一种从新鲜秋葵中高效分离活性多糖的方法
阅读说明：本技术 一种从新鲜秋葵中高效分离活性多糖的方法 ([db:专利名称-en]) 是由 闫景坤 王春 余运波 陈婷婷 王紫薇 于 2019-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从新鲜秋葵中高效分离活性多糖的方法,属于生物活性多糖分离技术领域。将秋葵洗净、切片,加入蒸馏水匀浆处理,纱布过滤；秋葵滤液加入无机盐硫酸铵和叔丁醇,35℃恒温水浴振荡30min,离心分离；上层有机相旋转蒸发,回收叔丁醇；下层硫酸铵相溶液用质量分数为30％～50％的硫酸铵进行沉淀,离心分离,沉淀溶于水,透析,喷雾干燥得到秋葵多糖固体；沉淀后硫酸铵溶液通过蒸发结晶回收硫酸铵。本发明操作简单易行、成本低廉,而且能够绿色、高效地获得高纯度活性多糖,为企业带来较大经济效益,适宜大规模化推广。此外,本发明也能普遍应用于其他新鲜果蔬如大蒜、洋葱、西红柿、苹果等活性多糖的高效、高纯度分离。([db:摘要-en])
技术领域
本发明涉及一种从新鲜秋葵中高效分离活性多糖的方法，特指由叔丁醇和无机盐硫酸铵组成的三相体系联合硫酸铵沉淀用于新鲜秋葵活性多糖的高效分离，属于生物活性多糖分离技术领域。
背景技术
秋葵(Abelmoschus esculentus(L.)Moench)，又名羊角豆、咖啡葵、木丝瓜、越南芝麻，属一年生草本植物,富含多种活性物质如蛋白质、脂肪、碳水化合物及丰富的维他命A和B群以及钙、磷、铁、锌和硒等微量元素，营养保健价值高，具有抗疲劳、提高机体免疫力、减少肺损伤和抗癌等作用。秋葵多糖是一类高分子酸性多糖，主要由鼠李糖和半乳糖组成，另有少量的***糖和甘露糖等，具有提高免疫调节能力、降血糖、降血脂、抗疲劳、抗氧化等作用，可以将其开发成抗疲劳、保护肠胃、促进胆固醇代谢的保健产品。此外，秋葵多糖还可作为增稠剂、乳化剂、稳定剂应用于饮料工业生产中。
目前，国内外从秋葵中获得多糖的方法通常是将新鲜秋葵进行干燥、脱脂预处理后再利用溶剂法、酶法或物理辅助法提取，通过乙醇沉淀、脱蛋白和柱层析进行多糖的分离纯化，从而获得高纯度多糖。例如，孙坤来等人于2016年12月30日申请的专利名称“秋葵多糖的提取方法”(申请号：201611251131.2)；倪元颖等人于2017年1月9日申请的专利名称“一种超声辅助提取黄秋葵多糖提取物及果胶提取物的方法”(申请号：201710012930.2)；张文成等人于2018年8月13日申请的专利名称“一种碱性黄秋葵多糖的分离提取方法及其用途”(申请号：201810913650.3)。然而，预处理过程需要干燥设备，不仅投入成本高，能耗大，而且干燥过程容易对多糖活性产生不利影响。此外，脱脂过程往往需要大量有机试剂，不符合“绿色”化学要求。另一方面，多糖分离纯化过程操作繁琐，有机溶剂如乙醇、三氯甲烷等的大量使用，不仅造成了活性多糖的损失，而且污染环境和影响操作者的健康。因此，一种绿色、高效、快速分离秋葵多糖的方法显得尤为重要。
近年来，三相分离(Three-phase partitioning,TPP)法作为一种新发展的分离生物活性物质的方法已用于蛋白质、酶、氨基酸及植物油等的分离、浓缩和纯化。该法设备简单、操作简便快速，试剂可重复使用，叔丁醇沸点高于甲醇、乙醇和己烷，安全性高。在三相分离中，叔丁醇不仅可以作为有机溶剂溶解非极性物质，而且还能够与蛋白质结合，促使形成三相。同时，游离蛋白质以固体的形式富集于中间相，能够代替传统Sevag法用于多糖中游离蛋白的去除，避免了三氯甲烷等有机溶剂的使用。例如，闫景坤等人于2018年4月16日申请的专利名称“一种利用三相体系分离真菌胞外多糖的方法”(申请号：201810335794.5)，该专利明确了三相体系可用于活性多糖和蛋白质的选择性分离。然而，三相体系所分离多糖的纯度和均一性较差。硫酸铵沉淀作为一种非溶剂沉淀已广泛用于活性多糖的分离分级。与柱层析和超滤相比，该技术应用范围广，可根据需要方便地进行放大或缩小，具有潜在的工业化应用效果和可行性。因此，通过在三相分离后的硫酸铵相溶液中加入不同质量分数的硫酸铵可以获得不同分子量级分的高纯度活性多糖。
经检索，目前还未见利用由叔丁醇和无机盐硫酸铵组成的三相体系联合硫酸铵沉淀用于新鲜秋葵中活性多糖高效分离的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从新鲜秋葵中高效分离活性多糖的方法，特指由叔丁醇和无机盐硫酸铵组成的三相体系联合硫酸铵沉淀用于新鲜秋葵活性多糖的高效分离，以实现“绿色”、高效、快速分离秋葵活性多糖。
