一种快速定点突变创制纯合糯性玉米种质的方法及其应用
阅读说明：本技术 一种快速定点突变创制纯合糯性玉米种质的方法及其应用 (Method for creating homozygous waxy maize germplasm by rapid site-specific mutagenesis and application thereof ) 是由 谢传晓 朱金洁 李丽娜 刘昌林 祁显涛 徐孝洁 黄晶 于 2021-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种快速定点突变创制纯合糯性玉米种质的方法及其应用。属于玉米改良技术领域。本发明提供了单倍体诱导版的糯性玉米改良单倍体诱导系Hi-Edit3与Hi-Edit8；对目标自交系进行单倍体诱导；通过双分子荧光技术在幼胚、成熟籽粒及萌发籽粒的下胚轴水平高效筛选单倍体；单倍体鉴定及靶位点基因型鉴定；单倍体诱导加倍,最终实现两个世代内快速改良获得糯性玉米,具有很高的育种应用价值。(The invention discloses a method for creating homozygous waxy maize germplasm by rapid site-specific mutagenesis and application thereof. Belongs to the technical field of corn improvement. The invention provides haploid induction version waxy corn improved haploid induction lines Hi-Edit3 and Hi-Edit 8; carrying out haploid induction on the target inbred line; efficiently screening haploids on hypocotyl levels of young embryos, mature grains and germinated grains by a bimolecular fluorescence technology; haploid identification and target site genotype identification; haploid is induced to double, finally, the waxy corn is obtained by quickly improving in two generations, and the breeding application value is very high.)
技术领域
本发明涉及玉米改良技术领域，更具体的说是涉及一种快速定点突变创制纯合糯性玉米种质的方法及其应用。
背景技术
玉米是重要的粮食作物，同时在饲料和工业原料等领域具有广泛的应用。玉米淀粉是玉米的重要的加工产物，作为一种绿色的基础性原料，具有很高的应用价值和经济价值，甚至在食品、制药等诸多国民经济领域发挥了不可替代的作用，因此培育和改良糯性玉米具有极其重要的意义。
CRISPR/Cas9这项基因编辑技术是源于细菌或古细菌的规律成簇的间隔短回文重复CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)介导的获得性免疫系统。该系统包括一段人工设计的sgRNA，这段RNA通过碱基互补配对识别靶标DNA序列，引导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA，诱发体内的双链断裂修复机制，进而实现对目标基因位点的编辑。目前CRISPR/Cas9基因编辑技术在动植物等各类领域应用广泛，尤其对于作物遗传改良上具有重大的应用价值。
单倍体育种技术为作物遗传改良提供了新的方法，目前已报道玉米ZmMTL及ZmDMP基因的单倍体材料可以诱导形成单倍体，前期研究表明利用ZmMTL基因突变获得的单倍体诱导率在4.7％～11％之间，ZmMTL与ZmDMP基因同时突变的单倍体诱导率在6.9％～11.5％之间。
