一种四倍体头花蓼的培育方法
阅读说明：本技术 一种四倍体头花蓼的培育方法 (Method for cultivating tetraploid polygonum capitatum ) 是由 刘世会 赵德刚 于 2019-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种四倍体头花蓼的培育方法,该方法包括以下步骤：a)将二倍体头花蓼种子进行处理,然后接种于培养基中进行培养,得到头花蓼茎尖作为诱导材料；b)采用秋水仙素溶液对步骤a)中得到的头花蓼茎尖进行诱导；c)将步骤b)中得到的头花蓼茎尖移到芽增殖培养基中进行诱导,以诱导头花蓼芽增殖,得到头花蓼增殖芽；d)对步骤c)中得到的头花蓼增殖芽进行鉴定,得到四倍体头花蓼增殖芽；e)对步骤d)中得到的四倍体头花蓼增殖芽进行组织培养,以使四倍体头花蓼快速繁殖,得到四倍体头花蓼秧苗。本发明提供的培育方法能够减少育种过程中的倍性鉴定工作量,提高鉴定速度,缩短育种时间,从而为农业生产提供大量优良种苗。(The invention provides a method for cultivating tetraploid polygonum capitatum, which comprises the following steps: a) treating diploid polygonum capitatum seeds, and then inoculating the diploid polygonum capitatum seeds into a culture medium for culturing to obtain polygonum capitatum stem tips as an induction material; b) inducing the polygonum capitatum stem tip obtained in the step a) by using colchicine solution; c) transferring the stem tip of the polygonum capitatum obtained in the step b) into a bud proliferation culture medium for induction so as to induce the polygonum capitatum bud to proliferate and obtain the polygonum capitatum proliferation bud; d) identifying the polygonum capitatum proliferated bud obtained in the step c) to obtain a tetraploid polygonum capitatum proliferated bud; e) performing tissue culture on the tetraploid polygonum capitatum proliferated bud obtained in the step d) to rapidly propagate the tetraploid polygonum capitatum, so as to obtain tetraploid polygonum capitatum seedlings. The cultivation method provided by the invention can reduce the ploidy identification workload in the breeding process, improve the identification speed and shorten the breeding time, thereby providing a large amount of excellent seedlings for agricultural production.)
技术领域
本发明属于农业植物品种培育领域。具体地，本发明涉及一种四倍体头花蓼的培育方法。
背景技术
