阅读说明：本技术 一种羽毛粉添加剂、制备方法及其应用 (A kind of feather flour additive agent, preparation method and applications ) 是由 彭楠 刘玲 常章兵 田建平 梁运祥 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：一种羽毛粉添加剂、制备方法及其应用；属于饲料添加剂加工技术领域,本发明的添加剂采用以下步骤制备：(1)羽毛粉的制备(2)固态酶解；(3)过滤烘干；该方法以家禽的羽毛为原料进行粉碎,然后使用固态酶解方式,以羽毛粉为原料,料水比为1:0.5,石灰调PH到9.0,温度55℃,固态酶解24h,最后经过滤烘干获得添加剂；本发明操作工艺简单,酶解温度较低,PH作用范围更广,扩大了工艺使用领域；本发明酶解成本低,酶解效率高,并且酶解上清液可溶性蛋白含量较高,同时含有多种含量较高的氨基酸成分,降低了生产成本,提高了综合经济效益,满足工业化生产的需要；本发明可应用于饲料中。(A kind of feather flour additive agent, preparation method and applications；Belong to feed addictive processing technique field, additive of the invention is prepared using following steps: (1) preparation (2) solid enzymatic hydrolysis of feather meal；(3) filtering drying；This method is crushed using the feather of poultry as raw material, then uses solid enzymatic hydrolysis mode, using feather meal as raw material, material-water ratio 1:0.5, lime tune PH to 9.0,55 DEG C of temperature, solid enzymatic hydrolysis for 24 hours, finally obtains additive through filtering drying；Operation of the present invention simple process, hydrolysis temperature is lower, and PH sphere of action is wider, expands technique and uses field；Present invention enzymatic hydrolysis is at low cost, and enzymolysis efficiency is high, and it is higher to digest supernatant soluble protein content, while containing there are many higher aminoacid ingredients of content, reducing production cost, increasing comprehensive economic efficiency, meeting the needs of industrialized production；Present invention can apply in feed.)

一种羽毛粉添加剂、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于动物饲料添加剂制备技术领域，具体涉及一种羽毛粉添加剂、制备方法及其应用。

背景技术

家禽养殖业是我国畜牧业的支柱产业之一，鸡、鸭、鹅羽毛产量非常丰富，年产量高达百万吨以上。所以，羽毛粉是一种常用的蛋白饲料原料，其粗蛋白质在80％以上，富含动物多种必需氨基酸，氨基酸总和大于70％，含硫氨基酸含量高，在饲料中具有较高的利用价值，但由于羽毛的双硫键蛋白结构难以被动物消化吸收，严重影响其开发利用，所以在蛋白质资源如此匮乏的今天，充分利用羽毛蛋白资源就显得非常重要。

目前我国处理羽毛粉大多使用的是气爆酶解法，该方法虽然通过有效的气爆处理，破坏了羽毛蛋白的稳定空间结构，使其转化为可溶性的小肽和氨基酸，进而生物学效价可获得很大的提高。但这种方法在操作过程中存在一定的安全隐患，且对羽毛粉中的氨基酸破坏大，最终所得粗蛋白含量仅90％。

发明内容

本发明针对上述技术问题，提供了一种羽毛粉添加剂、制备方法及其应用。其工艺简单、酶解效率高。

本发明为实现上述目的，采用的技术方案如下：

技术方案一：

一种固态酶解法制备羽毛粉添加剂的方法，包括如下步骤：

(1)固态酶解：将羽毛粉加水搅拌，其中料液比为1:0.5-0.6；调整PH至7-9，在62-68℃条件下加入耐高温蛋白酶；酶解时间为3-5h，得酶解反应液；

(2)过滤烘干：将酶解反应液过滤，滤液经浓缩干燥后即得羽毛粉添加剂。

进一步的，所述羽毛粉的制备方法如下：将羽毛清洗、除杂、剪碎、晾干，然后再高温高压条件下经蒸汽灭菌；然后经过后处理、沥干、干燥，最后进行粉碎、研磨、过筛后得羽毛粉。优选的所述高温为120℃高温，蒸汽灭菌时间为40min；干燥过程为80℃恒温干燥箱干燥，干燥时间12h。