优良材料的育种需要快速高效的技术，传统育种技术遗传纯合需要8个世代相比，双单倍体(DH)育种技术只需两代即可获得纯系，具有重要的技术优势与育种实践价值。虽然双单倍体育种技术可缩短育种周期，但无法定向精准改变某一农艺性状；CRISPR/Cas9基因编辑技术实现了精准改良目标性状目的，我们前期通过将携带有靶向基因突变CRISPR-Cas9转基因元件的转基因材料与需要改良的受体材料进行杂交，利用导入的CRISPR-Cas9转基因元件对受体材料靶向基因进行编辑，以完成受体材料靶向性状的改良，然而，该过程需要将在BC2世代通过自交，筛选获得高背景回复、受体转变成糯性种质且不携带转基因元件的亲本
因此，如何提供一种快速定点突变创制糯性玉米种质的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种快速定点突变创制纯合糯性玉米种质的方法及其应用。能够在两个世代内实现任意玉米品种改良为糯性品质。本发明通过前期突变ZmMTL基因并叠加双荧光筛选系统的单倍体诱导系的基础上，进一步叠加能够定点突变ZmWaxy1基因的CRISPR-Cas9转基因元件，实现单倍体诱导介导快速改良玉米糯性性状的育种。同时，创制了玉米ZmMTL及ZmDMP双基因突变纯合体叠加双荧光筛选系统与ZmWaxy1基因编辑CRISPR-Cas9元件的单倍体诱导编辑ZmWaxy1基因株系。将受体材料与单倍体诱导基因编辑系再交，利用ZmMTL或ZmMTL与ZmDMP突变纯合体获得孤雌生殖单倍体，配合双荧光系统筛选单倍体，最终获得改良受体材料的糯性单倍体，利用染色体加倍技术，加倍获得单双倍体自交即可获得目标改良材料。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种快速定点突变创制糯性玉米种质的方法，包括：将mtl突变纯合体且ZmWaxy1基因敲除元件和筛选元件纯合的玉米ZmWaxy1基因编辑单倍体诱导系，或mtl和dmp突变纯合体且ZmWaxy1基因敲除元件和筛选元件纯合的玉米ZmWaxy1基因编辑单倍体诱导系和玉米自交系进行杂交，杂交后代经单倍体筛选与鉴定，获得的单倍体诱导系通过染色体加倍，获得糯性改良的双单倍玉米种质。
优选的：mtl突变纯合体且ZmWaxy1基因敲除元件和筛选元件纯合的玉米ZmWaxy1基因编辑单倍体诱导系的制备包括以下步骤：
(1)将mtl突变纯合株系筛选出转基因阴性材料；
(2)pCPB-ZmESP：eGFP-HvASP：DsRED双荧光表达载体导入受体材料，筛选得到DFP阳性材料；
(3)ZmWaxy1-CRISPR/Cas9编辑载体导入受体材料，筛选ZmWaxy1-C RISPR/Cas9的阳性材料；
(4)将步骤(1)和(2)筛选出的材料杂交获得F1代材料；
(5)将F1代材料荧光筛选，选择胚部表达绿色荧光并且胚乳表达红色荧光的材料和步骤(3)中携带ZmWaxy1-CRISPR/Cas9转基因成分的阳性材料杂交筛选得到诱导系纯系Hi-Edit3。
进一步的：所述加倍采用秋水仙素通过幼胚组培法或者幼苗浸根法加倍。
优选的：mtl和dmp突变纯合体且ZmWaxy1基因敲除元件和筛选元件纯合的玉米ZmWaxy1基因编辑单倍体诱导系的制备包括以下步骤：
步骤A：将所述DFP阳性材料和ZmMTL/ZmDMP双基因突变体材料杂交获得F1代材料；
步骤B：将F1代材料荧光筛选，选择胚部表达绿色荧光并且胚乳表达红色荧光的材料与携带ZmWaxy1-CRISPR/Cas9转基因成分的阳性材料杂交筛选得到诱导系纯系Hi-Edit8。
优选的：步骤(1)所述筛选通过BAR试纸条进行。
优选的：步骤(2)所述受体材料为玉米X249。
优选的：所述玉米自交系为B73，159F、159M、4CV或6WC。
优选的：筛选得到诱导系纯系Hi-Edit3的方法包括以下步骤：
1)PCR扩增测序ZmMTL位点，测序筛选突变纯合株系；
2)再通过ddPCR筛选ZmWaxy1-CRISPR/Cas9转基因元件纯系自交；
3)选择自交果穗上荧光不分离的材料即为Hi-Edit3。
优选的：筛选得到诱导系纯系Hi-Edit8的方法包括以下步骤：
1)PCR扩增测序ZmMTL和ZmDMP位点筛选双位点突变纯合株系；
2)再通过ddPCR筛选ZmWaxy1-CRISPR/Cas9转基因元件纯系自交；
3)选择自交果穗上荧光不分离的材料即为Hi-Edit8。
优选的：鉴定包括幼胚水平、成熟籽粒和萌发幼苗的下胚轴观察的单倍体鉴定方法；
幼胚水平观察的单倍体鉴定方法：用520nm的激发光观察籽粒荧光，排除其他花粉授粉导致的胚乳没有红色荧光的种子，然后剥取幼胚，用488nm的激发光观察胚部的绿色荧光，其中表达绿色荧光的是二倍体，没有绿色荧光的是单倍体；
