化。

从Fe₃O₄@PTA NPs的FTIR谱线中观察到，在1704cm^-1、1207cm^-1和1078cm^-1处分别出现了PTA中C＝O键的伸缩振动吸收峰、C-O-C的伸缩振动吸收峰和酚羟基中C-O键的伸缩振动吸收峰；在1428cm^-1和628cm^-1处分别出现了PTA苯环中C＝C的特征吸收峰和C-H的面外弯曲振动吸收峰；在1346cm^-1、1646cm^-1和3411cm^-1处的特征峰是PTA中-OH的面内弯曲振动、面外弯曲振动以及伸缩振动造成的，表明PTA与Fe₃O₄ NPs成功复合。

与Fe₃O₄@PTA NPs的FTIR谱线相比，Fe₃O₄@PTA-PGA NPs的FTIR谱线在2937cm^-1和2871cm^-1处分别出现了-CH₃、-CH₂伸缩振动峰；在748cm^-1附近的吸收峰可归因于苯环的单取代，说明PGA成功固定在Fe₃O₄@PTA-NPs的表面。

而经过PDA涂层包覆后，Fe₃O₄@PTA-PGA/PDANPs的FTIR谱线在1280cm^-1处出现了DA中C-N键的伸缩振动吸收峰，同时在630cm^-1和1647cm^-1处的吸收峰分别出现了不同程度的变化，表明PDA成功包覆在Fe₃O₄@PTA-PGA NPs的表面。

图4中，a、b、c、d分别为Fe₃O₄ NPs、Fe₃O₄@PTA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs、Fe₃O₄@PTA–PGA/PDA NPs的XRD谱线。

分别将本实施例所述的Fe₃O₄ NPs、Fe₃O₄@PTA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA/PDANPs的特征衍射峰与Fe₃O₄标准PDF卡片相比较，并通过图4可以看出，所述Fe₃O₄NPs、Fe₃O₄@PTA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA分别在2θ＝29.88°、35.50°、43.26°、53.66°、57.42°、63.06°和75.75°处出现的特征衍射峰分别对应Fe₃O₄的(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)、(533)晶面，这与Fe₃O₄ NPs标准PDF卡片(JCPDS，26-1136)数据相一致，表明Fe₃O₄@PTA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA均为反尖晶石结构。

同时，本实施例所述的XRD谱图中未出现多余的杂质峰，表明本发明所制备的Fe₃O₄@PTANPs、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA都具有较高的纯度，且在反应过程中晶型未发生改变。

图5中，a、b、c、d分别为Fe₃O₄ NPs、Fe₃O₄@PTA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA NPs的磁滞回线。

通过图5可以看出，本实施例的Fe₃O₄NPs、Fe₃O₄@PTA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGANPs和Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的磁饱和强度分别为59.8emu/g、39.5emu/g、33.8emu/g和32.2emu/g。本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的磁饱和强度降低，主要是由于PTA、PDA和PGA在Fe₃O₄@PTA-PGA/PDANPs中含量的增加，同时Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA中Fe₃O₄的相对含量降低，表明本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的改性和固定化都是成功的。

本实施例制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA NPs的磁饱和强度为32.2emu/g，说明其具备快速磁分离的能力。另外，所述Fe₃O₄NPs、Fe₃O₄@PTA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGANPs和Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的磁滞回线基本完全重合，证明所述Fe₃O₄NPs及本实施例制备的Fe₃O₄@PTA NPs、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA都具有超顺磁性。

通过表征可以确定，本发明制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA为纳米囊性结构。

2、性能测定

2.1本发明所述具有纳米囊性结构的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的催化稳定性

参照图6至图7。

图6为游离PGA、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR随pH值的变化曲线；图7为游离PGA、Fe₃O₄@PTA-PGANPs和本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR随催化温度的变化曲线。