头花蓼(学名：Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don)是蓼科，蓼属多年生草本植物，是中医传统中药材。头花蓼全草具有清热解毒、利尿通淋、活血止痛的功效。由头花蓼组成的热淋清颗粒收载于《中国药典》2015年版，药典标准中以没食子酸含量作为含量测定标准。此外，头花蓼在铜矿区是生长旺盛的优势草本植物，在生态系统复原中可起到很好的修复作用。同时，头花蓼还是一种很好的观赏植物，成片生长具有良好的景观效应。目前头花蓼野生资源逐渐减少，头花蓼的市场需求很大，培育高产优质的头花蓼品种对于头花蓼产业链的发展意义重大。
植物多倍体育种已经广泛应用于生产与育种研究中。植物多倍化后，比二倍体亲本拥有更高的杂合性和更迅速的环境适应力。研究结果证明，四倍体头花蓼的农艺性状、生理生化指标、有效成分含量均高于二倍体生头花蓼。另有研究证明，四倍体头花蓼叶绿素含量、抗旱性与抗热性均高于二倍体头花蓼。植物多倍体育种的一个关键环节是倍性的鉴定，然而，目前的多倍体育种方法的鉴定工作量较大，鉴定速度较慢，导致育种时间较长，不能为农业生产提供大量优良种苗。
因此，如何提高植物多倍体育种的鉴定速度，缩短育种时间，从而为农业生产提供大量优良种苗成为本领域亟待解决的课题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种四倍体头花蓼的培育方法，该方法能够减少育种过程中的倍性鉴定工作量，提高鉴定速度，缩短育种时间，从而为农业生产提供大量优良种苗。
为达到上述目的，本发明提供一种四倍体头花蓼的培育方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二倍体头花蓼种子进行处理，然后接种于培养基中进行培养，得到头花蓼茎尖作为诱导材料；
b)采用秋水仙素溶液对步骤a)中得到的头花蓼茎尖进行诱导；
c)将步骤b)中得到的诱导后的头花蓼茎尖移到芽增殖培养基中进行诱导，以诱导头花蓼芽增殖，得到头花蓼增殖芽；
d)对步骤c)中得到的头花蓼增殖芽进行鉴定，得到四倍体头花蓼增殖芽；
e)对步骤d)中得到的四倍体头花蓼增殖芽进行组织培养，以使四倍体头花蓼快速繁殖，得到四倍体头花蓼植株秧苗。
在一些实施方案中，步骤a)包括：将二倍体头花蓼种子进行熏蒸，随后进行无菌消毒处理，然后接种于培养基中进行培养，在无菌条件下切取头花蓼茎尖，得到无菌头花蓼茎尖作为诱导材料。
在一些实施方案中，步骤a)包括：将二倍体头花蓼种子进行熏蒸，随后采用酒精溶液进行表面处理，再用HgC12溶液进行消毒，用无菌水冲洗，然后接种于培养基中，放置于光照培养室中进行培养，在无菌条件下切取头花蓼茎尖，得到无菌头花蓼茎尖作为诱导材料；
优选地，步骤a)包括：采用浓HCl和NaClO的混合溶液将二倍体头花蓼种子熏蒸6-48h，优选6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h，更优选24h；随后采用酒精溶液进行表面处理5-30s，优选5s、10s、15s、20s、25s、30s，更优选10s，再用HgC12溶液消毒1-9min，优选1min、3min、5min、7min、9min，更优选3min，用无菌水冲洗1-7次，优选1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次，更优选5次，然后接种于培养基中，放置于光照培养室中培养15-40天，优选15、20、25、30、35、40天，更优选25天，在无菌条件下切取头花蓼茎尖，得到无菌头花蓼茎尖作为诱导材料。
在一些实施方案中，步骤a)中的浓HCl和NaClO的混合溶液中的NaClO的含量为4.8-6.0％w/v，优选4.8％w/v、5.0％w/v、5.2％w/v、5.4％w/v、5.6％w/v、5.8％w/v、6.0％w/v，更优选5.2％w/v；
优选地，步骤a)中的酒精溶液的浓度为70-75％v/v，优选70％v/v、75％v/v，更优选75％v/v；
优选地，步骤a)中的HgC12溶液的浓度为0.1-0.2％w/v，优选0.1％w/v、0.15％w/v、0.2％w/v，更优选0.1％w/v；