成熟籽粒观察的单倍体鉴定方法：用520nm的激发光观察籽粒红色荧光，排除其他花粉授粉导致的胚乳没有红色荧光的种子，然后用488nm的激发光观察胚部的绿色荧光，其中表达绿色荧光的是二倍体，没有绿色荧光的是单倍体；
萌发幼苗下胚轴观察的单倍体鉴定方法：取收获后果穗进行脱粒，浸泡过夜后，置于石英砂中进行萌发，取萌发7d种子，用520nm的激发光观察籽粒红色荧光，排除其他花粉授粉导致的胚乳没有红色荧光的种子，然后用488nm的激发光观察下胚轴的绿色荧光，其中表达绿色荧光的是二倍体，没有绿色荧光的是单倍体。
进一步的：在授粉后18d的幼胚、成熟种子及萌动3d后的种子进行红色荧光蛋白及绿色荧光蛋白的筛选。
本发明还提供了上述的方法在培育玉米新品种中的应用。
有益效果在于：通过杂交聚合及分子辅助筛选的方式将单倍体诱导突变基因、单倍体辅助筛选的双分子荧光蛋白和定点编辑ZmWaxy1基因的CRISPR-Cas9元件聚合到一起，确保各位点均为纯合。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种快速定点突变创制纯合糯性玉米种质的方法及其应用，相较于现有技术本发明提供了单倍体诱导版的糯性玉米改良单倍体诱导系Hi-Edit3与Hi-Edit8；对目标自交系进行单倍体诱导；通过双分子荧光技术在幼胚、成熟籽粒及萌发籽粒的下胚轴水平高效筛选单倍体；单倍体鉴定及靶位点基因型鉴定；单倍体诱导加倍，最终实现两个世代内快速改良获得糯性玉米，具有很高的育种应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的靶向ZmMTL基因的基因编辑载体结构示意图。
图2附图为本发明提供的靶向ZmWaxy1基因的基因编辑载体结构示意图。
图3附图为本发明提供的双荧光蛋白表达载体结构示意图。
图4附图为本发明提供的Hi-Edit3诱导系材料的ZmMTL基因型分析结果图。
图5附图为本发明提供的Hi-Edit3诱导系材料的CRISPR-Cas元件的拷贝数鉴定结果图。
图6附图为本发明提供的快速糯性玉米改良单倍体诱导系Hi-Edit3的创制及改良流程图。
图7附图为本发明提供的Hi-Edit8诱导系材料的ZmMTL基因型分析结果图。
图8附图为本发明提供的Hi-Edit8诱导系材料的ZmDMP基因型分析结果图。
图9附图为本发明提供的Hi-Edit8诱导系材料的CRISPR-Cas元件的拷贝数鉴定结果图。
图10附图为本发明提供的快速糯性玉米改良单倍体诱导系Hi-Edit8的创制及改良流程图。
图11附图为本发明提供的双荧光系统在幼胚水平单倍体筛选的示意图。
图12附图为本发明提供的双荧光系统在成熟籽粒水平单倍体筛选的示意图.
图13附图为本发明提供的双荧光系统在下胚轴部位单倍体筛选的示意图。
图14附图为本发明提供的ZmWaxy1位点编辑的单倍体植株基因型分析结果图，其中，DH-1～DH-7为利用Hi-Edit8单倍体诱导系对B73，159F、159M、4CV及6WC材料诱导筛选后获得的单倍体植株。
图15附图为本发明提供的ZmWaxy1位点编辑的单倍体植株倍性鉴定图，其中，Debris-表示细胞碎片、Aggregates-表示细胞聚集体、Dip G1-表示G1期DNA含量、Dip G2-表示G2期DNA含量、Dip S-表示S期DNA含量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种快速定点突变创制纯合糯性玉米种质的方法及其应用。
其中，ZmMTL-CRISPR/Cas9、ZmWaxy1-CRISPR/Cas9基因编辑载体以及双荧光筛选载体的构建和转化：
图1：参考MTL的自然突变位点，利用CRISPR-P2.0在其附近设计ZmMTL的靶标序列gggtcaacgtggagacaggg，利用商业化重组试剂盒(NEB，E2621L)构建pCPB-Ubi：Cas9载体，用重叠PCR的方法将设计好的靶标序列引入到sgRNA表达盒中，再将sgRNA表达盒重组构建到pCPB-Ubi：Cas9载体上，得到ZmMTL-CRISPR/Cas9编辑载体(参见中国农业科学院学位论文：《基因编辑创制玉米母体孤雌生殖单倍体诱导系与高效双荧光蛋白单倍体鉴定体系构建》2018)。