为了解决以上技术问题，本发明采用的具体技术方案如下：一种从新鲜秋葵中高效分离活性多糖的方法，按照下述步骤进行：
步骤一，新鲜秋葵匀浆处理：将市售新鲜秋葵清洗干净，切片，加入蒸馏水进行匀浆处理，纱布过滤，得到滤液和滤渣；
步骤二，三相体系分离：将步骤一中得到的秋葵滤液加入硫酸铵，搅拌溶解，调节溶液pH值至7.0，加入叔丁醇，在35℃的恒温水浴中振荡30min，4500rpm离心分离10min，分别取出上层叔丁醇相和下层硫酸铵相；
步骤三，硫酸铵沉淀分离秋葵多糖：将步骤二中得到的硫酸铵相溶液用硫酸铵沉淀，离心分离，沉淀溶于水，透析48h，浓缩，喷雾干燥，获得不同级分的秋葵多糖固体；
步骤四，回收叔丁醇和硫酸铵：将步骤二中得到的上层叔丁醇相，≤30℃旋转蒸发，回收叔丁醇；将步骤三中离心分离后的硫酸铵溶液采用蒸发结晶，回收硫酸铵。
步骤一中所述蒸馏水与新鲜秋葵的质量比为3:1。
步骤二中所述三相体系由叔丁醇、硫酸铵和秋葵滤液组成，形成三相后中间相为蛋白质层；所述硫酸铵为食品级；所述硫酸铵的质量分数为20％；所述叔丁醇与秋葵滤液的体积比为1.5:1.0。
步骤三中所述硫酸铵沉淀所用硫酸铵的质量分数为30％～50％；所述透析采用透析袋方法，透析袋分子截留量为8000～14000Da。
本发明具有有益效果：
本发明通过将由叔丁醇和无机盐硫酸铵组成的三相体系用于新鲜秋葵多糖的提取，再结合硫酸铵沉淀获得不同级分高纯度的秋葵多糖，而且所制备的秋葵多糖具有良好的体外抗氧化和降血糖活性。与现有技术相比，本发明操作简单易行、成本低廉，而且能够绿色、高效地获得高纯度活性多糖，为企业带来较大经济效益，适宜大规模化推广。此外，本发明也能普遍应用于其他新鲜果蔬如大蒜、洋葱、西红柿、苹果、火龙果、荔枝、柑橘等活性多糖的高效、高纯度分离。
附图说明
图1为本发明实施例1所分离秋葵多糖的分子量分布图；
图2为本发明实施例2所分离秋葵多糖的分子量分布图；
图3为本发明实施例3所分离秋葵多糖的分子量分布图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细描述，需要指出地是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1
步骤一，新鲜秋葵匀浆处理：将市售新鲜秋葵500g清洗干净，切片，加入1500g蒸馏水进行匀浆处理，纱布过滤，得到滤液和滤渣；
步骤二，三相体系分离：将步骤一中得到的秋葵滤液1000mL加入硫酸铵200g，搅拌溶解，调节溶液pH值至7.0，加入1500mL叔丁醇，在35℃的恒温水浴中振荡30min，4500rpm离心分离10min，分别取出上层叔丁醇相和下层硫酸铵相；
步骤三，硫酸铵沉淀分离秋葵多糖：将步骤二中得到的1000mL硫酸铵相溶液，加入100g硫酸铵，使溶液中硫酸铵质量分数为30％，离心分离，沉淀溶于水，透析48h，浓缩，喷雾干燥，获得秋葵多糖固体。测得秋葵多糖的总糖含量为87.9％，分子量分布呈单一峰，如图1所示，重均分子量为5.1×106Da，清除DPPH自由基的IC50值为0.14mg/mL，等价抗氧化能力为53.7μmol Trolox/g样品，还原二价铁离子能力为115.7μmol FeSO4/g样品，α-淀粉酶抑制活性的IC50值为0.32mg/mL。
步骤四，回收叔丁醇和硫酸铵：将步骤二中得到的上层叔丁醇相，≤30℃旋转蒸发，回收叔丁醇；将步骤三中离心分离后的硫酸铵溶液采用蒸发结晶，回收硫酸铵。
实施例2
试验处理过程同实施例1，其不同之处在于步骤三中加入300g硫酸铵，使溶液中硫酸铵质量分数为50％。测得秋葵多糖的总糖含量为93.5％，分子量分布呈单一峰，如图2所示，重均分子量为3.6×106Da，清除DPPH自由基的IC50值为0.045mg/mL，等价抗氧化能力为71.3μmol Trolox/g样品，还原二价铁离子能力为169.3μmol FeSO4/g样品，α-淀粉酶抑制活性的IC50值为0.10mg/mL。
实施例3
试验处理过程同实施例1，其不同之处在于步骤三中加入200g硫酸铵，使溶液中硫酸铵质量分数为40％。测得秋葵多糖的总糖含量为90.1％，分子量分布呈单一峰，如图3所示，重均分子量为4.3×106Da，清除DPPH自由基的IC50值为0.11mg/mL，等价抗氧化能力为68.2μmol Trolox/g样品，还原二价铁离子能力为161.8μmol FeSO4/g样品，α-淀粉酶抑制活性的IC50值为0.15mg/mL。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。