阅读说明：本技术 一种磁性纳米材料及其在提取人全血基因组dna中的应用 (Magnetic nano material and application thereof in extraction of human whole blood genome DNA ) 是由 陈毓 王旭 徐如嫣 于 2020-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种磁性纳米材料及其在提取人全血基因组DNA中的应用,发明的磁性纳米材料由零价纳米铁和氧化石墨烯经分散、包被和烘干制备而成,且本发明的一种磁性纳米材料从100μl人全血基因组中提取的基因组DNA浓度约为1μg,而常规的试剂盒法从100μl人全血基因组中提取的基因组DNA浓度约为0.5μg,本发明的磁性纳米材料提取的人全血基因组的浓度更高。将使用本发明制备的一种磁性纳米材料提供的人全血基因组中提取的基因组DNA进行PCR扩增实验,PCR扩增了线粒体细胞色素氧化酶COI基因约680bp的DNA片段。该新型磁性纳米材料提取的人全血基因组DNA不影响后续的PCR实验。(The invention discloses a magnetic nano material and application thereof in extraction of human whole blood genome DNA, the magnetic nano material is prepared by dispersing, coating and drying zero-valent nano iron and graphene oxide, the concentration of genome DNA extracted from 100 mu l of human whole blood genome by the magnetic nano material is about 1 mu g, the concentration of genome DNA extracted from 100 mu l of human whole blood genome by a conventional kit method is about 0.5 mu g, and the concentration of human whole blood genome extracted by the magnetic nano material is higher. The genome DNA extracted from the human whole blood genome provided by the magnetic nano material prepared by the invention is subjected to PCR amplification experiment, and the DNA fragment of about 680bp of the mitochondrial cytochrome oxidase COI gene is amplified by PCR. The human whole blood genome DNA extracted by the novel magnetic nano material does not influence the subsequent PCR experiment.)

一种磁性纳米材料及其在提取人全血基因组DNA中的应用

技术领域

本发明属于纳米材料及其应用领域，特别涉及一种磁性纳米材料及其在提取人全血基因组DNA中的应用。

背景技术

DNA作为遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。提取基因组DNA是许多分子生物学实验的基础，在诸如基因组测序、Southern杂交、PCR扩增、构建BCA文库、分子克隆等常规实验中，获得高分子量、高纯度的基因组DNA是开展研究工作的重要前提。随着分子生物学技术的深入发展，在基因水平上对疾病进行检测、诊断已经成为临床诊断的一项基本技术手段；尤其是法医学中的个体识别、亲子鉴定等，对所提取基因组DNA的完整性及纯度要求更高。血液取材方便可靠，因此许多研究均以血液作为材料以提取完整的基因组DNA。而出于对实验成本、工作效率等多方面因素的考虑，研究人员希望尽可能一次性获取人全血基因组DNA，以进行长期保存，满足长期、反复、多种研究的需要。

基因组DNA提取一般需遵循以下几个原则：1、保证提取的DNA片段的完整性；2、纯化后不应存在对DNA有抑制作用的物质；3、尽量减少有机溶剂和金属离子污染；4、减少蛋白质、多糖、脂类等物质；5、减少其他核酸分子的污染。对于人全血基因组DNA提取，经典方法是用SDS、蛋白酶k消化，再用酚氯仿反复抽提，此过程不但用到了有毒的苯酚、氯仿，且操作繁琐、耗时耗力，极易造成样本的丢失和污染。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种磁性纳米材料及其在提取人全血基因组DNA中的应用，本发明的磁性纳米材料具有操作简便、提取的基因组DNA浓度较高、不影响后续的PCR实验等优势，本发明的具体内容如下：

