阅读说明：本技术 棉花种子剥皮加倍的种植方法 (Cotton seed peeling and doubling planting method ) 是由 李燕 张永山 陈伟 姚金波 赵兰杰 房圣涛 吕有军 王俊宜 袁黎 于 2018-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种棉花种子剥皮加倍的种植方法。本发明将棉花种子剥皮后进行秋水仙素处理,然后利用组培方法播种于培养基上,待植株根系长大后,移植到营养土内种植。剥掉种皮,可以剔除部分不成熟的种子,而且棉花处理秋水仙素时排除种皮的影响,处理时间一致,长势一致性也比带种皮要好。培养基育苗在棉苗较弱时进行一定的保护,待渡过易损期后真叶长出,再移栽到营养土内,棉苗对外界有一定的抵抗力,提高苗的存活率进而提高诱变率。另外,培养基的通透性,可以观察到根系的生长情况。本发明对于棉花多倍体育种有重要意义。(The invention discloses a planting method for peeling and doubling cotton seeds. The invention peels the cotton seeds, carries out colchicine treatment, then seeds on a culture medium by a tissue culture method, and transplants the cotton seeds into nutrient soil for planting after the root systems of the plants grow up. The seed coat is peeled off, partial immature seeds can be removed, the influence of the seed coat is eliminated when the cotton is used for treating colchicine, the treatment time is consistent, and the growth consistency is better than that of the seed-carrying seed coat. The culture medium is used for raising seedlings, certain protection is carried out when cotton seedlings are weak, true leaves grow out after the cotton seedlings are worn out, the true leaves are transplanted into nutrient soil, the cotton seedlings have certain resistance to the outside, the survival rate of the cotton seedlings is improved, and the mutagenesis rate is further improved. In addition, the permeability of the medium allows the observation of the growth of the root system. The invention has important significance for cotton polyploid breeding.)

棉花种子剥皮加倍的种植方法

技术领域

本发明涉及一种棉花种子剥皮加倍的种植方法。

背景技术

棉花加倍工作研究很少，80年代，华中农学院黄冈分院棉麦教研组用不同浓度的秋水仙碱水溶液采用不同的处理时间浸泡随县中棉(Zn＝26)种子然后取出播种。变异苗出土后，子叶折叠，不易平展，子叶下轴不出土，子叶下轴至胚根处肿大，根尖常为黄褐色，生长长期停滞，抗逆性弱，遇低温阴雨骤晴，极易感病死亡。变异苗的生长速度更远远落后于对照和经过处理的正常苗。

在棉花种子加倍工作中，将棉花种子直接进行秋水仙素处理，清洗后播种于营养土内，但是经秋水仙素处理的棉苗由于出土慢，子叶容易受损腐烂，严重影响了棉苗的正常生长。另外，种子处理时需要带种皮处理，这样秋水仙素需要浸透种皮后才能作用到种子生长点，对处理时间和处理效果有较大影响，如果剥掉种皮处理，播种于营养土内就会腐烂死掉。

发明内容

本发明的目的是提供一种棉花种子剥皮加倍的种植方法。

本发明提供了一种棉花染色体加倍方法，包括如下步骤：

(1)将棉花种子剥皮后采用诱变剂处理；所述诱变剂中含有秋水仙碱。

(2)将步骤(1)处理后的种子接种于育苗培养基培养；

所述育苗培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在育苗培养基中的浓度为：硝酸钾0.90-1.0g/L，硝酸铵0.80-0.90g/L，磷酸二氢钾0.080-0.090g/L，硫酸镁为0.180-0.190g/L，氯化钙为0.20-0.30g/L，葡萄糖10-20g/L，植物凝胶2.0-3.0mg/L；所述溶剂为水。

所述溶质及其在育苗培养基中的浓度具体可为：硝酸钾0.95g/L，硝酸铵0.85g/L，磷酸二氢钾0.085g/L，硫酸镁为0.185g/L，氯化钙为0.22g/L，葡萄糖15g/L，植物凝胶2.5mg/L。