图2：利用CRISPR-P2.0设计筛选ZmWaxy1的靶标序列gaggttcagctccgggtagtcgg，利用商业化重组试剂盒构建pCPB-Ubi：Cas9载体，通过重叠PCR将靶标序列引入到sgRNA表达盒中，再将sgRNA表达盒重组构建到pCPB-Ubi：Cas9载体上，得到ZmWaxy1-CRISPR/Cas9编辑载体(参见安徽农业大学学位论文《玉米RNA聚合酶III识别的启动子活性鉴定与Waxy1基因编辑》2016)。
图3：构建双荧光筛选系统，包括胚特异性启动子表达绿色荧光蛋白以及胚乳特异性启动子表达红色荧光蛋白，利用商业化的重组试剂盒(NEB，E2621L)构建pCPB-ZmESP：eGFP-HvASP：DsRED双荧光表达载体(Double-Fluorescence Proteins，DFP，参见中国农业科学院学位论文：《基因编辑创制玉米母体孤雌生殖单倍体诱导系与高效双荧光蛋白单倍体鉴定体系构建》2018)。
将构建的三个载体送至中种遗传转化平台转化，遗传转化通过常规的农杆菌介导的方法完成，所转化的受体材料均为玉米X249。
实施例1
创制基于mtl突变纯合体且ZmWaxy1-CRISPR/Cas9和DFP转基因元件纯合的玉米ZmWaxy1基因编辑单倍体诱导系，命名为Hi-Edit3
ZmMTL基因被编辑、携带ZmWaxy1-CRISPR/Cas9和DFP载体、但不携带ZmMTL-CRISPR/Cas9载体的玉米单倍体诱导系：
使用草胺磷筛选转化ZmMTL-CRISPR/Cas9的阳性材料，自交得到T1材料，在T1代材料中测序ZmMTL基因筛选突变纯合株系(MTL-F：cggtggctccgcaacaac，MTL-R：ttgggttgatggcagagacg)，获得的mtl纯合突变体基因型如图4所示，然后通过BAR试纸条筛选出缺失元件阴性的材料。使用BAR试纸条分别筛选转化DFP阳性材料以及ZmWaxy1-CRISPR/Cas9的阳性材料，并将DFP转基因阳性株与无ZmMTL-CRISPR/Cas9转基因元件的mtl突变纯合株系杂交获得F1材料。对F1代材料进行荧光筛选，选择胚部表达绿色荧光并且胚乳表达红色荧光的材料。荧光筛选系统需要使用手持式激发光源，可以发生488nm和520nm两种光源，分别观察eGFP和DsRED两种荧光。筛选出的材料再与携带ZmWaxy1-CRISPR/Cas9转基因成分的阳性材料杂交，最终获得能诱导形成单倍体并带有双荧光筛选系统的改良ZmWaxy1的基因编辑诱导系。
为了保证该系统的应用效率，需要获得纯系，即目标材料是无ZmMTL-CRISPR/Cas9转基因元件，ZmMTL位点纯合突变；DFP转基因元件纯合；ZmWaxy1-CRISPR/Cas9转基因元件纯合的材料。
具体的实验操作包括：
1.以能诱导形成单倍体并带有双荧光筛选系统的改良ZmWaxy1的基因编辑诱导系为材料，PCR扩增测序ZmMTL位点，测序筛选突变纯合株系；
检测引物：MTL-F：cggtggctccgcaacaac，MTL-R：ttgggttgatggcagagacg；
扩增体系，使用高保真酶(TOYOBO，KOD-201)：Buffer 5μL，dNTP 5μL，MgSO4 2μL，F引物1.5μL；R引物1.5μL，DNA 1μL，加水补充至50μL；PCR产物送六合华大公司测序；
2.再通过ddPCR筛选ZmWaxy1-CRISPR/Cas9转基因元件纯系，结果如图5所示；
在载体上设计Cas9扩增引物，并在玉米内参基因ADH1上设计扩增引物；
Cas9-F：TATCGAAGTTGGTCATCCGC；Cas9-R：ACCAGAAAGAGCGAGGAAAC；ADH-F：GAATGTGTGTTGGGTTTGCAT；ADH-R：TCCAGCAATCCTTGCACCTT；Cas9探针：FAM-ACCAGAAAGAGCGAGGAAAC-BHQ1；ADH探针：HEX-TGCAGCCTAACCATGCGCAGGGTA-BHQ1。
探针法混合液配置(BIO-RAD，L002053B)：ddPCRMix 11μL；Cas9-F2μL，Cas9-R 2μL，ADH-F 2μL，ADH-R 2μL；Cas9探针0.55μL；ADH探针0.55μL，DNA 1μL；用水补充至22μL；
将微滴发生卡至于托架中，将20ul的反应液加入中间一排的孔中，最下面一排每孔加入70ul探针法微滴生成油，盖上硅胶垫；将此托架放入微滴发生器中，关盖生成微滴。将生成的微滴转移到PCR板中，封膜，放入PCR仪中，PCR程序：95℃10min；94℃30s，61℃60s，40个循环；98℃10min；PCR结束后，放入微滴检测器中读取微滴数。
