阅读说明：本技术 一种仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂及应用 (Piglet intestinal health regulation and control active peptide feed additive and application thereof ) 是由 徐求文 金妙仁 楼伟杰 于晓莹 洪奇华 于 2019-11-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂及应用,所述活性肽饲料添加剂按如下方法制备：将谷朊粉和蚕蛹粉混合并加水搅拌均匀,再加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶,调节pH至7.0-8.0,在50-55℃条件下酶解30-60min,获得酶解物；将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母接种至由酶解物配制的固态发酵培养基中,33～37℃共混发酵培养30～45小时,发酵混合物干燥,获得所述的活性肽饲料添加剂；应用本发明的仔猪肠道健康调控活性肽,能防止仔猪断奶后1～7天肠黏膜绒毛过度萎缩和隐窝的加深,可显著提高断奶后8～14天肠黏膜绒毛高度。(The invention discloses a piglet intestinal health regulation active peptide feed additive and application thereof, wherein the active peptide feed additive is prepared by the following method: mixing wheat gluten and pupa Bombycis powder, adding water, stirring, adding papain and trypsin, adjusting pH to 7.0-8.0, and performing enzymolysis at 50-55 deg.C for 30-60min to obtain zymolyte; inoculating bacillus subtilis and saccharomyces cerevisiae into a solid fermentation culture medium prepared from zymolyte, performing blending fermentation culture at 33-37 ℃ for 30-45 hours, and drying a fermentation mixture to obtain the active peptide feed additive; by applying the piglet intestinal health regulation active peptide, excessive shrinkage of intestinal mucosa villi and deepening of crypt after piglets weaning for 1-7 days can be prevented, and intestinal mucosa villi height after weaning for 8-14 days can be remarkably improved.)

一种仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂及其制备方法与应用。

(二)背景技术

早期断奶能提高母猪的繁殖力，增加母猪的年产仔数，减少由母体向仔猪的疾病传播，并能提高生长猪的生产性能和胴体品质，同时可使产房等设备的利用率提高。但早期断奶带来的一个重要问题是如何提高断奶仔猪的生长性能，仔猪断奶后日粮的性质发生了重大变化，而仔猪消化道尚未发育完全、消化酶活性不足、免疫功能也尚未发育成熟，而且断奶不仅关系到生理的变化、心理、环境和营养状况也发生了变化，因而常表现为食欲差、消化功能紊乱、腹泻、生长迟滞、饲料利用率低等所谓的“仔猪早期断奶综合症”。

大量研究表明谷氨酰胺(GLN)是肠道细胞的燃料，是合成细胞分化所必需的嘌呤和嘧啶核苷酸的前体，是肠系膜淋巴和上皮淋巴细胞和重要能量底物，是维持与肠道相关的淋巴组织的必需成份，也是合成肠道分泌免疫球蛋白质的必需物质，在维持肠道正常功能和提高肠道免疫力方面起着重要的作用(James,1998)。而且GLN是猪乳中含量最丰富的氨基酸，断奶后GLN供应量减少是仔猪早期断奶综合症产生的最根本的原因(Alverdy,1990)。外源性小分子活性肽，能减少游离氨基酸的吸收竞争、促进激素的分泌、促进矿物质元素的吸收和利用，提高机体免疫功能，提高生产性能。因此，富含GLN和活性小肽的饲料添加剂对缓解“仔猪早期断奶综合症”有显著作用。

(三)

发明内容

本发明的目的是提供一种仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂及其制备方法与应用，本发明利用酶解、微生物发酵等方法提升谷朊粉和蚕蛹粉的营养功能，在仔猪饲料中应用能促进仔猪肠道健康，显著提高断奶仔猪的平均日增重，降低仔猪断奶腹泻率。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂，所述活性肽饲料添加剂按如下方法制备：(1)将谷朊粉和蚕蛹粉混合并加水搅拌均匀，再加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，调节pH至7.0-8.0，在50-55℃条件下酶解30-60min，获得酶解物；(2)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种至由步骤(1)酶解物配制的固态发酵培养基中，33～37℃共混发酵培养30～45小时，发酵混合物干燥，获得所述的活性肽饲料添加剂；固态发酵培养基质量组成：50～65％的酶解物，KH₂PO₄ 0.15～0.25％，麸皮29.35～40.25％，豆粕2～4.5％，糖蜜2～3％和尿素1.5～2％。