通过图6可以看出，本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA和游离PGA的最佳pH都为8.0，且随着pH的变化表现出相同的趋势。同时本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA比Fe₃O₄@PTA-PGA NPs具有更好的pH稳定性。这是由于PDA涂层可以一定程度地保护PGA分子的活性中心构象发生变形，也使其在最佳条件下的EAR有一定程度的降低，但降幅仅为2.7％，这可归因于DA涂层对PGA的挤压和对扩散速率的影响。

通过图7以看出，本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA和游离PGA的最佳催化温度都是37℃，同时本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA比Fe₃O₄@PTA-PGANPs具有更好的热稳定性，说明本发明在Fe₃O₄@PTA-PGANPs表面包覆的PDA涂层在保护PGA分子中起到了关键作用，可能是PDA涂层表面的C＝O会与PGA分子的氨基发生共价作用，限制了PGA活性中心的严重变形，使Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR变化较小。

2.2本发明所述具有纳米囊性结构的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的稳定性

参照图8至图10。

图8为在60℃的温度环境下游离PGA、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和本发明所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR随温育时间的变化曲线；图9为pH＝4的环境下游离PGA、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和本发明所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR随温育时间的变化曲线；图10为pH＝10的环境下游离PGA、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和本发明所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR随温育时间的变化曲线。

通过图8至图10可以看出，无论是在酸性、碱性环境中，还是在高温条件下，本发明所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA比Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和游离PGA具有更好的稳定性。在pH＝4的环境中，Fe₃O₄@PTA-PGA NPs在保存3个小时后EAR仅为16.8％，游离PGA基本失活，而本发明所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR为39.8％；在pH＝10的环境中，游离PGA与Fe₃O₄@PTA-PGA NPs的EAR分别为7.5％和45.9％，而本发明所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR为61.1％，其原因在于PDA与PGA之间存在共价键，提高了固定化PGA活性中心构象的稳定性。此外，PDA和PTA中的C＝O/C-OH、C-NH₂/C-NH₃ ⁺、C-NH⁺/C-NH₂可以中和PGA分子微环境中的一部分H⁺和OH^-，从而提高了pH稳定性。在60℃的温度环境中，不论是游离PGA和Fe₃O₄@PTA-PGA NPs，还是本发明所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA，其EAR都随着温育时间的增加而降低，但游离PGA在温育1.5h后基本失活，Fe₃O₄@PTA-PGA NPs在温育3h后EAR仅为7％，而本发明所述的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR为22.5％，其原因可能是PDA涂层与PGA分子之间存在共价键，且PDA涂层为Fe₃O₄@PTA-PGANPs提供了坚固的屏障，保护了PGA活性中心构象免受高温破坏。

2.3本发明所述具有纳米囊性结构的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的存储稳定性

将游离PGA、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA储存于4℃的PBS缓冲液中，在90天内测定其相对酶活R_a，结果参照图11。

图11为游离PGA、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的R_a随储存时间的变化曲线。

通过图11可以看出，在90天后游离PGA的R_a仅为12.5％，Fe₃O₄@PTA-PGA NPs的R_a为73.0％，而本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的R_a为87.1％，说明本发明所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA具有更好的储存稳定性。这主要归因于PTA和PDA构键了一个多羟基微环境，有利于PGA维持良好的催化构象。在储存过程中，酶活力的损失主要与微生物的降解有关，而TA和DA均具有良好的抗菌性，能使固定化PGA免受微生物的降解，从而使其活性较高。

2.4本发明所述具有纳米囊性结构的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的重复使用性

结果参照图12和图13。

图12为Fe₃O₄@PTA-PGANPs和本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的R_a随使用次数的变化情况；图13为本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的R_e随使用次数的变化情况。

通过图12可以看出，Fe₃O₄@PTA-PGANPs和本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA随着使用次数的增加，其相对酶活力都有所降低。但在重复使用12次后，所述Fe₃O₄@PTA-PGA NPs的R_a为68.0％，而本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的R_a为94.1％。在使用过程中本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA酶活力的降低，主要是连续重复使用导致部分PGA活性中心构象发生变化以及产物6-APA的浓度过大抑制了PGA的催化活性，而Fe₃O₄@PTA-PGA NPs降低较快主要是由于PGA分子的脱落，说明DA涂层可以作为一个保护屏障，保护PGA分子的脱落和失活。同时，Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA在回收过程的损失也是导致R_a降低的重要原因(如图13)。