优选地，步骤a)中的光照培养室的温度设定为23-25℃，优选23℃、24℃、25℃，更优选25℃；光照强度设定为2000-3000lx，优选2000lx、2500lx、3000lx，更优选2000lx；
优选地，步骤a)中的培养基为MS无激素固体培养基。
在一些实施方案中，步骤b)包括：将步骤a)中得到的头花蓼茎尖放在秋水仙素溶液中，在无菌条件下进行遮光浸泡诱导；
优选地，步骤b)包括：将步骤a)中得到的头花蓼茎尖放在秋水仙素溶液中，在无菌条件下遮光浸泡诱导12-36h，优选12h、18h、24h、30h、36h，更优选24h；
优选地，步骤b)中的秋水仙素溶液的浓度为0.1-0.9％w/v，优选0.1％w/v、0.3％w/v、0.5％w/v、0.7％w/v、0.9％w/v，更优选0.5％w/v；
优选地，步骤b)中的秋水仙素溶液采用无菌冷水在无菌条件下配制，即配即用。
在一些实施方案中，步骤c)中的芽增殖培养基包含MS粉、蔗糖、甘氨酸、植物凝胶、6-BA和NAA；并且该芽增殖培养基的pH值为5.8；
优选地，步骤c)中的芽增殖培养基中，MS粉的浓度为4.43g/L，蔗糖的浓度为30g/L，甘氨酸的浓度为2.0mg/L，植物凝胶的浓度为4g/L，6-BA的浓度为2.0mg/L，NAA的浓度为0.1mg/L；
优选地，步骤c)在无菌条件下进行；
优选地，步骤c)中的诱导头花蓼芽增殖时间为30天，15天换一次培养基。
在一些实施方案中，步骤d)包括：通过形态学和流式细胞仪鉴定方法对步骤c)中得到的头花蓼增殖芽进行鉴定，得到四倍体头花蓼增殖芽；
优选地，步骤d)包括：首先通过形态学鉴定方法对步骤c)中得到的头花蓼增殖芽进行鉴定，得到初选多倍体头花蓼增殖芽；随后采用流式细胞仪对初选多倍体头花蓼增殖芽进行鉴定，得到四倍体头花蓼增殖芽。
在一些实施方案中，步骤d)中的形态学鉴定方法包括鉴定头花蓼增殖芽的叶片大小、形状和厚度；
优选地，步骤d)中的流式细胞仪鉴定方法包括采用流式细胞仪鉴定初选多倍体头花蓼增殖芽的DNA含量。
在一些实施方案中，步骤d)中的形态学鉴定方法具体包括观察头花蓼增殖芽的叶片大小、形状和厚度，如果与对照二倍体头花蓼增殖芽相比，头花蓼增殖芽的叶片变大、叶片出现褶皱、叶片边缘呈锯齿状、叶片厚度增加，则将该头花蓼增殖芽鉴定为初选多倍体头花蓼增殖芽；
优选地，步骤d)中的流式细胞仪鉴定方法具体包括采用流式细胞仪鉴定初选多倍体头花蓼增殖芽的DNA含量，如果初选多倍体头花蓼增殖芽的DNA含量是对照二倍体头花蓼增殖芽的2倍，则将该初选多倍体头花蓼增殖芽鉴定为四倍体头花蓼增殖芽。
在一些实施方案中，步骤e)包括：采用植物组织培养方法在无菌条件下对步骤d)中得到的四倍体头花蓼增殖芽进行组织培养，以使四倍体头花蓼快速繁殖，得到四倍体头花蓼植株秧苗；
优选地，步骤e)中的植物组织培养方法中使用的培养基包括芽增殖培养基和生根培养基；
优选地，步骤e)中使用的芽增殖培养基包含MS粉、蔗糖、甘氨酸、植物凝胶、6-BA和NAA；并且该芽增殖培养基的pH值为5.8；
优选地，步骤e)中使用的芽增殖培养基中，MS粉的浓度为4.43g/L，蔗糖的浓度为30g/L，甘氨酸的浓度为2.0mg/L，植物凝胶的浓度为4g/L，6-BA的浓度为2.0mg/L，NAA的浓度为0.1mg/L；
优选地，步骤e)中使用的生根培养基包含MS粉、蔗糖、甘氨酸和植物凝胶；并且该生根培养基的pH值为5.8；
优选地，步骤e)中使用的生根培养基中，MS粉的浓度为2.215g/L，蔗糖的浓度为15g/L，甘氨酸的浓度为1.0mg/L，植物凝胶的浓度为4g/L；
优选地，所述培育方法进一步包括：步骤f)对步骤e)中得到的四倍体头花蓼植株秧苗进行练苗，然后移栽大田。
本发明采用头花蓼茎尖作为诱导材料，利用植物组织培养技术和秋水仙素诱导结合，经形态学和流式细胞仪鉴定，培育出四倍体头花蓼。采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼可为头花蓼优良品种培育提供种质资源，快速繁殖大量优质种苗，从而为头花蓼产业链的发展提供优质原料。
与现有技术相比，本发明提供的四倍体头花蓼的培育方法具有以下优势：