所述育苗培养基的pH为6.5。

所述诱变剂中含有1.6-1.8g/L的秋水仙碱。

所述诱变剂中具体可含有1.5g/L的秋水仙碱。

所述诱变剂具体可为含有1.5g/L秋水仙碱的水溶液。

所述处理时间为16-18h。

所述处理时间具体可为16h。

所述步骤(1)中，棉花种子剥皮后先进行灭菌再使用诱变剂处理。

所述灭菌方法具体可为：采用千分之一升汞灭菌8-10min。

所述步骤(2)中，培养条件为28℃暗培养。

所述步骤(2)后还包括步骤(3)：待种子发芽长1cm时进行扶苗，扶苗后28℃暗培养2-3天，然后更改培养条件继续培养20-40天；更改后的培养条件为28℃、光培养16h/暗培养8h，光照强度为2000Lx。

以上任一所述所述步骤(1)、(2)和(3)均在无菌条件下操作。

所述步骤(3)后还包括步骤(4)：完成步骤(3)后，将幼苗移栽至营养土内并进行保湿处理；移栽前将幼苗在含有5mg/L NAA的水溶液中蘸根。移栽后在周围罩上保鲜膜保湿，一周后去掉。

所述步骤(4)后还包括步骤(5)：取长到10片左右真叶的幼苗，经过流式细胞检测，筛选染色体倍数加倍的幼苗。

本发明还保护以上任一所述的方法在多倍体棉花选育中的应用。

本发明还保护以上任一所述的育苗培养基在多倍体棉花选育中的应用。

以上任一所述棉花具体可为通农1号棉花。

本发明对种子加倍及种植方法进行改进，将棉花种子剥皮后进行秋水仙素处理，然后利用组培方法播种于培养基上，待植株根系长大后，移植到营养土内种植。首先剥离种皮，解决了种子在进行药物处理时种皮产生的隔离影响，使药物直接接触种子生长点，不仅可明确药物作用时间，提高药物的作用效果，也确保每个种子接受处理时间一致。另外，剥掉种皮后，种子播种于营养土内就会腐烂死掉，培养基内生长无致病菌，能很好解决这个问题。其次棉花种子经药物处理后，生长缓慢，下胚轴缩短，导致种子土内生长产生子叶受损问题，严重影响植株的生长，通过培养基种苗，给植株生长提供稳定的环境，利于棉苗的生长。另外，由于培养基的透明性，可很好的观察到种子接受处理后每个植株根部的生长情况，对处理浓度和时间的筛选提供重要的判断依据。本发明对于棉花多倍体育种有重要意义。

附图说明

图1为实施例1棉花种子剥皮加倍及种植方法中各阶段种植方法示意图。

图2为实施例1对照方法一中种子发芽长势情况。

图3为实施例1对照方法二中种子发芽腐烂情况。

图4为实施例1对照方法三中子叶生长和受损情况。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中采用的棉花为通农1号，参考文献：周忠丽.我国保存亚洲棉的遗传多样性研究[D].中国农业科学院,2011.公众可以从中国农业科学院棉花研究所获得。

育苗培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在育苗培养基中的浓度为：硝酸钾0.95g/L，硝酸铵0.85g/L，磷酸二氢钾0.085g/L，硫酸镁为0.185g/L，氯化钙为0.22g/L，葡萄糖15g/L，植物凝胶Phytagel(Sigma)2.5mg/L，pH 6.5。

实施例1、棉花种子剥皮组培加倍及种植方法

一、棉花种子剥皮加倍及种植方法

1、将棉花种子200粒用剪刀先在种皮剪一小口，然后沿小口将种皮剥掉。

2、将步骤1剥掉种皮的种子在超净工作台内，用千分之一升汞灭菌8-10min后，灭菌水冲洗3遍，转入提前灭菌的0.15％(质量百分含量)秋水仙素水溶液内，放入培养箱，24℃暗培养16小时。

3、完成步骤2后，在超净工作台内将种子取出，用灭菌水冲洗3遍，最后在灭菌水内浸泡30分钟，然后将种子放到无菌滤纸上吸出水分，转移到装有已灭菌的育苗培养基的广口瓶中，瓶口采用灭菌牛皮纸包封(图1A)，28℃暗培养2-3天。

4、完成步骤3后，种子发芽长1cm左右时(图1B)，在无菌的环境下进行扶苗。用镊子轻轻的夹住种子，将种子的根部***育苗培养基内(图1C)，继续28℃暗培养2-3天。