另外，在最佳条件下，本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA在重复使用12次之后，R_e仍为98.0％，本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA虽然存在一定的扩散阻力，但由于DA涂层的存在使得本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA具有更好的可重复使用性。

通过上述实验可知，本发明的固定化青霉素G酰化酶具有如下优点：

1)具有更好的pH稳定性，在pH＝4的环境中，本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA相比Fe₃O₄@PTA-PGA NPs，在保存3h后EAR提高23.0％；在pH＝10的环境中，本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA相比Fe₃O₄@PTA-PGA NPs，在保存3h后EAR提高15.2％。

2)具有更好的温度耐受性，在60℃的温度中，本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA相比Fe₃O₄@PTA-PGA NPs，在温育3h后EAR提高15.5％。

3)具有更好的存储稳定性，本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA相比Fe₃O₄@PTA-PGA NPs，在存储90天后R_a提高14.1％。

4)具有更好的重复使用性，本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA相比Fe₃O₄@PTA-PGA NPs，在重复使用12次后R_a提高26.1％。

实施例3-制备Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA中所述聚合反应时间的筛选

通过测定不同聚合反应时间下制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的响应速率、酶活回收率及稳定性，最终确定了本发明的最佳聚合反应时间，具体如下：

3.1聚合反应时间对PDA包覆量的影响

本发明通过以下公式(I)计算DA涂层的包覆量(C_r-PDA)

C_r-PDA＝(m₃-m₂)×10³/m₂ (I)

式中，C_r-PDA(mg/g)为DA的包覆率；m₂(g)为制备的Fe₃O₄@PTA-PGANPs的干重；m₃(g)为制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的干重。

根据计算结果绘制包覆量随聚合反应时间的变化曲线，结果参照图14。

图14为本发明实施例所述Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的DA包覆量随聚合反应时间的变化曲线。

通过图14可以看出，C_r-PDA随着聚合反应时间的增加呈近似线性增加，且聚合反应表现出良好的可控性。

2.2聚合反应时间对Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的响应速率的影响

通过测定游离PGA和本发明的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的催化时间与产物6-APA的吸光度之间的关系判断固定化PGA的响应速率，具体方法如下：

取5vol.％的游离PGA 0.10mL、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和分别在2、4、6、9、12和15h的聚合反应时间下制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA各50mg，将所取样品分别置于15mL的试剂瓶中，并分别加入10.00mL5.00wt.％的PG溶液，在37℃水浴中分别振荡1、2、4、6、9、12、15、20和25min。反应完成后采用PDAB显色法测定吸光度，并计算固定化PGA的EA和EAR，结果参照图15至图17。

图15为游离PGA、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和本发明在不同聚合反应时间下制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA与残液中6-APA的吸光度随催化时间的变化曲线；图16为游离PGA、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和本发明在不同聚合反应时间下制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EA和EAR随催化时间的变化曲线；图17为游离PGA、Fe₃O₄@PTA-PGA NPs和聚合反应时间分别为4h和15h制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的形态结构示意图。

通过图15和图16可以看出，游离PGA在催化5min后反应基本达到平衡(吸光度不再随时间的延长而明显增加)。而本发明在聚合反应时间分别为2h、4h、6h、9h、12h和15h时制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的催化反应达到平衡的时间大约为8min、9min、10min、12min、14min、17min和20min，且EA和EAR随着聚合反应时间的增加而不断降低，出现这种现象原因与DA涂层厚度的增加有关。PDA涂层对PGA的挤压使Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA活性中心构象发生变形，导致其EA和EAR降低。PDA涂层厚度的增加使底物和产物扩散速率降低，也是导致催化活性的降低的重要原因。