作为本发明的进一步改进，所述耐高温蛋白酶由巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)AN-PK-9K-GS115代谢产物分离所得。获取过程如下：将巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115通过甲醇补料发酵后，将发酵液经过板框过滤，再进一步喷雾干燥制成粉末状酶制剂。耐高温蛋白酶活力大于等于50000U/mL，小于等于100000U/mL，比活力大于等于3000U/mg，小于等于5000U/mg。

进一步的，所述耐高温蛋白酶的氨基酸序列表如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，编码由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的耐高温蛋白酶的编码基因。

进一步的，编码基因由SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成的耐高温蛋白酶基因。

作为本发明的进一步改进，巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)AN-PK-9K-GS115，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019593。所述巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115形态及生理生化特征包括：呈乳白色，菌体镜检呈椭圆形或圆形，为甲醇营养型菌。

作为本发明的进一步改进，所述的巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115通过如下方法进行选育：

A、以枯草芽孢杆菌为原始基因来源；优选的所述枯草芽孢杆菌为商购产品；进一步优选，所述枯草芽孢杆菌为购买自北京三药的枯草芽孢杆菌，菌株货号为SP02568；

B、利用重叠延伸PCR技术获得目的基因序列Fpk；重叠延伸PCR技术即采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来；

C、将目的基因***表达载体：***构建的常规的巴斯德毕赤酵母表达载体p9kNTS、p9kMFⅡ，***位点为EcoR1/Not1：

D、将上述表达载体进行重组和线性化；

E、电转化巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115：经重组和线性化后，电转化；

F、初筛、复筛，最后获得目标菌株。

作为本发明的进一步改进，所述的步骤F具体过程为：摇瓶酶活测定筛选，以筛选到的p9kNTS-Fpk-GS115作为宿主菌，将重组质粒p9kNTS-Fpk、p9kMFⅡ-Fpk线性化后进行二次电转化，再依次进行10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL的G418梯度高拷贝筛选，并利用福林酚比色法进行蛋白酶酶活检测，获得目标菌株。G418(Geneticin,遗传霉素)是一种氨基糖苷类抗生素,在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座子Tn601，Tn5的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞产生毒素,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。当neo基因被整合进真核细胞DNA后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

技术方案二：

由上述方法制备的羽毛粉添加剂。

技术方案三：

上述羽毛粉添加剂在动物饲料中的应用，尤其是在家禽饲料中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

本发明的羽毛粉添加剂制备方法采用固态酶解法，酶解过程固体含量高，因而酶解产物浓度高，有利于降低产物分离成本；固态酶解法还具有废水排放少及相应处理费用低、清洁和低能耗等特点；本发明酶解过程比较温和，酶解温度较低，酶解温度较低，PH作用范围更广，操作工艺简单，扩大了工艺使用领域，满足工业化生产的需要。本发明对羽毛粉的处理温和无污染，不会破坏羽毛粉中的营养成分，具有较好的应用前景。本分明对羽毛粉的充分利用，可以有效缓解饲料蛋白质资源的不足，促进畜牧业和饲料产业的发展。

本发明所使用的耐高温蛋白酶在20～80℃的条件下具有活性和热稳定性，在65℃条件下，活性可保持3h不变，在40～50℃的条件下，24h后有60％以上的活性；在pH 6～11范围内均有活性，当pH7～9时24h内酶活性保存率为100％；可以有效水解羽毛粉，将其中蛋白质组分高效降解为小肽成分或者氨基酸成分，从而提高蛋白质的消化率，增加采食量，提高动物健康水平。

本发明酶解处理后的可溶性蛋白的含量大幅提高，其中……为人体必需氨基酸，可加工为氨基酸产品和饲料添加蛋白，更易于动物体消化吸收。

本发明所述的巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115(pichia pastoris AN-PK-9K-GS115)是由毕赤酵母通过基因工程手段改造而成的，其形态及生理生化特征包括：呈乳白色，菌体镜检呈椭圆形或圆形，为甲醇营养型菌。可以产生能够有效水解羽毛粉的耐高温蛋白酶。

为进一步提高羽毛粉的水解效果，在水解过程中可以添加镁离子溶液。

本发明的巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115(pichia pastoris AN-PK-9K-GS115)，保藏中心保藏编号为：CCTCC NO:M 2019593保藏日期为2019年7月30日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所述的枯草芽孢杆菌为市售产品，以下实施例均为购买的北京三药的枯草芽孢杆菌，货号：SP02568,规格：103cfu/颗；有效期：12个月；储存：-20℃或-20℃以下；菌株来源：由中国医学细菌保藏管理中心(National Center For Medical CultureCollections,CMCC)提供的0代菌种生产；传代次数：第4代。