本发明的目的在于提供一种磁性纳米材料，其技术点在于：所述的磁性纳米材料由零价纳米铁和氧化石墨烯经分散、包被和烘干制备而成。

在本发明的有的实施例中，所述的磁性纳米材料的制备方法如下：

步骤一：称取零价纳米铁和氧化石墨烯分别置于纯净水中进行超声分散处理，得到含有零价纳米铁的悬浊液和含有氧化石墨烯的悬浊液；

步骤二：将步骤一中得到的含有零价纳米铁的悬浊液和含有氧化石墨烯的悬浊液倒入到同一个烧杯中混合均匀得到混合悬浊液，然后将其放置在摇床上进行包被处理，最后将摇床处理后的混合悬浊液置于烘箱中进行干燥即得到所述的磁性纳米材料。

在本发明的有的实施例中，所述零价纳米铁为零价纳米铁与聚甲基丙烯酸甲酯的复合物。

在本发明的有的实施例中，一种磁性纳米材料得制备方法的步骤一中超声处理的条件为：1400-2000HZ，100-200W，超声时间为2-4h，超声的温度为40-60℃。

在本发明的有的实施例中，一种磁性纳米材料得制备方法的步骤一中含有零价纳米铁的悬浊液的浓度为600-800mg/L，所述含有氧化石墨烯的悬浊液的浓度为200-800mg/L。

在本发明的有的实施例中，一种磁性纳米材料得制备方法的步骤二中含有零价纳米铁的悬浊液和含有氧化石墨烯的悬浊液的重量之比为(2-5)：5。

在本发明的有的实施例中，一种磁性纳米材料得制备方法的步骤二中摇床设置的温度为40-60℃，摇床的转速为150-170rpm，所述包被时间为5-10min。

在本发明的有的实施例中，一种磁性纳米材料得制备方法的步骤二中烘箱的烘干温度为40-60℃，烘箱的烘干时间为1-6h。

本发明的另外一个目的在于提供一种磁性纳米材料的应用，其技术点在于：所述磁性纳米材料可从人全血基因组中快速提取到基因组DNA。

在本发明的有的实施例中，所述的采用磁性纳米材料提取人全血基因组DNA包括以下步骤：

步骤一：取80-120μL人全血样本加入到160-200μL的裂解液中，然后将其置于50-60℃水浴裂解8-12min；

步骤二：在步骤一所述的裂解液中加入5-15mg磁性纳米材料，再加入200-300μL的结合缓冲液，颠倒混匀0.5-2min后静置2-4min；

步骤三：用磁铁对步骤二处理后的液体进行磁分离，得到磁性纳米材料-DNA的复合体和上清液，去除上清液后，用60-80％乙醇洗涤所述的磁性纳米材料-DNA的复合体两次，干燥后加入100-300μLTE缓冲液，60-70℃水浴洗脱8-12min，随后10000-14000rpm离心0.6-1.4min，将上清液转移至新的EP管中，所述的EP管内即为提取的人全血基因组DNA；

采用磁性纳米材料提取人全血基因组DNA的方法步骤一中所述的裂解液中含有2wt％的SDS、5μL的RNA酶和5μL的蛋白酶；

采用磁性纳米材料提取人全血基因组DNA的方法步骤二中所述的结合缓冲液中含有15wt％的PEG8000和1.25mol/L的NaCl。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明的一种磁性纳米材料从100μl人全血基因组中提取的基因组DNA浓度约为1μg，而常规的试剂盒法从100μl人全血基因组中提取的基因组DNA浓度约为0.5μg，本发明的磁性纳米材料提取的人全血基因组的浓度更高。

2、将使用本发明制备的一种磁性纳米材料提供的人全血基因组中提取的基因组DNA进行PCR扩增实验，PCR扩增了线粒体细胞色素氧化酶COI基因约680bp的DNA片段。该新型磁性纳米材料提取的人全血基因组DNA不影响后续的PCR实验。

