阅读说明：本技术 副干酪乳杆菌k56的新应用 (New application of lactobacillus paracasei K56 ) 是由 刘伟贤 洪维鍊 赵雯 赵子夫 郝婧宇 张海斌 侯保朝 倪丹 吴超 马国文 于 2019-06-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了副干酪乳杆菌K56的新应用。本发明的副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei),其保藏编号为CGMCC 15139或DSM27447。本发明发现该菌株单菌即具有显著缓解和/或预防便秘的功效,能够提高肠道推进率、缩短排便时间。(The invention provides a new application of lactobacillus paracasei K56. The Lactobacillus paracasei (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) has a preservation number of CGMCC15139 or DSM 27447. The invention discovers that the single strain has the effect of remarkably relieving and/or preventing constipation, can improve the intestinal propulsion rate and shorten the defecation time.)

副干酪乳杆菌K56的新应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei subsp.paracasei)K56(保藏编号CGMCC 15139或DSM27447)在缓解和/或预防便秘功效方面的新用途。

背景技术

随着现代人们生活方式的改变，饮食***均发病率为16％，其中中国20-30％人口受便秘困扰。且便秘患者通常同时伴有焦虑、抑郁等负面情绪，影响患者生活。而便秘由于个体差异，其治疗方法也多以西药泻剂居多，但是长期服用泻剂会导致消费者引起腹胀、维生素吸收困难、药物依赖性等负面作用。近年来，由于益生菌制剂对于便秘患者在临床上的突出表现，使用益生菌作为便秘的调节剂也日益受到重视。

益生菌是指摄入充足数量可以对宿主产生健康益处的活的微生物。益生菌可以在肠道粘膜中的黏附，产生细菌素等可有效抑制有害菌生长繁殖，从而改善肠道菌群结构以及减缓酚类物质堆积危害。同时，也有文章指出，益生菌在肠道的定殖过程，可以产生有大量的短链脂肪酸，降低肠道环境pH，缩短肠道运转时间，从而起到缓解便秘的作用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供副干酪乳杆菌K56的新用途。

副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)K56菌株已于2013年6月27日保存于德国微生物及细胞培养物收集中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures)，保藏编号DSM27447；另外，副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)K56菌株也已于2017年12月29日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center,CGMCC)，保藏编号CGMCC 15139。

本发明发现副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)K56菌株单菌即具有显著缓解和/或预防便秘的功效，能够提高肠道推进率、提高排便时间。

从而，本发明提供了副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei)在制备用于缓解和/或预防便秘的组合物中的应用，所述副干酪乳酸杆菌的保藏编号为CGMCC 15139或DSM27447。

根据本发明的具体实施方案，所述副干酪乳酸杆菌以固态或液态菌制剂的形式用于制备所述组合物。

根据本发明的具体实施方案，所述组合物可以包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。

根据本发明的具体实施方案，所述组合物可使用于动物或是人类。所述组合物还可包括所属领域中的常规用料组分。例如，对于药物组合物，可包括适量的辅料，所述辅料可以为赋型剂、稀释剂、填充剂、吸收促进剂等。对于食品组合物，本发明的乳双歧杆菌可以按照现有技术中含乳双歧杆菌的食品进行生产，所述组合物可根据受施予者的需要，而采用不同形态。例如粉剂、锭剂、造粒、微胶囊、液体制剂等。

根据本发明的具体实施方案，所述组合物是用于提高肠道推进率。具体应用时，所述副干酪乳酸杆菌的应用量为1.0×10³CFU～1.0×10¹²CFU/天，优选为1.0×10⁷CFU～1.0×10¹⁰CFU/天。

根据本发明的具体实施方案，所述组合物是用于缩短排便时间。具体应用时，所述副干酪乳酸杆菌的应用量为1.0×10³CFU～1.0×10¹²CFU/天，优选为1.0×10⁷CFU～1.0×10¹⁰CFU/天。

在本发明的一具体实施方案中，所述组合物为食品组合物，所述食品为发酵乳制品(例如发酵乳、风味发酵乳、发酵乳饮料等)、乳酪、含乳饮料、固体饮料或乳粉。

综上所述，本发明提供了副干酪乳杆菌K56的新用途，该菌具有显著缓解和/或预防便秘的功效，能够提高肠道推进率、提高排便时间，可以用于制备具有缓解和/或预防便秘功效的食品、药物及饲料等，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1显示副干酪乳杆菌K56对小肠墨汁推进率(％)的影响。

