阅读说明：本技术 一种田菁线粒体及其dna提取的有效方法 (Sesbania mitochondria and effective method for extracting DNA thereof ) 是由 贺亭亭 邢锦城 洪立洲 于 2019-12-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法,属于植物生物技术领域。以田菁黄化苗为材料,优化操作后获得的田菁组织提取液通过调整后的转速离心去除杂质,分离并富集粗制的线粒体,经过蔗糖梯度离心法对线粒体进行纯化,再次通过离心富集纯化后的线粒体。利用改良后的SDS法提取的线粒体DNA其A260/A280约为1.80～1.88,限制性内切酶EcoR I酶切后条带清晰,说明本方法提取的线粒体DNA纯度高。利用该发明所公开的方法能够简单快捷的提取到纯净的田菁线粒体DNA,为田菁线粒体基因组及其内部基因的分子机理研究奠定了基础。(The invention discloses sesbania mitochondria and an effective method for extracting DNA thereof, belonging to the technical field of plant biology. And (3) taking the sesbania etiolated seedlings as materials, centrifuging the sesbania tissue extract obtained after optimized operation at an adjusted rotating speed to remove impurities, separating and enriching crude mitochondria, purifying the mitochondria by a sucrose gradient centrifugation method, and centrifuging again to enrich the purified mitochondria. The A260/A280 of the mitochondrial DNA extracted by the improved SDS method is about 1.80-1.88, and the band of the mitochondrial DNA extracted by the method is clear after the restriction enzyme EcoR I is cut, which shows that the purity of the mitochondrial DNA extracted by the method is high. The method disclosed by the invention can be used for simply and quickly extracting pure sesbania mitochondrial DNA, and lays a foundation for the molecular mechanism research of sesbania mitochondrial genomes and internal genes thereof.)

一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法

一、技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及田菁线粒体及其DNA的有效提取方法，适用于田菁线粒体及其DNA的分离纯化。

二、背景技术

线粒体是半自主细胞器，在真核生物中，通过氧化磷酸化过程为细胞提供ATP。线粒体基因组具有进化缓慢、序列***缺失频繁、重组迅速、结构复杂多样和基因表达模式独特等特点(Schuster and Brennicke 1994；Sanchez Puerta et al.2017；Kovar etal.2018；Sanchez Puerta et al.2019；Zhang et al.2019)。植物线粒体基因组的大小变化范围较大，从187kb到2400kb均有分布(Bentolila and Stefanov，2012)。线粒体与细胞核、质体之间的序列交换及其自身重复序列的含量对线粒体基因组大小影响很大(Sternand Lonsdale 1982；Vaughn et al.1995；Goremykin et al.2012；Christensen 2014；Wynn and Christensen 2019)。植物在有氧呼吸过程中，葡萄糖通过糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化在线粒体中释放能量。但在无氧环境中，细胞则会在细胞质基质中进行无氧呼吸，糖酵解产生的丙酮酸不再进入线粒体进行三羧酸循环。除了合成ATP为细胞提供能量等主要功能外，线粒体还能通过调节膜电位控制细胞程序性死亡。

田菁作为一种豆科植物，根系发达，鲜草产量高且养分丰富，已成为一种优良的夏季绿肥和动物饲料(徐开未等，2014；黄志武和廖红1992)。此外，田菁的茎秆纤维可用于造纸，种子可用于生产田菁胶(焦彬等1986)。近期的研究表明，田菁叶片中的新型半胱氨酸酶可能在止血和伤口愈合过程中发挥作用(Shivamadhu et al.2017)。因此田菁具有较高的生态和经济利用价值。据研究发现，田菁在涝胁迫环境中根部能够形成海绵状通气组织，生物量增加，结瘤能力增强。在此过程中田菁根部线粒体的呼吸作用是否受到影响，是否存在种属特异基因响应涝胁迫还未知。田菁线粒体及其高纯度DNA的提取能够为后期研究奠定基础。