附图说明

图1为本发明的人全血中磁性纳米材料和试剂盒法提取的基因组DNA；

图2为本发明的人全血中提取的基因组DNA进行PCR扩增。

图1中，M：1kbmarker；

1,2：磁性纳米材料提取的人Na2EDTA抗凝全血基因组DNA；

3,4：磁性纳米材料提取的人肝素钠抗凝全血基因组DNA；

5,6：试剂盒法提取的人Na2EDTA抗凝全血基因组DNA；

7,8：试剂盒法提取的人肝素钠抗凝全血基因组DNA。

图2中，M：Marker；

1,2：磁性纳米材料提取的人EDTA-2Na抗凝全血基因组DNAPCR结果；

3,4：磁性纳米材料提取的人肝素钠抗凝全血基因组DNAPCR结果；

5,6：试剂盒法提取的人EDTA-2Na抗凝全血基因组DNAPCR结果；

7,8：试剂盒法提取的人肝素钠抗凝全血基因组DNAPCR结果；9:阴性对照。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种磁性纳米材料由零价纳米铁和氧化石墨烯经分散、包被和烘干制备而成，该磁性纳米材料制备方法如下：

步骤一：称取零价纳米铁和氧化石墨烯分别置于纯净水中进行超声分散处理(超声处理的条件为：1800HZ，150W，超声时间为3h，超声的温度为50℃)，得到浓度为700mg/L的含有零价纳米铁的浓度为500mg/L的悬浊液和含有氧化石墨烯的悬浊液；

步骤二：将步骤一中得到的含有零价纳米铁的悬浊液和含有氧化石墨烯的悬浊液(含有零价纳米铁的悬浊液：含有氧化石墨烯的悬浊液＝(3.5：5)倒入到同一个烧杯中混合均匀得到混合悬浊液，然后将其放置在摇床(摇床设置处理条件为：温度为50℃，转速为160rpm，所述包被时间为7.5min)上进行包被处理，最后将摇床处理后的混合悬浊液置于烘箱中进行干燥(烘箱干燥条件为：温度为50℃，烘干时间为3.5h)即得到所述的磁性纳米材料。

本发明的磁性纳米材料可从人全血基因组中快速提取到基因组DNA，采用磁性纳米材料提取人全血基因组DNA包括以下步骤：

步骤一：取100μL人全血样本加入到180μL的裂解液(裂解液中含有2wt％的SDS、5μL的RNA酶和5μL的蛋白酶)中，然后将其置于55℃水浴裂解10min；

步骤二：在步骤一所述的裂解液中加入10mg磁性纳米材料，再加入250μL的结合缓冲液(结合缓冲液中含有15wt％的PEG8000和1.25mol/L的NaCl)，颠倒混匀1min后静置3min；

步骤三：用磁铁对步骤二处理后的液体进行磁分离，得到磁性纳米材料-DNA的复合体和上清液，去除上清液后，用70％乙醇洗涤所述的磁性纳米材料-DNA的复合体两次，干燥后加入200μLTE缓冲液，65℃水浴洗脱10min，随后12000rpm离心1min，将上清液转移至新的EP管中，所述的EP管内即为提取的人全血基因组DNA。

实施例2

一种磁性纳米材料由零价纳米铁和氧化石墨烯经分散、包被和烘干制备而成，该磁性纳米材料制备方法如下：

步骤一：称取零价纳米铁和氧化石墨烯分别置于纯净水中进行超声分散处理(超声处理的条件为：1400HZ，100W，超声时间为4h，超声的温度为60℃)，得到浓度为600mg/L的含有零价纳米铁的浓度为200mg/L的悬浊液和含有氧化石墨烯的悬浊液；

步骤二：将步骤一中得到的含有零价纳米铁的悬浊液和含有氧化石墨烯的悬浊液(含有零价纳米铁的悬浊液：含有氧化石墨烯的悬浊液＝(5：5)倒入到同一个烧杯中混合均匀得到混合悬浊液，然后将其放置在摇床(摇床设置处理条件为：温度为40℃，转速为170rpm，包被时间为10min)上进行包被处理，最后将摇床处理后的混合悬浊液置于烘箱中进行干燥(烘箱干燥条件为：温度为40℃，烘干时间为6h)即得到所述的磁性纳米材料。