可通过计算Cas9和ADH1的阳性微滴数量比，判断该材料是否为纯合株系(比值为1)，最优筛选出的单株自交，选择自交果穗上荧光不分离的材料，说明DFP转基因元件纯合，最终筛选到诱导系纯系，并将其命名为Hi-Edit3，如图6所示。
实施例2
创制基于mtl和dmp突变纯合体且ZmWaxy1-CRISPR/Cas9和DFP转基因元件纯合的玉米ZmWaxy1基因编辑单倍体诱导系，命名为Hi-Edit8
Bar试纸条检测带有DFP转基因元件的阳性材料，与ZmMTL和ZmDMP双基因突变体材料(商业化的诱导系H3)杂交，F1后代选择胚部表达绿色荧光并且胚乳表达红色荧光的材料。荧光筛选系统需要使用手持式激发光源，可以发生488nm和520nm两种光源，分别观察eGFP和DsRED两种荧光。筛选出的材料再与携带ZmWaxy1-CRISPR/Cas9转基因成分的阳性材料杂交，最终获得带有双荧光筛选系统的改良ZmWaxy1的改良单倍体诱导系。
为了保证该系统的应用效率，需要获得纯系，即目标材料是ZmMTL和ZmDMP，DFP转基因元件纯合，ZmWaxy1-CRISPR/Cas9转基因元件纯合的材料。
具体的实验操作包括：以带有双荧光筛选系统的改良ZmWaxy1的改良单倍体诱导系为材料，PCR扩增测序ZmMTL和ZmDMP位点(MTL-F：cggtggctccgcaacaac，MTL-R：ttgggttgatggcagagacg；DMP-F：agattagcagttggtggtagaga，DMP-R：catcacctcgtccatctcctt)，筛选双位点突变纯合株系，基因型测序结果如图7及图8所示。再通过ddPCR筛选ZmWaxy1-CRISPR/Cas9转基因元件纯系(具体操作同Hi-Edit3)，结果如图9所示，最后筛选出的单株自交，选择自交果穗上荧光不分离的材料，说明DFP转基因元件纯合，最终筛选到诱导系纯系，并将其命名为Hi-Edit8，如图10所示。
实施例3
利用玉米ZmWaxy1基因编辑单倍体诱导系Hi-Edit8或Hi-Edit3进行玉米自交系B73，159F、159M、4CV及6WC的单倍体诱导及筛选
分别利用所创制的玉米ZmWaxy1基因编辑单倍体诱导系Hi-Edit3和Hi-Edit8进行玉米自交系B73，159F、159M、4CV及6WC进行杂交，收获杂交后代材料，分别在幼胚及成熟籽粒水平进行单倍体筛选与鉴定。
单倍体的鉴定包括幼胚水平、成熟籽粒及萌发幼苗的下胚轴观察(Hi-Edit3和Hi-Edit8筛选方式一样，以下以Hi-Edit3为例)。
幼胚水平的单倍体鉴定方法：取授粉后18d的果穗，果穗消毒后，用520nm的激发光观察籽粒荧光，排除其他花粉授粉导致的胚乳没有红色荧光的种子，然后剥取幼胚，用488nm的激发光观察胚部的绿色荧光，其中表达绿色荧光的是二倍体，没有绿色荧光的是单倍体，如图11所示。
成熟籽粒的单倍体鉴定方法：取收获后成熟果穗，用520nm的激发光观察籽粒红色荧光，排除其他花粉授粉导致的胚乳没有红色荧光的种子，然后用488nm的激发光观察胚部的绿色荧光，其中表达绿色荧光的是二倍体，没有绿色荧光的是单倍体，如图12所示。
萌发幼苗下胚轴观察的单倍体鉴定方法：取收获后果穗进行脱粒，浸泡过夜后，置于石英砂中进行萌发，取萌发7d种子，用520nm的激发光观察籽粒红色荧光，排除其他花粉授粉导致的胚乳没有红色荧光的种子，然后用488nm的激发光观察下胚轴的绿色荧光，其中表达绿色荧光的是二倍体，没有绿色荧光的是单倍体，如图13所示。
实施例4
ZmWaxy1位点改良玉米自交系B73，159F、159M、4CV及6WC单倍体系
单倍体的基因型鉴定：提取DNA，对ZmWaxy1测序分析证明纯合突变材料是被改良的受体材料(ZmWaxy1-F：agcctcaacaacaacccatactt，ZmWaxy1-R：gagatgagctcctcggcgtag)，筛选编辑单倍体基因型测定如图14所示。
被编辑单倍体的倍性鉴定：通过流式细胞分析证明该材料的DNA含量是母本的一半，说明是被诱导的单倍体，如图15所示。
获得的单倍体诱导系通过秋水仙素浸根法加倍，最终可获得糯性性状改良的双单倍体系。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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