1.本发明利用植物组织培养和秋水仙素诱导结合，经形态学和流式细胞仪鉴定，建立了快速培育四倍体头花蓼的培育方法，极大地减少了育种过程中的倍性鉴定工作量，提高了鉴定速度，从而缩短了育种时间(从种子处理开始到移栽大田仅需约150天)，为农业生产提供了大量优良种苗。
2.目前常用的鉴定头花蓼倍性的方法(例如，去壁低渗火焰法检测染色体数目)需要约55h才能完成一个流程，而本发明采用形态学和流式细胞仪结合来鉴定头花蓼倍性，仅需约10min就能完成一个流程，极大地缩短了鉴定时间；另外，采用本发明的方法得到的21％的变异株为纯合四倍体头花蓼，而采用现有培育方法得到的变异株均为嵌合体，需进一步分离、鉴定得到四倍体头花蓼，相对于现有培育方法，本发明的培育方法的鉴定工作量明显减少。
3.采用现有的育种方法培育的头花蓼存在品质退化、抗病性差、产量和质量下降等问题，而采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼的抗病性较好、产量和质量均提高，从而为头花蓼优良品种培育提供了种质资源，并为头花蓼产业链的发展提供了优质原料。
4.与二倍体头花蓼相比，采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼的叶、花、根、茎均明显增大；生态适应性和抗逆性生理生化指标显著提高；生物量、槲皮素含量和没食子酸含量均显著增加。
5.除了鉴定步骤外，本发明提供的四倍体头花蓼的培育方法的各个步骤均在无菌条件下进行，有利于鉴定为四倍体的头花蓼用植物组织培养方式快速繁殖，且不受时间季节限制。
6.本发明的培育方法直接选用头花蓼茎尖作为诱导材料，有利于通过芽增殖方式得到更多的诱导变异体。
7.本发明的培育方法通过采用秋水仙素溶液遮光浸泡诱导四倍体产生，诱导率较高(高达12％)且诱导时间较短。
8.本发明培育方法中的流式细胞仪鉴定步骤中使用的细胞核裂解液和染色液无需特别配制溶液(可直接使用流式细胞仪厂家提供的配套产品)，即可得到良好的鉴定效果，减少了鉴定时间和人力消耗。
附图说明
图1示出了采用本发明的方法培育的初选多倍体头花蓼增殖芽(B)与对照二倍体头花蓼增殖芽(A)的流式细胞仪测试图比较；
图2示出了采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼(右侧)和对照二倍体头花蓼(左侧)移栽大田1个月后的秧苗枝条比较；
图3示出了采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼(左侧)与对照二倍体头花蓼(右侧)的叶片(A)、花(B)及枝条(C)比较；
图4示出了采用本发明方法培育的四倍体头花蓼植株(B)与对照二倍体头花蓼植株(A)的气孔及保卫细胞对比图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药剂原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
仪器
流式细胞仪(德国Partec，CyFlow Cube 8)
显微镜(LeicaDM500，德国徕卡股份有限公司)
电子秤(H2，凯丰)
高效液相色谱仪(Agilent HPLC1260，安捷伦科技有限公司)
紫外可见分光光度计(Specord 210 Plus，德国SPECORD)
便携式光合仪(LI-6400XT，美国LI-COR公司)
材料
二倍体头花蓼种子(贵州省兴义市野生头花蓼种子)
细胞核裂解液(德国Partec)
染色液(德国Partec)
MS无激素固体培养基(青岛日水生物技术有限公司)
实施例
实施例1四倍体头花蓼的培育
获得诱导材料头花蓼茎尖
采用浓HCl和NaClO的混合溶液(NaClO的含量为5.2％w/v)将100粒二倍体头花蓼种子熏蒸24h；随后采用75％v/v的酒精溶液进行表面处理10s，再用0.1％w/v的HgC12溶液消毒3min，用无菌水冲洗5次，然后接种于MS无激素固体培养基中，放置于光照培养室(温度设定为25℃，光照强度设定为2000lx)中培养25天，在无菌条件下切取头花蓼茎尖，得到95个无菌头花蓼茎尖作为诱导材料。
头花蓼多倍体诱导
称取1g秋水仙素，用无菌冷水在无菌条件下配制200mL秋水仙素溶液，秋水仙素溶液的浓度为0.5％w/v，即配即用；将上述得到的95个无菌头花蓼茎尖放在0.5％w/v秋水仙素溶液中，在无菌条件下遮光浸泡诱导24h，以对头花蓼茎尖进行诱导。