三、

发明内容

技术问题

本发明的目的是公开一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法，该方法适用于田菁线粒体及其DNA的分离纯化。为了获得纯化的线粒体，对田菁种子进行暗培养，以减少叶绿体的产生，通过差速离心法去除植物组织杂质和细胞核，获得粗制的线粒体，采用蔗糖密度梯度和超速离心相结合的方式去除与线粒体沉降系数相近的质体，分离得到纯化的线粒体。想要得到高纯度的线粒体DNA，需要去除细胞核和质体中的DNA还有组织中的RNA。利用差速离心和DNase消化相结合的方式去除游离的和结合在线粒体膜上的DNA。在对纯化的线粒体破壁提取DNA的过程中，RNase的加入和3h的水浴能够很好的去除RNA的干扰。本发明结合不同植物线粒体DNA的提取方法和不断的试验摸索，对组织破碎方式、匀浆缓冲液和DNA提取缓冲液组分、差速离心组合进行了调整，结合蔗糖密度梯度离心法获取高纯度的线粒体及其DNA。本发明具有操作简便，成本低廉，产物纯度高的特点，为田菁线粒体基因组的研究奠定基础。

技术方案

本发明基于试验摸索改良过后的组织匀浆缓冲液组分和差速离心组合，结合蔗糖密度梯度和超速离心获取纯化的线粒体，后经改良的DNA提取缓冲液，实验获得高纯度的线粒体DNA。具体实验内容如下：

1、田菁组织匀浆液的获取：

1)向260mL预冷的缓冲液A中加入0.13g半胱氨酸和1.3mL的β-巯基乙醇，与50g田菁黄化苗一同倒入提前预冷的榨汁机中搅拌90s；

2)匀浆液先用2层无菌的脱脂纱布过滤，再用2层100目的尼龙网过滤，在冰上收集滤液，等量分装到50mL的无菌离心管中。

2、线粒体的分离和纯化：

1)匀浆液在高速离心机中离心15min，转速2200g，温度4℃；

2)将上清液快速转移至50mL的无菌离心管中，至高速离心机离心15min，转速17000g，温度4℃，获得的沉淀即为粗制线粒体；

3)向沉淀中加入缓冲液B，用羊毛笔将沉淀轻轻悬起，加入DNase I至其浓度为50μg/mL，冰浴1h后加入EDTA中止反应；

4)高速冷冻离心机离心20min，转速18000g，温度4℃；

5)用羊毛笔轻轻将沉淀重悬于缓冲液C中，并转移至由5mL1.45M和5mL1.2M蔗糖铺成的不连续密度梯度液上；

6)将铺好的离心管轻轻悬挂到超高速离心机的水平转子上，离心90min，转速20600rpm，温度4℃；

7)收集1.45M和1.2M蔗糖密度梯度液之间的线粒体，加入等体积的缓冲液C；

8)高速冷冻离心机离心20min，转速20000g，温度4℃，沉淀即为纯化的线粒体。

3、从纯化的线粒体中提取DNA：

1)向纯化的线粒体中加入裂解缓冲液，用移液枪吸打混匀，按照体系将蛋白酶K、SDS、RNase加入后37℃水浴3h，每隔30min轻轻摇动；

2)冷却至室温后加入NH₄AC溶液和等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，颠倒混匀10min，12000g离心10min，温度4℃；

3)将上清液转移至新的离心管中，再次加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，颠倒混匀10min，12000g离心10min，温度4℃；

4)将上清液转移至新的离心管中，重复上述3)的操作至蛋白抽提干净；

5)吸取上清液转移至新的离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇，-20℃保存过夜；

6)12000g离心15min，温度4℃，70％酒精洗涤2次，室温下晾至半干后加入TE或无菌水溶解。

4、对获得的线粒体DNA进行定量和定性检测：

1)线粒体DNA浓度检测：吸取2μL的线粒体DNA溶液，利用酶标仪检测其浓度。

2)线粒体DNA电泳条带检测：取2μL的线粒体DNA溶液进行琼脂糖(1％)凝胶电泳检测，观察带型。

3)线粒体DNA纯度检测：取2μL的线粒体DNA溶液，利用限制性内切酶EcoR I对其进行酶切，1％琼脂糖凝胶电泳后观察带型。

有益效果

本发明一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法，具有以下创新点和有益效果：

1)为了避免叶绿体的干扰，田菁种子遮光培养，14天为最佳的培养时间，定量的组织要放在冰上预冷，保证线粒体及其DNA的完整性。

2)用于线粒体DNA提取的裂解缓冲液中加入BSA去除自由脂肪酸，PVP去除酚类化合物，半胱氨酸和β-巯基乙醇作为还原剂降低氧化损伤，蔗糖可以有效调节线粒体渗透压并控制成本。