步骤(1)中蚕蛹粉与谷朊粉质量比为1:5-10；所述水加入量为谷朊粉和蚕蛹粉总重量的3-5倍；木瓜蛋白酶加入量为谷朊粉和蚕蛹粉总重量的1～1.5％，胰蛋白酶加入量为谷朊粉和蚕蛹粉总重量的0.5～1％。所述木瓜蛋白酶酶活为8-10万U/g，所述胰蛋白酶酶活为3000-4000U/g。

步骤(1)所述酶解在400W、25kHz超声辅助下进行。

步骤(2)中枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC01185，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心；接种量可不受限制，通常选择其常规接种量即可。优选的，以固态发酵培养基干重质量计，枯草芽孢杆菌接种量为2.5～50×10⁷cfu/g。

步骤(2)中所述酿酒酵母为(Saccharomyces cerevisiae)ACCC20042，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，接种量可不受限制，通常选择其常规接种量即可。优选的，以固态发酵培养基干重质量计，酿酒酵母接种量为1.5～3.6×10⁷cfu/g。

步骤(2)所述枯草芽孢杆菌以种子液形式接种，所述种子液按如下方法制备：将枯草芽孢杆菌接种至斜面培养基，37℃培养24h，得到斜面菌种；从斜面接一环菌苔至装有50ml种子培养基的300ml三角瓶种，置35-37℃控温摇床培养，转速220r/min，培养24-26h，即为枯草芽孢杆菌种子液；斜面培养基组成为：蛋白胨10g/L、牛肉提取物3g/L、NaC1 5g/L、琼脂20g/L、溶剂为蒸馏水，pH值7.0；种子培养基组成为：葡萄糖2g/L，NaC1 5g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨l0 g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0。

步骤(2)所述酿酒酵母以酵母种子液的形式加入，所述种子液按如下方法制备：酿酒酵母原菌试管——小三角瓶种子(麦芽糖糖液100ml，糖度7～8°Be)，30-32℃保温培养12h——转入大三角瓶(麦芽糖糖液600ml，糖度7～8°Be)，30-32℃保温培养12h——转入卡氏罐内(糖水12kg，糖度7～8°Be扩大培养)30-32℃培养12h——将卡氏罐酵母种子在酒母缸扩培(培养基为每缸放清水300kg，谷粉30kg，麸皮10kg)30-32℃培养时间18-20h，即为酵母种子液。

步骤(2)干燥至含水量质量浓度不大于10％。

本发明还提供一种仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂在仔猪饲料中的应用，所述饲料为调控仔猪肠道健康的饲料。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明从仔猪的消化生理发育特点入手，应用营养与免疫调控手段，将谷朊粉和蚕蛹粉的组合酶解发酵，成功研制了一种仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂。应用本发明的仔猪肠道健康调控活性肽，能防止仔猪断奶后1～7天肠黏膜绒毛过度萎缩和隐窝的加深，可显著提高断奶后8～14天肠黏膜绒毛高度。应用本发明的仔猪肠道健康调控活性肽，能显著提高断奶仔猪的平均日增重，降低仔猪断奶腹泻率，具有显著的经济效益和社会效益，市场前景广阔。

(四)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

1、菌种的种曲制备

(1)枯草芽孢杆菌种子液的制备

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC01185(购自中国农业微生物菌种保藏管理中心)接种至斜面培养基，37℃培养24h，得到斜面菌种；

每300ml三角瓶装量50ml种子培养基，在120℃条件下灭菌30min，降温后从斜面接一环菌苔至种子培养基，置37℃控温摇床培养，转速220r/min，培养24h，即为枯草芽孢杆菌种子液。

斜面培养基组成为：蛋白胨1g、牛肉提取物0.3g、NaC1 0.5g、琼脂2.0g、蒸馏水100ml，pH值7.0。

种子培养基组成为：葡萄糖0.2g，NaC1 0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨l g，蒸馏水100mL，pH 7.0。

(2)酵母种曲

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC20042(购自中国农业微生物菌种保藏管理中心)按如下条件培养：