图2显示副干酪乳杆菌K56对首次排黑便时间(min)的影响。

图3显示副干酪乳杆菌K56对排便粒数的影响。

图4显示副干酪乳杆菌K56对排便重量的影响。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。除非另有说明，本发明中使用的所有表示成分、细胞培养、处理条件等的量的数字应当理解为在所有条件下受到术语“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，数值参数为近似值，并且可以根据通过本发明试图获得的期望特性而变化。除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。

本发明的各实施例中，除特别说明外，实验数据表示为Mean±S.E.M.数据采用PRISM version 5.0(GraphPad,San Diego,CA,USA)进行统计。组间差异采用one-wayANOVA跟随Tukery’s multiple comparison test的方法进行统计。P<0.05时具有显著的统计学差异。

实施例1：小肠运动试验

238只健康SPF级BABL/c小鼠，体重18-20g，由北京华阜康生物科技有限责任公司提供。饲养于中国疾病预防控制中心动物房：维持室温(25±2)℃，相对湿度(55±2)％，12h/12h光照/黑暗环境，自由进食和饮水。按照体重，利用随机数字，分为17组，每组14只，使用苦味酸编号，普通饲料常规饲养，分组安排如表1所示。

表1分组安排

分组	受试物	人体每日剂量(CFU/d)
			对照组	PBS	--
模型组	PBS	--
			K56极低剂量组	K56副干酪乳杆菌	1x10<sup>6</sup>
K56低剂量组	K56副干酪乳杆菌	1x10<sup>7</sup>
			K56中剂量组	K56副干酪乳杆菌	1x10<sup>8</sup>
K56高剂量组	K56副干酪乳杆菌	1x10<sup>9</sup>
			K56极高剂量组	K56副干酪乳杆菌	1x10<sup>10</sup>

适应性喂养3天后开始正式实验。用苦味酸对小鼠进行分组编号后，分别于给予受试物第0周、第1周、第2周、第3周、第4周称重，计算小鼠灌胃量。以灌胃的方式给予受试样品，每天灌胃一次，灌胃体积20mL/kg，对照组与模型组灌胃给予PBS，干预时间30天。

墨汁的配制：准确称取***树胶100g，加水800mL，煮沸至溶液透明，称取活性炭(粉状)50g加至上述溶液中煮沸三次，待溶液冷却加水定容至1000mL，于4℃冰箱中保存，用前摇匀。盐酸洛哌丁胺混悬液配制：取盐酸洛哌丁胺(剂量：2mg/粒)20粒，加水至100mL配制浓度为0.04％的溶液，临用前配制。样品的配制：以墨汁作为溶剂，分别配制K56副干酪乳杆菌不同剂量的溶液，临用前配制，低温保存。

受试物干预30天后，各组小鼠禁食不禁水16小时。实验前对小鼠进行称重，依据体重给予模型组与各干预组盐酸洛哌丁胺溶液，对照组给予蒸馏水，剂量为20mL/kg，建立模型。给予蒸馏水及盐酸洛哌丁胺30分钟后，各干预组分别给予含相应剂量活菌的墨汁，对照组及模型组给予墨汁灌胃。

给予墨汁25分钟后立即脱颈处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”。

结果参见表2和图1。

表2副干酪乳杆菌K56对小鼠体重的影响(g)

组别

动物数

第0周

第1周

第2周

第3周

第4周

对照组

14

21.59±1.09

23.08±0.98

24.06±1.03

24.65±1.07

24.84±1.43

模型组

14

21.67±0.42

23.62±0.77

24.31±0.91

25.17±0.96

25.79±1.10

1x10<sup>6</sup>cfu/d

14

21.29±0.77

23.52±0.91

24.52±1.29

25.14±1.52

25.39±1.49

1x10<sup>7</sup>cfu/d

14

20.82±0.89

22.96±0.94

23.83±1.43

24.76±1.79

25.48±1.37

1x10<sup>8</sup>cfu/d

14

21.47±0.88

23.66±0.75

25.23±1.21

25.25±1.09

25.95±1.09

1x10<sup>9</sup>cfu/d

14

20.65±0.75

22.87±0.98

24.26±0.89

24.68±1.17

25.12±0.96

1x10<sup>10</sup>cfu/d

14

21.76±1.17

23.73±1.17

24.84±1.18

25.04±1.37

25.45±1.48

在实验期内，动物表征正常，精神及活动状况良好，每日给予受试物后未出现任何不良反应。由表2体重数据可以看出，实验周期内，各组动物体重并未出现显著差异。与对照组比较，模型组小鼠墨汁推进率显著低于对照组(p＜0.05)，说明成功小鼠小肠蠕动一致模型。