3)通过反复试验确定了适合田菁线粒体提取的差速离心力组合，用以去除破碎的组织和细胞核，DNase可以充分消除线粒体之外的其他DNA的干扰，蔗糖密度梯度高速离心进一步将质体从线粒体缓冲液中去除。

4)线粒体DNA提取裂解液中，蛋白酶K使与DNA结合的膜蛋白降解，充分游离DNA。RNase能够使RNA降解，消除RNA的污染。

本发明不但能够有效解决田菁线粒体提取的技术难题，获取高质量无污染的线粒体DNA，为田菁线粒体基因组的研究奠定基础，而且实验成本得到有效控制。经计算1g田菁组织能够获得0.3～0.35μg线粒体DNA，A260/A280为1.80～1.88，琼脂糖(1％)凝胶电泳检测条带清晰无降解，且酶切条带清晰无细胞核和质体DNA污染。

四、附图说明

图1：田菁线粒体DNA蔗糖密度梯度离心结果

图中，1为1.2M蔗糖；2为质体；3为1.42M蔗糖；4为线粒体

图2：田菁线粒体DNA及其酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果

图中，5、6泳道为田菁线粒体DNA；7泳道为DNA Marker；8泳道为限制性内切酶EcoRI酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果；9泳道为DNA Marker

五、

具体实施方式

本研究所用的田菁种子由江苏沿海地区农业科学研究所盐土农业研究室提供。选取健康饱满的田菁种子播种于灭菌基质(营养土∶蛭石＝1∶3)中，温度27℃，湿度65％，进行暗培养。需要照明时使用绿光灯，尽量减少叶绿体的产生，培养14天获得黄化苗。本研究的所有试剂均提前预冷，所有操作在没有说明的情况下全部在冰上或4℃以下进行，操作熟练快速。所需试剂中用于蔗糖密度梯度离心的蔗糖采购于美国Sigma-Aldrich公司，其余试剂采购于南京寿德生物科技有限公司。缓冲液和试剂具体配方如下：

缓冲液A：171g蔗糖溶解于ddH₂O中，向其中加入50mL的1M Tris-HCl(PH8.0)、10mL的0.5M EDTA(PH 8.0)，1g的BSA和15g的PVP。混合均匀后调节PH至7.5，定容至1L(BSA和PVP灭菌放凉后加入)。

缓冲液B：85.5g蔗糖溶于ddH₂O中，向其中加入25mL的1M Tris-HCl(PH 8.0)和3.05g的MgCl2·6H2O。混合均匀后调节PH至7.5，定容至500mL。

缓冲液C：102.5g蔗糖溶于ddH₂O中，向其中加入5mL的1M Tris-HCl(PH 8.0)和20mL的0.5M EDTA(PH 8.0)。混合均匀后调节PH至7.5，定容至500mL。

裂解缓冲液：将5mL的1M Tris-HCl(PH 8.0)和2mL的0.5M EDTA(PH 8.0)混合液定容至100mL。

1.2M的蔗糖溶液：20.53g的蔗糖溶于水中，向其中加入0.5mL的1M Tris-HCl(PH8.0)和2mL的0.5M EDTA(PH 8.0)。混合均匀后调节PH至7.5，定容至50mL。

1.45M的蔗糖溶液：24.81g的蔗糖溶于水中，向其中加入0.5mL的1M Tris-HCl(PH8.0)和2mL的0.5M EDTA(PH 8.0)。混合均匀后调节PH至7.5，定容至50mL。