原菌试管——小三角瓶种子(麦芽糖糖液100ml，糖度7～8°Be)，30℃保温培养12h——转入大三角瓶(麦芽糖糖液600ml，糖度7～8°Be)，30℃保温培养12h——转入卡氏罐内(糖水12kg，糖度7～8°Be扩大培养)30℃培养12h——将卡氏罐酵母种子在酒母缸扩培(培养基为每缸放清水300kg，谷粉30kg，麸皮10kg)，30℃培养20h，即为酵母种子液。

2、酶解

(1)谷朊粉(购自安徽省碧绿春生物科技有限公司)和蚕蛹粉(购自武汉嘉瑞恒立化工有限公司)各自粉碎至40目，取粉碎后的谷朊粉按照质量比5:1与蚕蛹粉混合，按谷朊粉和蚕蛹粉混合物总质量3倍的比例向混合物中加水，搅拌均匀；

(2)向步骤(1)中加入木瓜蛋白酶(酶活8万U/g，购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司)和胰蛋白酶(酶活3000U/g，购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司)，其中木瓜蛋白酶添加量为谷朊粉和蚕蛹粉混合物总质量的1％，胰蛋白酶添加量为谷朊粉和蚕蛹粉混合物总质量的0.5％，调节pH至7.0。

(3)超声波辅助酶解：控制酶解温度50℃条件下，在超声波辅助作用下(400W，25kHz)酶解30min，得到酶解物。

3、固态发酵培养基制备

固态发酵培养基质量组成：步骤2制备的酶解物50％，KH₂PO₄ 0.25％，麸皮40.25％，豆粕4.5％，糖蜜3％和尿素2％。混合搅拌均匀，在121℃灭菌30min，得到固态发酵培养基。

麸皮是小麦加工面粉后得到的副产品，是配合饲料中常用原料。豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产品，是配合饲料常用原料。糖蜜是制糖工业的副产品，是发酵常用底物或基料。

4、接种

将上述灭菌处理的固态发酵培养基1000g，通风吹冷至33℃，接种步骤1制备的枯草芽孢杆菌种子液，活菌数达到2.5×10⁷cfu/g(以固态发酵培养基干重计，下同)，接种酿酒酵母种子液，活菌数达到1.5×10⁷cfu/g，搅拌均匀，抹平料面，保温培养，在35℃发酵培养30h。

5、干燥

采用低温干燥，前5小时发酵混合物温度控制在38℃内，5小时后控制在45℃内，烘干至水分质量浓度为10％，粉碎到细度40目，得到仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂620g。

实施例2

1.菌种的种曲制备

(1)枯草芽孢杆菌种子液：

将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC01185(购自中国农业微生物菌种保藏管理中心)接种至斜面培养基，37℃培养24h，得到斜面菌种；每300ml三角瓶装量50ml种子培养基，在120℃条件下灭菌30min，降温后从斜面接一环菌苔至种子培养基，置35℃控温摇床培养，转速220r/min，培养26h，即为枯草芽孢杆菌种子液。

斜面培养基为：蛋白胨1g、牛肉提取物0.3g、NaC1 0.5g、琼脂2.0g、蒸馏水100ml，pH值7.0。

种子培养基为：葡萄糖0.2g，NaC1 0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨l g，蒸馏水100mL，pH7.0。

(2)酿酒酵母种子液

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC20042(购自中国农业微生物菌种保藏管理中心)按如下步骤发酵：

原菌试管——小三角瓶种子(麦芽糖糖液100ml，糖度7～8°Be，30℃保温培养12h——转入大三角瓶(麦芽糖糖液600ml，糖度7～8°Be)，30℃保温培养12h——转入卡氏罐内(糖水12kg，糖度7～8°Be扩大培养)32℃培养12h——将卡氏罐酵母种子在酒母缸扩培(培养基为每缸放清水300kg，谷粉30kg，麸皮10kg)，30℃培养时间18h，即为酵母种子液。

2、酶解

(1)谷朊粉(购自安徽省碧绿春生物科技有限公司)和蚕蛹粉(购自武汉嘉瑞恒立化工有限公司)分别粉碎至40目，取粉碎后谷朊粉按质量比7.5:1与蚕蛹粉混合，按谷朊粉和蚕蛹粉混合物质量4倍的比例向混合物中加水，搅拌均匀；