诱导芽增殖
将诱导后的花蓼茎尖移到芽增殖培养基中进行诱导，以诱导头花蓼芽增殖，得到头花蓼增殖芽。芽增殖培养基包含MS粉(4.43g/L)、蔗糖(30g/L)、甘氨酸(2.0mg/L)、植物凝胶(4g/L)、6-BA(2.0mg/L)和NAA(0.1mg/L)，pH值为5.8。诱导芽增殖时间为30天，15天换一次培养基，获得570个头花蓼增殖芽。
四倍体头花蓼增殖芽鉴定
首先通过形态学鉴定方法对上述得到的570个头花蓼增殖芽进行鉴定，得到324个初选多倍体头花蓼增殖芽；随后采用流式细胞仪对初选多倍体头花蓼增殖芽进行鉴定，最终得到68个四倍体头花蓼增殖芽。整个鉴定过程需要1天。鉴定过程中采用的鉴定方法如下：
1.形态学鉴定方法：采用同样的方法(与上述方法相同，只是缺少多倍体诱导步骤)制备二倍体头花蓼植株作为对照，用肉眼观察头花蓼植株的叶片大小、形状和厚度，如果与对照二倍体头花蓼增殖芽相比，头花蓼增殖芽的叶片变大、叶片出现褶皱、叶片边缘呈锯齿状、叶片厚度增加，则将该头花蓼增殖芽鉴定为初选多倍体头花蓼增殖芽。
2.流式细胞仪鉴定方法：采用流式细胞仪鉴定初选多倍体头花蓼增殖芽的DNA含量，如果初选多倍体头花蓼增殖芽的DNA含量是对照二倍体头花蓼增殖芽的2倍，则将该初选多倍体头花蓼增殖芽鉴定为四倍体头花蓼增殖芽，具体检测过程如下：取新鲜的初选多倍体头花蓼增殖芽的一片嫩叶35mg(30-40mg均可)放入已加400μl细胞核裂解液的塑料培养皿中，用锋利的刀片将多倍体头花蓼增殖芽的嫩叶快速切碎，使其释放细胞核；在样品提取液中加入1.6ml染色液DAPI，用30μm细胞滤膜(Cell-TricsTM)过滤，然后直接用流式细胞仪对滤液进行检测；采用同样的方法制备二倍体头花蓼嫩叶作为对照。如果初选多倍体头花蓼增殖芽的流式细胞仪测试图中的峰值对应的横坐标为对照二倍体头花蓼增殖芽的峰值对应的横坐标的2倍，则判断该初选多倍体头花蓼增殖芽的DNA含量是对照二倍体头花蓼增殖芽的2倍，即，该初选多倍体头花蓼增殖芽为四倍体头花蓼增殖芽。
图1示出了采用本发明的方法培育的初选多倍体头花蓼增殖芽(B)与对照二倍体头花蓼增殖芽(A)的流式细胞仪测试图比较。从图1中看出，对照二倍体头花蓼增殖芽在横坐标100处有一个很明显的峰，而采用本发明的方法培育的初选多倍体头花蓼增殖芽在横坐标200处有一个很明显的峰，说明采用本发明的方法培育的初选多倍体头花蓼增殖芽的DNA含量是对照二倍体头花蓼增殖芽的2倍，由此判断本发明的初选多倍体头花蓼增殖芽为四倍体头花蓼增殖芽。
四倍体头花蓼的快速繁殖
采用植物组织培养方法对上述得到的1个四倍体头花蓼增殖芽进行培养，以使四倍体头花蓼快速繁殖，得到四倍体头花蓼植株秧苗。植物组织培养方法中使用的培养基包括芽增殖培养基和生根培养基，芽增殖培养基包含MS粉(4.43g/L)、蔗糖(30g/L)、甘氨酸(2.0mg/L)、植物凝胶(4g/L)、6-BA(2.0mg/L)和NAA(0.1mg/L)，pH值为5.8；生根培养基包含MS粉(2.215g/L)、蔗糖(15g/L)、甘氨酸(1.0mg/L)和植物凝胶(4g/L)，pH值为5.8。芽诱导增殖时间为60天，15天换一次培养基，换培养基时有增殖芽的进行继代增殖，1个被鉴定为四倍体头花蓼的芽经60天继代增殖，可获得36个芽。生根培养时间为15天。若经鉴定的68个四倍体头花蓼增殖芽都经组织培养快速繁殖，则可提供大量种苗。若种苗需要量大，增加芽诱导增殖时间即可。
练苗
将上述得到的四倍体头花蓼植株秧苗进行练苗，然后移栽大田。育种时间从种子处理开始到移栽大田仅需约150天。
实施例2四倍体头花蓼的培育
获得诱导材料头花蓼茎尖
采用浓HCl和NaClO的混合溶液(NaClO的含量为4.8％w/v)将100粒二倍体头花蓼种子熏蒸6h；随后采用70％v/v的酒精溶液进行表面处理30s，再用0.15％w/v的HgC12溶液消毒1min，用无菌水冲洗1次，然后接种于MS无激素固体培养基中，放置于光照培养室(温度设定为23℃，光照强度设定为3000lx)中培养40天，在无菌条件下切取头花蓼茎尖，得到95个无菌头花蓼茎尖作为诱导材料。
头花蓼多倍体诱导