10mg/mL的DNase I：10mg的DNase I溶于1mL的无菌水中，轻柔混匀，储存于-20℃。

10mg/mL的蛋白酶K：100mg的蛋白酶K溶液溶于10mL无菌水，分装后储存于-20℃。

实验过程如下：

为了提高田菁线粒体得率，降低细胞碎片和细胞核的影响，本研究通过多次实验对过滤方式、匀浆缓冲液组分和差速离心力组合进行了调整。为了提取高质量无污染的线粒体DNA，调整了裂解缓冲液的组分。一系列措施确保了田菁线粒体及其DNA的高质量获取。

1、田菁组织匀浆液的获取：

1)向260mL预冷的缓冲液A中加入0.13g半胱氨酸和1.3mL的β-巯基乙醇，与50g田菁黄化苗一同倒入提前预冷的榨汁机中搅拌40-80s；

2)匀浆液先用2层无菌的脱脂纱布过滤，再用2层100目的尼龙网过滤，在冰上收集滤液，等量分装到50mL的无菌离心管中。

2、线粒体的分离和纯化：

1)匀浆液在4℃预冷的高速离心机(Avanti J-26S XP，美国Beckman公司)中离心15min，转速2200g；

2)将上清液快速转移至50mL的无菌离心管中，至高速离心机离心15min，转速17000g，温度4℃，获得的沉淀即为粗制线粒体；

3)向每个离心管的沉淀中加入缓冲液B，用羊毛笔将沉淀轻轻悬起，加入DNase I至其浓度为50μg/mL，冰浴1h后加入EDTA至50mmol/L终止反应；

4)样品转移至4℃预冷的高速冷冻离心机离心20min，转速18000g；

5)用羊毛笔轻轻将沉淀重悬于1.5mL缓冲液C中，并转移至由5mL1.45M和5mL1.2M蔗糖铺成的不连续密度梯度液上；

6)将铺好的离心管轻轻悬挂到4℃预冷的超高速离心机(XPN-100，美国Beckman公司)的水平转子上，离心90min，转速20600rpm；

7)用吸管收集1.45M和1.2M蔗糖密度梯度液之间的线粒体层，加入等体积的缓冲液C；

8)将样品转移至4℃预冷的高速冷冻离心机离心20min，转速20000g，沉淀即为纯化的线粒体。

3、从纯化的线粒体中提取DNA：

1)向纯化的线粒体中加入裂解缓冲液，用移液枪吸打混匀，按照体系加入蛋白酶K至终浓度200μg/mL、SDS至终浓度1％、7μLRNase后37℃水浴3h，每隔30min轻轻摇动；

2)冷却至室温后加入NH4AC溶液至终浓度0.5M和等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，颠倒混匀10min，在4℃预冷的台式离心机(CT15E/CT15RE，日本Hitachi日立)中转速12000g离心10min；

3)小心吸取上清液转移至新的离心管中，再次加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，颠倒混匀10min，转速12000g离心10min，温度4℃；

4)小心吸取上清液转移至新的离心管中，重复上述3)的操作至蛋白抽提干净；

5)吸取上清液转移至新的离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇，-20℃保存过夜；

6)样品在4℃预冷的离心机中转速12000g离心15min，70％酒精洗涤2次，室温下晾至半干后加入50μL无菌水溶解。

4、对获得的线粒体DNA进行定量和定性检测：

1)线粒体DNA浓度检测：吸取2μL的线粒体DNA溶液，利用酶标仪检测其浓度，A260/A280约为1.80～1.88。

2)线粒体DNA电泳条带检测：取2μL的线粒体DNA溶液进行琼脂糖(1％)凝胶电泳检测，观察带型，电泳无拖尾现象证明线粒体DNA完整无降解下方无RNA条带，证明线粒体DNA中无RNA污染。

3)线粒体DNA纯度检测：在灭菌的PCR管中依次加入5μL的10×H buffer，2μL的线粒体DNA溶液，1μL的EcoR I和42μL的ddH₂O组成50μL的反应体系。将反应体系混匀，离心后37℃水浴6-8h，70℃水浴15min使限制性内切酶EcoR I失活，之后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，观察带型，酶切后DNA条带均匀分布不弥漫证明提取的线粒体DNA纯度高，无细胞核和质体DNA的污染。