(2)向步骤(1)加入木瓜蛋白酶(酶活9万U/g，购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司)和胰蛋白酶(酶活3500U/g，购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司)，其中木瓜蛋白酶添加量为谷朊粉和蚕蛹粉混合物总质量的1.25％，胰蛋白酶添加量为谷朊粉和蚕蛹粉混合物总质量的0.75％，调节pH至7.5。

(3)超声波辅助酶解：控制酶解温度52.5℃条件下，在超声波辅助作用下(400W，25kHz)酶解45min，得到酶解物。

3、固态发酵培养基制备

固态发酵培养基质量组成：步骤2制备的酶解物57.5％，KH₂PO₄ 0.2％，麸皮34.8％，豆粕3.25％，糖蜜2.5％和尿素1.75％。配制方法同实施例1。

4、接种

将上述灭菌的固态发酵培养基1000g，通风吹冷至34℃，接种枯草芽孢杆菌种子液，活菌数达到26.25×10⁷cfu/g(以固态发酵培养基干重计，下同)，接种酿酒酵母种子液，活菌数达到2.55×10⁷cfu/g，搅拌均匀，抹平料面，保温培养，在36℃发酵培养37.5h，获得发酵混合物。

5、干燥

采用低温干燥，前5小时发酵混合物温度控制在38℃内，5小时后控制在45℃内，烘干至水分质量浓度10％，粉碎到细度40目，得到仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂530g。

实施例3

1、菌种的种曲制备

(1)枯草芽孢杆菌种子液

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC01185(购自中国农业微生物菌种保藏管理中心)接种至斜面培养基，37℃培养24h，得到斜面菌种；

每300ml三角瓶装量50ml种子培养基，在120℃条件下灭菌30min，降温后从斜面接一环菌苔至种子培养基，置36℃控温摇床培养，转速220r/min，培养25h，即为枯草芽孢杆菌种子液。

斜面培养基为：蛋白胨1g、牛肉提取物0.3g、NaC1 0.5g、琼脂2.0g、蒸馏水100ml，pH值7.0。

种子培养基为：葡萄糖0.2g，NaC1 0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨l g，蒸馏水100mL，pH7.0。

(2)酵母种子液

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC20042(购自中国农业微生物菌种保藏管理中心)按如下方法培养：

原菌试管——小三角瓶种子(麦芽糖糖液100ml，糖度7～8°Be，30℃保温培养12h——转入大三角瓶(麦芽糖糖液600ml，糖度7～8°Be)，30℃保温培养12h——转入卡氏罐内(糖水12kg，糖度7～8°Be扩大培养)31℃培养12h——将卡氏罐酵母种子在酒母缸扩培(培养基为每缸放清水300kg，谷粉30kg，麸皮10kg)，30℃培养时间19h，即为酵母种子液。

2、酶解

(1)谷朊粉(购自安徽省碧绿春生物科技有限公司)和蚕蛹粉(购自武汉嘉瑞恒立化工有限公司)分别粉碎至40目，取粉碎后的谷朊粉按质量比10:1与蚕蛹粉混合，按谷朊粉和蚕蛹粉混合物质量5倍的比例向混合物中加水，搅拌均匀；

(2)向步骤(1)加入木瓜蛋白酶(酶活10万U/g，购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司)和胰蛋白酶(酶活3500U/g，购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司)，其中木瓜蛋白酶添加量为谷朊粉和蚕蛹粉混合物总质量的1.5％，胰蛋白酶添加量为谷朊粉和蚕蛹粉混合物总质量的1％，调节pH至8.0。

(3)超声波辅助酶解：控制酶解温度55℃条件下，在超声波辅助作用下(400W，25kHz)酶解60min，得到酶解物。

3、固态发酵培养基制备

固态发酵培养基质量组成：65％步骤2制备的酶解物，KH₂PO₄ 0.15％，麸皮29.35％，豆粕2％，糖蜜2％和尿素1.5％。制备方法同实施例1。

4、接种

将上述灭菌处理的固态发酵培养基1000g，通风吹冷至35℃，接种枯草芽孢杆菌种子液，活菌数达到5×10⁸cfu/g(以固态发酵培养基干重计，下同)，接种酿酒酵母种子液，活菌数达到3.6×10⁷cfu/g，搅拌均匀，抹平料面，保温培养，在37℃发酵培养45h，获得发酵混合物。