称取1g秋水仙素，用无菌冷水在无菌条件下配制1000mL秋水仙素溶液，秋水仙素溶液的浓度为0.1％w/v，即配即用；将上述得到的95个无菌头花蓼茎尖放在0.1％w/v秋水仙素溶液中，在无菌条件下遮光浸泡诱导12h，以对头花蓼茎尖进行诱导。
诱导芽增殖
该步骤与实施例1相同。
四倍体头花蓼增殖芽鉴定
该步骤与实施例1相同。
四倍体头花蓼的快速繁殖
该步骤与实施例1相同。
练苗
该步骤与实施例1相同。
实施例3四倍体头花蓼的培育
获得诱导材料头花蓼茎尖
采用浓HCl和NaClO的混合溶液(NaClO的含量为6.0％w/v)将100粒二倍体头花蓼种子熏蒸48h；随后采用72％v/v的酒精溶液进行表面处理5s，再用0.2％w/v的HgC12溶液消毒9min，用无菌水冲洗7次，然后接种于MS无激素固体培养基中，放置于光照培养室(温度设定为24℃，光照强度设定为2500lx)中培养15天，在无菌条件下切取头花蓼茎尖，得到95个无菌头花蓼茎尖作为诱导材料。
头花蓼多倍体诱导
称取0.9g秋水仙素，用无菌冷水在无菌条件下配制100mL秋水仙素溶液，秋水仙素溶液的浓度为0.9％w/v，即配即用；将上述得到的95个无菌头花蓼茎尖放在0.9％w/v秋水仙素溶液中，在无菌条件下遮光浸泡诱导36h，以对头花蓼茎尖进行诱导。
诱导芽增殖
该步骤与实施例1相同。
四倍体头花蓼增殖芽鉴定
该步骤与实施例1相同。
四倍体头花蓼的快速繁殖
该步骤与实施例1相同。
练苗
该步骤与实施例1相同。
测试例1采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼和二倍体头花蓼的性能比较
采用与本发明实施例1的方法相似的方法(与实施例1方法相同，只是缺少多倍体诱导步骤)制备二倍体头花蓼作为对照，分别观察采用本发明实施例1的方法培育的四倍体头花蓼和对照二倍体头花蓼移栽大田1个月后的秧苗枝条的形态。
图2示出了采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼(右侧)和对照二倍体头花蓼(左侧)移栽大田1个月后的秧苗枝条比较。从图2看出，与对照二倍体头花蓼相比，采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼的茎叶尺寸明显增大，茎更粗壮，繁殖更快。
图3示出了采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼(左侧)与对照二倍体头花蓼(右侧)的叶片(A)、花(B)及枝条(C)比较。从图3中看出，四倍体头花蓼生长健壮、叶片长度与宽度以及叶片面积明显大于对照二倍体头花蓼。对照二倍体头花蓼的叶面平坦光滑、叶片呈淡绿色；而四倍体头花蓼的叶片明显加厚、叶片褶皱、叶片边缘出现锯齿状、叶片表皮毛增多、叶色较深、茎干粗壮、花朵变大等外观特征。采用本发明方法培育的四倍体头花蓼的农艺性状完全符合一般多倍体植株所表现出来的典型性，即叶、花、茎的巨大性。采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼与对照二倍体头花蓼的叶面测量数据参见表1，从表1中看出，四倍体头花蓼的叶面积明显比二倍体头花蓼大，最高者可达1.67倍。
表1采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼与对照二倍体头花蓼的叶面测量数据比较
头花蓼品种
叶长(cm)
叶宽(cm)
叶片长宽比
叶面积(cm<sup>2</sup>)
二倍体头花蓼
5.29±0.47
2.77±0.34
1.91±0.23
5.47±0.13
四倍体头花蓼
6.31±1.21*
3.22±0.23*
1.95±0.17
8.75±0.16**
注：*表示差异显著，**表示差异极显著
测试例2采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼和二倍体头花蓼的生物量及有效成分含量比较
采用与本发明实施例1的方法相似的方法(与实施例1方法相同，只是缺少多倍体诱导步骤)制备二倍体头花蓼作为对照，分别用电子秤和高效液相色谱仪测量采用本发明实施例1方法培育的四倍体头花蓼植株与对照二倍体头花蓼植株的生物量及有效成分含量。