本发明的磁性纳米材料可从人全血基因组中快速提取到基因组DNA，采用磁性纳米材料提取人全血基因组DNA包括以下步骤：

步骤一：取80μL人全血样本加入到160μL的裂解液(裂解液中含有2wt％的SDS、5μL的RNA酶和5μL的蛋白酶)中，然后将其置于50℃水浴裂解8min；

步骤二：在步骤一所述的裂解液中加入5mg磁性纳米材料，再加入200μL的结合缓冲液(结合缓冲液中含有15wt％的PEG8000和1.25mol/L的NaCl)，颠倒混匀0.5min后静置4min；

步骤三：用磁铁对步骤二处理后的液体进行磁分离，得到磁性纳米材料-DNA的复合体和上清液，去除上清液后，用60％乙醇洗涤所述的磁性纳米材料-DNA的复合体两次，干燥后加入100μLTE缓冲液，60℃水浴洗脱8min，随后10000rpm离心0.6min，将上清液转移至新的EP管中，所述的EP管内即为提取的人全血基因组DNA。

实施例3

一种磁性纳米材料由零价纳米铁和氧化石墨烯经分散、包被和烘干制备而成，该磁性纳米材料制备方法如下：

步骤一：称取零价纳米铁和氧化石墨烯分别置于纯净水中进行超声分散处理(超声处理的条件为：2000HZ，200W，超声时间为2h，超声的温度为40℃)，得到浓度为800mg/L的含有零价纳米铁的浓度为800mg/L的悬浊液和含有氧化石墨烯的悬浊液；

步骤二：将步骤一中得到的含有零价纳米铁的悬浊液和含有氧化石墨烯的悬浊液(含有零价纳米铁的悬浊液：含有氧化石墨烯的悬浊液＝(1：1)倒入到同一个烧杯中混合均匀得到混合悬浊液，然后将其放置在摇床(摇床设置处理条件为：温度为60℃，转速为150rpm，包被时间为10min)上进行包被处理，最后将摇床处理后的混合悬浊液置于烘箱中进行干燥(烘箱干燥条件为：温度为60℃，烘干时间为1h)即得到所述的磁性纳米材料。

本发明的磁性纳米材料可从人全血基因组中快速提取到基因组DNA，采用磁性纳米材料提取人全血基因组DNA包括以下步骤：

步骤一：取120μL人全血样本加入到200μL的裂解液(裂解液中含有2wt％的SDS、5μL的RNA酶和5μL的蛋白酶)中，然后将其置于60℃水浴裂解12min；

步骤二：在步骤一所述的裂解液中加入15mg磁性纳米材料，再加入300μL的结合缓冲液(结合缓冲液中含有15wt％的PEG8000和1.25mol/L的NaCl)，颠倒混匀2min后静置2min；

步骤三：用磁铁对步骤二处理后的液体进行磁分离，得到磁性纳米材料-DNA的复合体和上清液，去除上清液后，用80％乙醇洗涤所述的磁性纳米材料-DNA的复合体两次，干燥后加入300μLTE缓冲液，70℃水浴洗脱12min，随后14000rpm离心0.6min，将上清液转移至新的EP管中，所述的EP管内即为提取的人全血基因组DNA。

实验例

以实施例1为例，采用电泳和紫外定量实施例1中提取得到的人全血基因组DNA，结果见图1和图2，图1显示磁性纳米材料能从人全血中提取到人全血基因组DNA。紫外定量结果显示，磁性纳米材料从100μl人全血基因组中提取的基因组DNA浓度约为1μg，试剂盒法从100μl人全血基因组中提取的基因组DNA浓度约为0.5μg，试剂盒法提取的基因组浓度与说明书中的描述接近。图2显示对提取的人全血提取基因组DNA进行PCR扩增实验，PCR扩增了线粒体细胞色素氧化酶COI基因约680bp的DNA片段。图2显示条带清晰，说明本发明的磁性纳米材料提取的人全血基因组DNA不影响后续的PCR实验。

本发明仅仅提供了一种磁性纳米材料及其在提取人全血基因组DNA中的应用，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围，本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。