实施例1：

本实施例所述巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115通过如下方法进行选育：

A、以枯草芽孢杆菌为原始基因来源；

B、利用重叠延伸PCR技术获得目的基因序列Fpk；重叠延伸PCR技术即采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来；

进行PCR扩增过程中条件如下：(含10倍缓冲液以及Taq酶，dNTP等In-Fusion试剂盒)获得目的基因序列Fpk(如SEQ ID NO:1所示)；

引物F：5’-ctcctgccaagctgaagc-3’，

引物R：5’-gatcatggaacggattc-3’，

扩增程序：95℃2min；95℃30s，56℃30s，72℃1min，45个循环；72℃5min；4℃保存；

C、将目的基因***表达载体：***构建的常规的巴斯德毕赤酵母表达载体p9kNTS、p9kMFⅡ；

D、将上述表达载体进行重组和线性化；

E、电转化巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115：经重组和线性化后，电转化；

F、摇瓶酶活测定筛选，以筛选到的p9kNTS-Fpk-GS115作为宿主菌，将重组质粒p9kNTS-Fpk、p9kMFⅡ-Fpk线性化后进行二次电转化，再依次进行10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL的G418梯度高拷贝筛选，并利用福林酚比色法进行蛋白酶酶活检测，获得目标菌株。

用目标菌株获取耐高温蛋白酶：将巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115通过甲醇补料发酵后，从发酵液中提取耐高温蛋白酶。通过酶活测定筛选得到耐高温蛋白酶，筛选条件：耐高温蛋白酶活力大于等于50000U/mL，小于等于100000U/mL，比活力大于等于3000U/mg，小于等于5000U/mg。

用耐高温蛋白酶通过固态酶解法制备羽毛粉添加剂，包括如下步骤：

(1)将羽毛清洗、除杂、剪碎、晾干，然后再120℃高温高压条件下经蒸汽灭菌40min；然后经过后处理、沥干、80℃恒温干燥箱中干燥，干燥时间12h，最后进行粉碎、研磨、过筛后得羽毛粉。

实施例1：

以上述羽毛粉为原料，向其中加水，料水比1:0.5，石灰调pH到9.0，温度55℃，酶活1500U/g，固态酶解24h，得酶解反应液，经检测，50％的总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中34％为酸溶蛋白，氨态氮含量为1.9％。将酶解反应液经浓缩干燥后即得羽毛粉添加剂。

实例2：

将上述羽毛粉用NaOH溶液浸泡处理，在料水比1:0.5、酶活1500U/g、温度65℃、pH9.0条件下固态酶解3h，得酶解反应液，经检测，55％总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中46％为酸溶蛋白，氨态氮的含量为2.2％。将酶解反应液经浓缩干燥后即得羽毛粉添加剂。

实例3：

羽毛粉用NaOH溶液浸泡处理，在料水比1:0.5、酶活1500U/g、温度65℃、pH9.0、Mg⁺²浓度2mM条件下固态酶解3h，得酶解反应液，经检测，61％总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中52％为酸溶蛋白，氨态氮的含量为2.7％。将酶解反应液经浓缩干燥后即得羽毛粉添加剂。

实例4：

羽毛粉用NaOH溶液浸泡处理，在料水比1:0.5、酶活10000U/g、温度65℃、pH9.0、Mg⁺²浓度2mM条件下固态酶解12h，得酶解反应液，经检测，69％的总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中64％为酸溶蛋白，氨态氮的含量为4.2％。将酶解反应液经浓缩干燥后即得羽毛粉添加剂。

实施例5：

以猪血粉为原料，在料水比1:0.5、酶活3000U/g、温度65℃、pH9.0条件下固态酶解3h，得酶解反应液，经检测，67％的总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中53％为酸溶蛋白，氨态氮的含量为3.2％。将酶解反应液经浓缩干燥后即得羽毛粉添加剂。

实施例6：

以蚕蛹为原料，在料水比1:0.5、酶活2500U/g、温度65℃、pH9.0条件下固态酶解3h，得酶解反应液，经检测，48％的总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中47.2％为酸溶蛋白，氨态氮的含量为2.3％。将酶解反应液经浓缩干燥后即得羽毛粉添加剂。