5、完成步骤4后，将培养条件改为28℃、光培养16h/暗培养8h，光照强度为2000Lx,培养20天-40天，或待棉苗叶片触及瓶盖(图1D)。

6、完成步骤5后，将无菌苗广口瓶上的牛皮纸逐渐打开，放苗2-3天，然后将苗子从培养基内拿出，用清水冲洗掉培养基，转移到装有清水三角瓶内练苗1-2天(每天换清水)，最后将苗子用浓度为5mg/L的NAA水溶液中蘸根后移栽到营养土内(图1E)，移栽后在周围罩上保鲜膜保湿(图1F)，一周后去掉。

7、从种苗开始两个月统计成苗率。

8、取步骤6得到的长到10片左右真叶的幼苗，取1cm²面积大小的叶片加入400μl裂解液切碎，放置5分钟，过滤到试管内，加入1.4ml的染液后置于冰盒上，上机进行流式细胞测定，当Gain值设定为370时，普通通农1号出现的峰值在90左右，加倍的通农1号峰值在170左右。检测结果在170左右有峰，即表明棉花染色体倍数已经加倍，鉴定为诱变苗。

经统计，本方法获得的成苗数为182，成苗率为91％，诱变苗数为23，加倍率为11.5％，在棉苗较弱时进行一定的保护，待渡过易损期后真叶长出，再移栽到营养土内，棉苗对外界有一定的抵抗力，大大提高苗的存活率。

二、对照方法一

取200粒不剥掉种皮的棉花种子替代剥掉种皮的种子，按照步骤一的1-8进行操作。发芽情况见图2，种子带种皮直接进行秋水仙素处理后，发芽情况不一致。经统计，本方法获得的成苗数为183，成苗率为91.5％，与步骤一的方法无显著差异，但本方法诱变苗数为19，加倍率为9.5％，加倍率较步骤一的方法降低，表明种皮在种子浸泡处理过程中对浸泡效果有一定的影响。

三、对照方法二

1、将棉花种子200粒用剪刀先在种皮剪一小口，然后沿小口将种皮剥掉。

2、将步骤1剥掉种皮的种子浸泡于0.15％(质量百分含量)秋水仙素水溶液内，放入培养箱，24℃暗培养16小时。

3、完成步骤2后，将种子取出，用清水冲洗3遍后直接播种于营养土内，培养条件为28℃、光培养16h/暗培养8h，光照强度为2000Lx。

4、从种苗开始两个月统计成苗率。

图3为种子剥掉种皮直接种到营养土内3天后生长情况，种子大部分腐烂死亡。

经统计，剥掉种皮的种子经秋水仙素处理后在营养土内腐烂，无正常存活的苗。

四、对照方法三

1、取200粒不剥掉种皮的棉花种子浸泡于0.15％(质量百分含量)秋水仙素水溶液内，放入培养箱，24℃暗培养16小时。

2、完成步骤1后，将种子取出，用清水冲洗3遍后直接播种于营养土内，培养条件为28℃、光培养16h/暗培养8h，光照强度为2000Lx。

3、从种苗开始两个月统计成苗率。

4、取步骤2得到的长到10片左右真叶的幼苗，取1cm²面积大小的叶片加入400μl裂解液切碎，放置5分钟，过滤到试管内，加入1.4ml的染液后置于冰盒上，上机进行流式细胞测定，当Gain值设定为370时，普通通农1号出现的峰值在90左右，加倍的通农1号峰值在170左右。检测结果在170左右有峰，即表明棉花染色体倍数已经加倍，鉴定为诱变苗。

部份受秋水仙素抑制的棉苗在出土过程中受损腐烂死亡，或者因为生长缓慢，后期管理过程中不能正常生长(图4)，经统计，本方法获得成苗153棵，成苗率为76.5％，诱变苗为15棵，加倍率为7.5％。

综上所述，棉花种子剥皮加倍及种植方法成苗率和诱变率最高，剥掉种皮，可以剔除部分不成熟的种子，而且棉花处理秋水仙素时排除种皮的影响，处理时间一致，长势一致性也比带种皮要好。培养基育苗在棉苗较弱时进行一定的保护，待渡过易损期后真叶长出，再移栽到营养土内，棉苗对外界有一定的抵抗力，提高苗的存活率进而提高诱变率。另外，培养基的通透性，可以观察到根系的生长情况。