5、干燥

采用低温干燥，前5小时发酵混合物温度控制在38℃内，5小时后控制在45℃内，烘干至水分质量浓度10％，粉碎到细度40目，得到仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂450g。

实施例4

选取杜大长28日龄断奶仔猪60头，按胎次、体重相近和公母基本一致分成2组，分别饲养于条件一致的密闭式保育猪舍内。对照组饲喂基础日粮，试验组用0.5％(按实施例1制备)仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂替代基础日粮中0.5％鱼粉，每组三个重复，每个重复10头，试验仔猪均采用干湿饲喂器饲喂，相邻两栏合用一个干湿饲喂器，一个饲喂器为一个重复，断奶仔猪均饲养于保育舍猪舍，至49日龄结束，为期21天。

表1试验基础日粮组成及营养水平

注：复合预混料每千克饲粮提供：VA 6500IU，VD₃ 2000IU，VE 42IU，VK₃ 2mg，VB₁2mg，VB₂ 6.2mg，VB₆ 3mg，VB₁₂ 24mg，生物素160mg，Fe 150mg，Cu 100mg，Zn 150mg，Mn30mg，I 0.25mg，Se 0.3mg。

仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂能显著提高断奶仔猪生产性能(见表2)。

表2仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂对断奶仔猪生产性能的影响

注：小写字母ab不同表示各试验组之间差异显著(P<0.05)，下同。

仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂能显著降低断奶仔猪腹泻率(见表3)。

表3仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂对断奶仔猪腹泻率的影响(％)

注：大写字母AB不同表示各试验组之间差异显著(P<0.01)，下同。

仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂能显著改善断奶仔猪黏膜形态(见表4)。

表4仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂对断奶仔猪黏膜形态的影响

实施例5

选取杜大长28日龄断奶仔猪80头，按胎次、体重相近和公母基本一致分成2组，分别饲养于条件一致的密闭式保育猪舍内。对照组饲喂基础日粮(同表1)，试验组用0.5％(按实施例2制备)仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂替代基础日粮中0.5％鱼粉，每组四个重复，每个重复10头，试验仔猪均采用干湿饲喂器饲喂，相邻两栏合用一个干湿饲喂器，一个饲喂器为一个重复，断奶仔猪均饲养于保育舍猪舍，至49日龄结束，为期21天。仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂能显著提高断奶仔猪生产性能(见表5)。

表5仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂对断奶仔猪生产性能的影响

注：小写字母不同表示各试验组之间差异显著(P<0.05)，下同。

仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂能显著降低断奶仔猪腹泻率(见表6)。

表6仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂对断奶仔猪腹泻率的影响(％)

仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂能显著改善断奶仔猪黏膜形态(见表7)。

表7仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂对断奶仔猪黏膜形态的影响

实施例6

选取杜大长28日龄断奶仔猪72头，按胎次、体重相近和公母基本一致分成2组，分别饲养于条件一致的密闭式保育猪舍内。对照组饲喂基础日粮(同表1)，试验组用0.5％(按实施例3制备)仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂替代基础日粮中0.5％鱼粉，每组三个重复，每个重复12头，试验仔猪均采用干湿饲喂器饲喂，相邻两栏合用一个干湿饲喂器，一个饲喂器为一个重复，断奶仔猪均饲养于保育舍猪舍，至49日龄结束，为期21天。仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂能显著提高断奶仔猪生产性能(见表8)。

表8仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂对断奶仔猪生产性能的影响

注：小写字母不同表示各试验组之间差异显著(P<0.05)，下同。

仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂能显著降低断奶仔猪腹泻率(见表9)。

表9仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂对断奶仔猪腹泻率的影响(％)

仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂能显著改善断奶仔猪黏膜形态(见表10)。

表10仔猪肠道健康调控活性肽饲料添加剂对断奶仔猪黏膜形态的影响