通过图16还可以看出，当DA聚合反应时间超过4h时，Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EA和EAR有较大程度的减小。当聚合反应时间为4h时，Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR为77.4％；而聚合时间为15h时，Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR为67.8％。

2.3聚合反应时间对Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的稳定性的影响

本发明采用EAR和R_a评价固定化PGA的催化活性，其中EAR的参照为适宜环境下游离PGA的酶活力，表示固定化PGA的实际的催化活性，R_a的参照为适宜环境下对应固定化PGA的酶活力，表示苛刻环境中固定化PGA相对酶活。

2.3.1聚合反应时间对Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的热稳定性的影响

分别称取不同聚合反应时间下制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA各50mg，在60℃的PBS缓冲液(40mmol，pH＝8.0)中温育3h，经磁分离后加入10.00mL 5.00wt.％的PG溶液，在37℃水浴中分别振荡8min、9min、10min、12min、14min、17min和20min。反应完成后用PDAB显色法测定吸光度，计算固定化PGA的EA和EAR，并通过以下公式(II)计算相对酶活(R_a)。

R_a＝EA_h/EA₀×100％ (II)

式中，R_a为Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的相对酶活；EA_h为Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA在60℃的环境中温育3h后的酶活力；EA₀(U/g)为Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的初始酶活力。

2.3.2聚合反应时间对Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的pH稳定性的影响

用H₃PO₄和NH₃·H₂O分别将PBS缓冲液的pH值调节为4和10。分别称取不同聚合反应时间下制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA各50mg，在25℃的PBS缓冲液(pH＝4和pH＝10)中温育3h，反应结束后用PBS缓冲液多次洗涤，直至洗涤液pH为8.0。测定不同聚合反应时间下制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的吸光度，并计算EA和EAR，最后通过以下公式(II)计算相对酶活(R_a)。

结果参照图18至图20。

图18为pH＝4的环境中Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR和R_a随聚合反应时间的变化曲线；图19为pH＝10的环境中Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR和R_a随聚合反应时间的变化曲线；图20为60℃温度下Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR和R_a随聚合反应时间的变化曲线。

通过图18至图20可以看出，不同聚合反应时间下制备的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的pH值稳定性和热稳定性具有相同的变化趋势，即EAR随着聚合时间的增加先快速增加后缓慢减小，R_a随着聚合时间的增加先快速增加转变为缓慢增加，均在4-6h之间出现拐点。出现这种现象的原因可能与PGA活性中心构象的变化和底物、产物的扩散速率有关。当聚合反应时间为0h(即Fe₃O₄@PTA-PGANPs的表面没有PDA涂层)时，PGA分子通过简单的物理吸附固定在Fe₃O₄@PTANPs的表面，在苛刻环境下PGA分子的活性中心构象发生严重变形使其活性较低甚至失活；当聚合反应时间为2h时，PDA涂层可能是部分包覆，在一定程度上避免一部分PGA活性中心构象的变化，其EAR和R_a有所增加；当聚合反应时间为4h时，DA涂层完善程度不断增加甚至完整包覆Fe₃O₄@PTA-PGA NPs，对PGA活性中心构象变化的影响更小，此时PDA涂层对PGA分子的挤压和扩散速率的影响较小，因而Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的EAR和R_a继续增加达到最大值；当聚合反应时间为6h时，DA涂层厚度的增加虽然有利于保护PGA分子的构象，但效果明显下降，反而会增加挤压和扩散对PGA催化活性的影响，由PDA涂层的保护作用向抑制作用转变，故EAR在附近位置出现拐点变为逐渐降低，R_a消除了PDA涂层对扩散的影响，其表现为缓慢增加，还发现EAR的增加速率远大于降低速率，可归因于苛刻环境对PGA催化活性的影响远大于扩散速率的影响。

综合考虑固定化PGA的响应速率、酶活回收率及稳定性，本发明制备具有纳米囊性结构的Fe₃O₄@PTA-PGA/PDA的最佳聚合反应时间为4h。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。