由图1可知，与模型组比较，K56益生菌低(1x10⁷cfu/d)、高(1x10⁹cfu/d)和极高剂量组(1x10¹⁰cfu/d)小鼠的墨汁推进率显著高于模型对照组(p＜0.05)，实验结果阳性，表明低(1x10⁷cfu/d)、高(1x10⁹cfu/d)和极高剂量组(1x10¹⁰cfu/d)的副干酪乳杆菌K56可促进小鼠肠道运动。

实施例2：小鼠小肠推进率与首粒排黑便时间的测定

238只健康SPF级BABL/c小鼠，体重18～20g，饲养于东南大学动物房：维持室温(25±2)℃，相对湿度(55±2)％，12h/12h光照/黑暗环境，自由进食和饮水。按照体重，利用随机数字，分为17组，每组14只，使用苦味酸编号，普通饲料常规饲养，分组安排如表1示。适应性喂养3天后开始正式实验。

使用苦味酸对小鼠进行分组编号后，分别于给予受试物第0周、第1周、第2周、第3周、第4周称重，计算小鼠灌胃量。以灌胃的方式给予受试样品，每天灌胃一次，灌胃体积20mL/kg，对照组与模型组灌胃给予PBS，干预时间30天。

墨汁的配制：准确称取***树胶100g，加水800mL，煮沸至溶液透明，称取活性炭(粉状)50g加至上述溶液中煮沸三次，待溶液冷却加水定容至1000mL，于4℃冰箱中保存，用前摇匀。盐酸洛哌丁胺混悬液配制：取盐酸洛哌丁胺(剂量：2mg/粒)20粒，加水至100mL配制浓度为0.04％的溶液，临用前配制。样品的配制：以墨汁作为溶剂，分别配制K56活菌不同剂量的溶液，临用前配制，低温保存。

实验前，小鼠称重，依据体重给予模型组与各干预组盐酸洛哌丁胺溶液，对照组给予蒸馏水，剂量为20mL/kg，建立模型。给予蒸馏水及盐酸洛哌丁胺30分钟后，各干预组分别给予含相应剂量活菌的墨汁，对照组及模型组给予墨汁灌胃。给予墨汁后，动物单笼饲养，正常饮水进食。从灌墨汁开始计时，记录每只动物首粒黑便时间，5小时内黑便粒数及重量。

对照组和模型组在排首粒黑便时间、排便粒数、排便重量间差异有统计学意义(p<0.05)，对照组排首粒黑便时间短于模型组、排便粒数多于模型组、排便重量大于模型组，说明小鼠便秘模型成立。如图2-图4所示，K56各剂量组与模型组比较，低(1x10⁷cfu/d)、高剂量(1x10⁹cfu/d)组排首粒黑便时间具有下降趋势，中(1x10⁸cfu/d)、高剂量组(1x10⁹cfu/d)黑便粒数、黑便重量显著高于模型组(p＜0.05)。

肠道运动情况可以由小肠推进率与首粒排黑便时间来反应。其中小肠推进率是指一定时间内，食物在小肠内运转的长度占小肠总长度的比例，反应小肠的运动能力。而首粒排黑便时间代表的是食物从消化道进入***排出的整个时间，反映了整个肠道的整体运动能力。在测定小鼠小肠推进率与首次排黑便时间时，需要对对照组与干预组小鼠进行急性造模，得到肠道蠕动抑制模型。由上述试验结果可知，模型组与空白组相比，小肠推进率显著提高(图1)，首粒排黑便时间显著缩短(图2)，说明造模成功。根据图1可知，副干酪乳杆菌K56在低剂量(10⁷)时，即可提升小肠推进率且低剂量、高、极高剂量组均显著高于模型组，缩短了模型组与空白组的差距，说明副干酪乳杆菌K56可以改善小肠运转，提高小肠运动能力情况。根据图2-图4可知，副干酪乳杆菌K56干预，首粒排黑便时间与模型组存在显著差异，缩小了模型组与空白组之间的差距，表明副干酪乳杆菌K56可以改善肠道转运作用，最低起效量为低剂量(10⁷)，最佳剂量为高剂量(10⁹)。

以上研究结果证实：副干酪乳杆菌K56可以提高小肠运动能力，缩短排便时间。本发明提供的菌株，可以用于食品，如发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉或其它含有该菌株及其衍生物的任何一种食品。