实施例7：

以豆粕为原料，在料水比1:0.5、酶活1000U/g、温度65℃、pH9.0条件下固态酶解3h，得酶解反应液，经检测，43％的总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中41％为酸溶蛋白，氨态氮的含量为2.4％。将酶解反应液经浓缩干燥后即得羽毛粉添加剂。

实施例8：

以肉骨粉为原料，在料水比1:0.5、酶活1000U/g、温度65℃、pH9.0条件下固态酶解3h，得酶解反应液，经检测，77％的总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中66％为酸溶蛋白，氨态氮的含量为3.5％。将酶解反应液经浓缩干燥后即得羽毛粉添加剂。

将实施例1-8的羽毛粉添加剂添加到常规的家禽饲料中，为应用例1-8，以常规家禽饲料为对比1。常规家禽饲料配方如下：玉米55％，麸皮20％，豆饼7％，棉籽饼5％，菜籽饼5％，鱼粉5％，骨粉2％，贝粉1％。

选取61-120天龄蛋鸡，按照日龄和体重平均分配为九组。将应用例1-8和对比例1分别喂养这九组蛋鸡。喂养时间为30天，30天之后观察这九组蛋鸡的健康状况。结果表1.

表1

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华中农业大学 四川润格生物科技有限公司

<120> 一种羽毛粉添加剂、制备方法及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1617

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcgcaact tgaccaagac atctctatta ctggccggct tatgcacagc ggcccaaatg 60

gtttttgtaa cacatgcctc agctgaagaa agcatcgaat acgaccatac gtatcaaacc 120

ccttcataca tcatcgaaaa gtcaccgcag aagccggtac aaaacacaac ccagaaagaa 180

tcgctatttt cctatcttga caagcatcaa acgcagttta agctcaaagg gaatgcgaac 240

agccattttc gcgtttcgaa aaccataaag gatccaaaga caaaacaaac gttttttaaa 300

ttaacggagg tttacaaagg aattccgatt tacggctttg aacaagcggt cgcgatgaag 360

gaaaacaaac aagtgaaaag tttctttgga aaggtgcatc cgcaaatcaa ggacgtctcc 420

gtcacaccgt ctatttctga gaaaaaagca atacatacag caaggcgtga gctcgaggct 480

tccattggaa aaatcgaata tcttgatggg gaaccaaaag gcgaattata tatctatcca 540

cacgacggtg aatatgatct cgcctacctt gtgagactct cgacatctga acctgagcct 600

ggctattggc attatttcat cgatgccaaa aacggaaagg tcatcgagtc ctttaatgcc 660

attcatgaag cggcaggtac aggaatcggc gtgtcaggtg atgaaaaaag ctttgacgtc 720

acagaacaaa atgggcgctt ttatttggct gacgaaacaa ggggaaaagg gatcaataca 780

tttgacgcga agaacctgaa cgaaaccttg tttacgcttt tgtctcaact gatcgggtat 840

acgggcaaag aaatagtcag cggcacgtcc gtatttaatg aacctgcggc tgtagacgca 900

cacgcaaatg cgcaagccgt ttacgattat tacagcaaga catttggccg tgattctttt 960

gatcaaaacg gagcaaggat tacgtctacc gtgcatgtcg gcaaacaatg gaacaatgct 1020

gcgtggaacg gtgtccagat ggtatacggg gatggagacg gttcgaaatt taagccgctg 1080

tctggatcgc tcgacattgt cgcgcatgaa atcacacacg cagtcacaca gtattccgcc 1140

ggtcttttat atcaaggaga acccggtgca ttaaatgagt ccatttctga cattatgggc 1200

gcgatggctg accgtgatga ttgggagatc ggcgaagatg tctatactcc tggtattgca 1260

ggagattcat tgcggtcatt ggaggaccca tctaagcagg gaaatccaga tcattactcg 1320

aaccgctaca caggaacaga ggattatggc ggagtccata tcaattcgtc cattcacaat 1380

aaagcagctt atcttcttgc agaaggaggc gtgcaccacg gtgtacaggt tgaagggatt 1440

gggcgtgaag caagtgaaca aatttactat cgggctttaa catattatgt aacggcatct 1500

acagatttca gcatgatgaa gcaagcggcg attgaagctg ccaatgattt atacggtgaa 1560

ggctcgaagc aatcagcttc agtcgaaaag gcgtatgagg ctgtcggcat tctatga 1617