表2示出了采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼和二倍体头花蓼的生物量及有效成分含量比较。从表2中看出，采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼的生物量、槲皮素含量和没食子酸含量均明显高于二倍体头花蓼。
表2采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼和二倍体头花蓼的生物量及有效成分含量比较
头花蓼品种
单株生物量(g)
槲皮素含量％
没食子酸含量％
二倍体头花蓼
134.50±5.24
0.337±0.046
0.206±0.027
四倍体头花蓼
165.50±3.53*
0.483±0.017*
0.419±0.011*
注：*表示差异显著
测试例3采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼和二倍体头花蓼的生理生化指标比较
采用与本发明实施例1的方法相似的方法(与实施例1方法相同，只是缺少多倍体诱导步骤)制备二倍体头花蓼作为对照，用显微镜在相同放大倍数下观察采用本发明实施例1方法培育的四倍体头花蓼植株与对照二倍体头花蓼植株的气孔大小、密度和保卫细胞大小变化，并采用紫外可见分光光度计、便携式光合仪测试两种头花蓼植株的与抗逆性及生态适应性有关的生理生化指标。
图4示出了采用本发明方法培育的四倍体头花蓼植株(B)与对照二倍体头花蓼植株(A)的气孔及保卫细胞对比图。从图4以及表3中看出，与对照二倍体头花蓼植株相比，采用本发明方法培育的四倍体头花蓼植株的气孔数目明显减少、密度显著降低；气孔长度和宽度明显增加；并且保卫细胞的长度与宽度均明显增加，表明采用本发明方法培育的四倍体头花蓼的形态解剖结构特征与二倍体头花蓼相比有明显差异。根据表3可知，与对照二倍体头花蓼植株相比，采用本发明方法培育的四倍体头花蓼植株的过氧化物酶(CAT)、根系活力、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮异构酶(CHI)以及净光合速率均显著增加，超氧化物歧化酶(SOD)也略微增加。上述结果表明采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼的与抗逆性及生态适应性有关的生理生化指标均优于二倍体头花蓼。
表3采用本发明的方法培育的四倍体头花蓼与对照二倍体头花蓼的生理生化指标比较
指标
单位
二倍体头花蓼
四倍体头花蓼
四倍体头花蓼/二倍体头花蓼
过氧化物酶(CAT)
μ/gFW/min
63.47±4.33
87.94±8.65
1.39
超氧化物歧化酶(SOD)
μ/gFW/min
346.43±11.34
360.78±11.92
1.04
根系活力
μg/g·h
59.24±6.18
88.72±5.46
1.50
苯丙氨酸解氨酶(PAL)
μ/gFW/min
0.0875±0.0041
0.1142±0.0082
1.31
查尔酮异构酶(CHI)
μ/gFW/min
0.1056±0.0032
0.1689±0.0054
1.60
气孔长度
μm
18.60±1.25
25.30±1.43
1.36
气孔宽度
μm
7.50±1.45
9.30±1.03
1.24
气孔密度
个/mm<sup>2</sup>
27.60±2.46
11.2±1.73
0.41
保卫细胞的长度
μm
21.30±2.14
31.60±2.57
1.48
保卫细胞的宽度
μm
7.90±1.09
10.80±1.13
1.37
净光合速率
μmol/m<sup>2</sup>·s
8.60±1.17
13.42±1.21
1.56
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。应当理解本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。目的在于以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。